專利名稱：一種山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法
技術領域：
本發明涉及一種植物繁殖，即一種山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法。
背景技術：
在現有技術中，山楂海棠komarovii (Sarg. )Rehd.別名薄葉山楂、山蘋果， 是薔薇科蘋果亞屬蘋果屬落葉小喬木，果實含蛋白質、脂肪、糖、灰分％、維生素C、蘋果酸、 核黃素、胡蘿卜素及鈣、磷、鐵等。果實可生食，還可釀酒和制果汁及果醬。樹體矮小，抗寒力強，是蘋果、梨、楸子等最好的矮化砧木。花美麗，氣味清香，果實艷麗、掛果期長，可用做園景樹。
山楂海棠在長白山區數量非常稀少，分布區域十分狹窄，僅在長白縣的馬鹿溝鎮二十三道溝至龍泉鎮一帶有較大的種群面積，其他區域僅有零星分布。被《中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)》定為漸危種，國家二級重點保護植物。被《中國物種紅色名錄》定為易危種(VU)。在《吉林省野生動植物保護管理暫行條例》一文中被定為省級一類重點保護植物。
現實中，山楂海棠野生資源少，扦插、種子等常規方法繁殖消耗野生資源大，生根和發芽困難，移栽成活率低，導致野生資源嚴重受砍伐、采挖等，需要合理方法進行人工繁殖。發明內容
本發明的目的是針對上述不足而提供一種技術可行，繁殖速度快、莖段生根率高、 莖段腋芽萌發生長快的山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法。
本發明的技術解決方案是一種山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法，其步驟如下(O以山楂海棠枝條水培休眠芽嫩莖段作為外植體備用；(2)山楂海棠生根同時莖段腋芽萌發生長的培養基為培養基+6-BA(0. 07 O. 09 mg · L O + IBA (O. 02 O. 04 mg · L O + GA3 (O. 09 O. 13 mg · L O ；培養基中附加瓊脂粉8. 5 8*171，添加蔗糖5.0 g ，調節pH值至5. 5，嫩莖段在光照周期8 h · Cf1、光照強度800 Ix和溫度22±2°C條件下培養；(3)將種苗擴繁后的小植株從培養瓶中取出，栽植到經消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂比=2: 2: I的基質中，控制溫度為20±2 °C，保持12 h · Cf1的自然光照。
外植體是將山楂海棠枝條剪成段后，用塑料袋包好后放入冰柜內低溫休眠，溫度控制在_5 O °C，45 d后取出進行水培促其休眠芽萌發；待休眠芽萌發長至3. 00 cm時， 將休眠芽剪下，去除嫩葉和葉柄，用體積分數70%乙醇涮洗30 S，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗7次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成I葉I段即得。山楂海棠嫩莖段平均生根率達98. 0%以上。
本發明的優點是1、本發明培養基和方法步驟有利于山楂海棠嫩莖段試管內生根同時腋芽萌發生長，生根率高，腋芽萌發生長速度快，可操作性強，從莖段接種到出苗僅用I 種低成本培養基，屬一步成苗方法，可以滿足工廠化育苗的需要。2、按每瓶接種8個莖段， 30天為I個周期，每個莖段在I個培養周期內平均可切割成5段計算，每年有η個周期(山楂海棠每年11個周期)進行擴繁，年生產山楂海棠種苗數為Σ年產試管苗=8 X 5η株，可見其繁殖數量，山楂海棠嫩莖段平均生根率達98. 0%以上。該方法對利用少量的野生資源材料年繁殖出上百萬株的珍稀瀕危植物種苗具有重要社會、經濟和生態意義，解決了種子繁殖發芽率低，常規扦插等繁殖方法利用大量野生資源，造成野生資源砍伐和滅絕等問題。
下面將結合實施例對本發明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施方式
I材料與方法1.1材料及處理10月下旬，采集山楂海棠枝條，并將枝條剪成段(長度為30 cm)后，用塑料袋包好后放入冰柜內低溫休眠，溫度控制在-5 O °C，45 d后取出進行水培促其休眠芽萌發。待休眠芽萌發長至3. 00 cm時，將休眠芽剪下，去除嫩葉和葉柄，用70%乙醇(體積分數)涮洗30 s，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗7次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成I葉I段作為外植體備用。
