專利名稱：云南杜鵑高效再生體系的建立方法
云南杜鵑高效再生體系的建立方法技術領域
本發明屬于杜鵑花生物技術育種領域，具體涉及一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，可用于云南杜鵑基因工程和無性突變系篩選。
背景技術：
云南杜醇(Rhododendron為杜醇花科,杜醇屬灌木或小喬木,主要分布于云南(西、西北、北、東北部)、陜西南部、四川西部、貴州西北、西藏東南部，境外緬甸東北部也有分布。生于山坡雜木林、灌叢、松林、松-櫟林、云杉或冷杉林緣，海撥1600米一 4000 米。
本發明人于2008年開始從云南的中甸、大理、師宗、梁王山引種云南杜鵑至云南省農科院花卉所資源圃(昆明)，發現云南杜鵑是杜鵑花基因工程育種理想的基因表達受體材料，因云南杜鵑植株移栽易于成活，次年即可開花，播種實生苗3年后也可開花，可見云南杜鵑抗逆性強，具有很強的適應性和比較廣的適應范圍。
植物遺傳轉化即轉基因技術是近四十年來發展起來的一項生物技術。利用轉基因技術可以在保持木本植物原有較好遺傳背景的前提下定向改變某些性狀，同時還能大大縮短育種時間，這為克服木本植物傳統育種局限性，加速木本植物遺傳育種進展提供了便利。 目前轉基因技術已成為木本植物遺傳育種的主要研究領域。然而轉基因技術極大的依賴于體外培養物能夠高效穩定再生成完整植株的技術，建立高效穩定的遺傳轉化受體系統是轉基因育種的基礎。而木本植物組織培養和植株再生的難度較大。如缺乏合適的轉化受體材料，難以建立高效穩定的遺傳轉化體系。其次是基因型依賴性較強，轉化效率不高。因此， 系統深入研究影響云南杜鵑植株再生因子、誘導植株再生的方法并獲得再生植株，建立專門針對云南杜鵑的高效穩定的再生體系，具有重要意義，可為云南杜鵑轉基因育種工作提供理論基礎和實驗依據，同時將有效推進杜鵑花生物技術育種進程。云南杜鵑的再生體系研究至今未見報道。發明內容
本發明目的是提供一種專門針對云南杜鵑的高效再生體系的建立方法。
本發明所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，包括以下步驟(1)無菌苗的獲得取側芽飽滿的云南杜鵑半木質化莖段，剪成帶有I 2個側芽的莖段，用洗衣粉水清洗，之后清水漂洗干凈，在無菌條件下依次用質量分數為O. 12%的升汞溶液浸泡15min，質量分數為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，無菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于誘導培養基上誘導側芽萌發，待不定芽長至2 3cm時切下不定芽轉入增殖培養基上培養獲得無菌苗，所述的誘導培養基為MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值為5. 4 ;所述的增殖培養基為WPM + ZT 2 mg/L, pH值為5. 4 ；(2)再生體系的建立①葉片直接再生不定芽將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于葉盤分化培養基A中或葉盤分化培養基B 中，葉盤分化培養基A為WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4，葉盤分化培養基B為WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4 ；或②葉片間接再生不定芽A.將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無菌苗的中上部葉片，切成約O.5cm2 O. 8cm2 的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于愈傷組織誘導培養基中培養，所述的愈傷組織誘導培養基為WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+ 蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ；B.將步驟(2)②A中得到的愈傷組織轉接入愈傷組織分化培養基中誘導不定芽，所述的愈傷組織分化培養基為WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4 ；(3)壯苗培養將步驟(2)①葉片直接再生不定芽培養出的不定芽或將(2)②葉片間接再生不定芽培養出的不定芽分棵切開或切成3-5棵為一叢放入壯苗培養基中培養20 25天，所述的壯苗培養基為=WPM+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ;(4)生根培養將經步驟(3)壯苗培養的苗分棵切開，接種于生根培養基中培養，所述的生根培養基為1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4 ；以上各步驟培養條件均為溫度為23°C士 2°C，光照強度為20001x，光照時間為I 2 h · cT1，各培養基中蔗糖和瓊脂含量的百分數為質量百分數。
步驟(2)①優選的葉盤分化培養基B為WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂 O. 6%，pH 值為 5.4。
步驟(2)②A優選的愈傷組織誘導培養基為WPM+TDZ O. 5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
步驟(4)優選的生根培養為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為 5. 4。
本發明的有益效果是I、本發明首次針對云南杜鵑葉片誘導植株再生進行了系統深入的研究，采用葉片直接誘導或間接誘導植株再生兩條途徑，以及特定的培養基，使葉片直接誘導不定芽的誘導率可達62 73%，每個葉盤上的平均芽數可達6. 93個，葉片愈傷組織的誘導率達62 100%， 愈傷組織疏松、體積大，質量好，愈傷組織分化成不定芽的分化率在70%以上，葉片直接誘導或間接誘導的不定芽的生根率均達69 89%，圖I-圖9也表明，本發明方法所建立的云南杜鵑高效再生體系能使云南杜鵑葉片在葉片直接再生不定芽或葉片間接再生不定芽，不定芽的壯苗培養、生根培養各個環節均生長表現良好，培養的植株健壯、根系發達，表明本發明方法建立了能高頻率產生愈傷組織和不定芽，并能高頻率生根獲得完整植株的云南杜鵑再生體系。表明本發明方法建立云南杜鵑高效再生體系是切實可行和有效的。
2、葉盤和愈傷組織兩種材料是進行目的基因浸染的常用材料，本發明能高效地誘導不定芽和愈傷組織，為云南杜鵑后續的轉基因育種工作，實現高頻轉化提供了良好的再生體系及其建立的方法。


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圖I是云南杜鵑葉盤直接誘導不定芽過程中誘導出的不定芽點。2是云南杜鵑葉盤直接誘導不定芽過程中不定芽點長成不定芽。3是云南杜鵑葉盤間接誘導不定芽過程中誘導出愈傷組織。4是云南杜鵑葉盤間接誘導不定芽過程中愈傷組織增殖。5是云南杜鵑葉盤間接誘導不定芽過程中愈傷組織分化不定芽。6是云南杜鵑葉盤間接誘導不定芽過程中愈傷組織分化的不定芽長大。 7是云南杜鵑壯苗培養的生長表現。8是云南杜鵑生根培養的生長表現。9是云南杜鵑生根培養的生長表現。
具體實施方式
以下各實施例所用的材料及試劑均為市售，各實施例無特殊說明均為常規方法。
本發明提供的一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，具體實施步驟如下I、無菌苗的獲得取側芽飽滿的云南杜鵑半木質化莖段，剪成帶I 2個側芽的小段，洗衣粉水振蕩清洗之后用清水漂洗干凈，無菌條件下消毒，依次用質量分數為O. 12%的升汞溶液浸泡15min， 質量分數為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，其間不斷搖晃，之后無菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于MS + 6-BA (6-芐基腺嘌呤)lmg/L+ NAA (萘乙酸)0·1 1^/1^!1值為5.4 的誘導培養基上誘導側芽萌發，20d后待不定芽長至2 3cm時切下不定芽轉入WPM + ZT 2 mg/L, pH值為5. 4的增殖培養基上獲得無菌苗，用于再生體系建立的材料為28 32天苗齡的無菌苗的中上部葉片。
2、再生體系的建立(I)葉片直接再生不定芽將步驟I中30天苗齡的無菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤葉背面劃“井”字傷口，葉盤背面朝下接種于表I所列的激素組合的各葉盤分化培養基中培養。
權利要求
1.云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于包括以下步驟 (1)無菌苗的獲得 取側芽飽滿的云南杜鵑半木質化莖段，剪成帶有I 2個側芽的莖段，用洗衣粉水清洗之后，清水漂洗干凈，在無菌條件下依次用質量分數為O. 12%的升汞溶液浸泡15min，質量分數為2%的次氯酸鈉溶液浸泡8min，無菌水沖洗3 5次，切去莖段兩頭接種于誘導培養基上誘導側芽萌發，待不定芽長至2 3cm時切下不定芽轉入增殖培養基上培養獲得無菌苗，所述的誘導培養基為MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值為5. 4 ;所述的增殖培養基為WPM + ZT 2 mg/L，pH 值為 5. 4 ； (2)再生體系的建立 ①葉片直接再生不定芽 將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無菌苗的中上部葉片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于葉盤分化培養基A中或葉盤分化培養基B中，葉盤分化培養基A為WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5. 4，葉盤分化培養基B為WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5.4 ； 或②葉片間接再生不定芽 A.將步驟(I)中獲得的28 32天苗齡無菌苗的中上部葉片，切成約O.5cm2 O. 8cm2的葉盤，并在葉盤背面劃傷口，葉盤背面朝下接種于愈傷組織誘導培養基中培養，所述的愈傷組織誘導培養基為WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ； B.將步驟(2)②A中得到的愈傷組織轉接入愈傷組織分化培養基中誘導不定芽，所述的愈傷組織分化培養基為WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為.5.4 ； (3)壯苗培養 將步驟(2)①葉片直接再生不定芽培養出的不定芽或將(2)②葉片間接再生不定芽培養出的不定芽分棵切開或切成3-5棵為一叢放入壯苗培養基中培養20 25天，所述的壯苗培養基為=WPM+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4 ; (4)生根培養 將經步驟(3)壯苗培養的苗分棵切開，接種于生根培養基中培養，所述的生根培養基為:1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4 ； 以上各步驟培養條件均為溫度為23 °C 士 2 °C，光照強度為2000 lx，光照時間12h · cT1，各培養基中蔗糖和瓊脂含量的百分數為質量百分數。
2.根據權利要求I所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(2)①所述的葉盤分化培養基B為WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
3.根據權利要求I或2所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(2)②A所述的愈傷組織誘導培養基為WPM+TDZ 0.5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+ 蔗糖 3%+ 瓊脂 O. 6%，pH 值為 5. 4。
4.根據權利要求I或2所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
5.根據權利要求3所述的云南杜鵑高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養為1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+瓊脂O. 6%，pH值為5. 4。
全文摘要
本發明為一種云南杜鵑高效再生體系的建立方法，屬于植物生物技術育種領域。該方法以云南杜鵑無菌苗的中上部葉片為材料，在WPM培養基的基礎上，主要配有激素TDZ、ZT、2,4-D、NAA、IAA、水解酪蛋白中一種或幾種及適宜的濃度，通過葉片直接再生和間接再生兩條途徑獲得完整植株。本發明首次對云南杜鵑建立了高效再生體系，為云南杜鵑的基因工程育種工作提供了良好的理論基礎和實驗依據，同時將有效推動杜鵑花生物技術育種進程。
文檔編號A01H4/00GK102919125SQ20121045010
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者彭綠春, 解瑋佳, 張藝萍, 瞿素萍, 李世峰, 蘇艷, 宋杰 申請人:云南省農業科學院花卉研究所