1.2山楂海棠莖段生根同時腋芽萌發生長、植株快速再生體系建立和煉苗培養基成分和含量:100 mg ^r1KNO3, 225 mg · L-1CaCl2 · 2H20，37. 4 mg · L-1MgSO4 · 7H20， 34. 0 mg · T1KH2PO4,180 mg · L-1KCl，31. 25 mg · T1Ca3(PO4)2 ；4. 64 mg · T1FeSO4 · 7H20, 6. 22 mg · T1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 72 mg · IZ1MnSO4 · 4H20,1. 44 mg · T1ZnSO4 · 7H20,1. 04 mg · L^1H3BO3jO. 042 mg · L-1Na2MO4 · 2H20 ；0. 25 mg · L-1 鹽酸硫胺素(VB1) ,0. 125 mg · L-1 煙酸,0. 125 mg · L—1鹽酸卩比卩多醇(VB6) ,10 mg · L—1肌醇,0. 50 mg · L—1甘氨酸。培養基中附加 6-芐氨基嘌呤 6-BA (O. 01 O. 05 mg .171)、吲哚丁酸 IBA (O. 05 O. 14 mg .171)和赤霉素 GA3 (I. 60 2. 50 mg ·Ι^)，瓊脂粉8. 5 g · L—1，添加蔗糖5. O g · L_\調節pH值至5. 5，嫩莖段在光照周期8 h^cf1、光照強度800 Ix和溫度(22±2) °C條件下培養。為提高山楂海棠嫩莖段生根的速度及生根率和腋芽萌發生長速度，通過均勻設計法設計實驗，選用Uici(IOs) 均勻表，每個處理接種10個嫩莖段，重復3次，篩選山楂海棠莖段生根和腋芽萌發生長的 6_芐氨基嘌呤、IBA和赤霉素最佳濃度配比。莖段培養30 d統計生根率和長度。生根率 =(生根的莖段數/接種的莖段總數)X100%,莖段腋芽長度為I個培養周期過程中，莖段腋芽萌發生長后的長度(不包括原莖段長度)。
待莖段生根和腋芽萌發生長至2. 50 cm，腋芽發出5 6個葉時，在超凈工作臺上打開培養瓶，將腋芽留I葉剪下苗干，并將苗干切割成I葉I段，長度大約為O. 5 Cm的小莖段后，再次將小莖段轉接到莖段生根和腋芽萌發生長培養基中，計算出每個莖段生根和腋芽萌發生長及每瓶的增殖倍數和周期。
當種苗擴繁到一定數量后，且小植株長至I. 50 2. 00 cm時，將小植株從培養瓶中取出，放在高錳酸鉀溶液(濃度為3 mg · L-1)中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經殺毒礬(200倍液)消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂(2: 2: I)的基質中，覆蓋塑料薄膜(透性好)進行保濕保溫，控制溫度為(20±2) °C，保持相對濕度在70%，12 h ^cT1的自然光照，中午溫度升高時經薄膜打開小口進行換氣通風，每天早上噴灑I次清水。
2結果與分析2. I 6-芐氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉素對山楂海棠莖段生根的影響數據(表I)經均勻設計軟件分析處理后可得回歸方程為7=84. 2 + 338^ 一 160為，顯著性水平a = O. 05，復相關系數TP= O. 9373，剩余標準差S= 3. 2900，檢驗值6 = 25. 33 >臨界值Aon7) = 4. 737，回歸方程具有顯著性，6-芐氨基嘌呤和吲哚丁酸對莖段的生根影響具有顯著性，赤霉素對莖段的生根影響不顯著。通過計算6-芐氨基嘌呤和吲哚丁酸對生根的貢獻值和貢獻率可知，U1 = 215，UJU= 39. 2% 'U2 = 199，UjU= 36. 2%，但從貢獻率數值來看，6-芐氨基嘌呤和吲哚丁酸差距不大，說明6-芐氨基嘌呤和吲哚丁酸均在山楂海棠莖段生根起同等不可缺少的重要作用。因6-芐氨基嘌呤與生根率呈正相關，而吲哚丁酸與生根率呈負相關。由此推測，質量濃度高于O. 05 mg .171的6-芐氨基嘌呤，以及吲哚丁酸質量濃度低于O. 05 mg噸―1可能有更高的生根率。為驗證此可能性，又以6-芐氨基嘌呤為 O. 10,0. 09,0. 08,0. 07,0. 06 和 O. 05 mg · Γ1，吲哚丁酸質量濃度為 O. 05,0. 04,0. 03、O.02,0.01和O. 00 mg · Γ1開展6個補充試驗，重復3次。具體操作按I. I和I. 2方法，結果發現，6-芐氨基嘌呤質量濃度為(O. 05 O. 09 mg -Γ1)和吲哚丁酸質量濃度為(O. 02 O.04 mg · Γ1)時，山楂海棠嫩莖段生根率最高，平均生根率達98.0%以上。均高于表I所列10個處理的生根率。
表I山楂海棠嫩莖段生根和腋芽生長激素篩選的Uici(IOs)試驗設計與結果 Tablel U10(103)test design and result of hormone for rooting and axillary bud growing of stems ofMalus komarovii
權利要求
1.一種山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法，其特征在于步驟如下 (1)以山楂海棠枝條水培休眠芽嫩莖段作為外植體備用； (2)山楂海棠生根同時莖段腋芽萌發生長的培養基為培養基+6-BA(0. 07 0. 09mg L 0 + IBA (0. 02 0. 04 mg L :) + GA3 (0. 09 0. 13 mg L :)； 培養基中附加瓊脂粉8. 5 g L'添加蔗糖5.0 g^L—1，調節pH值至5. 5，嫩莖段在光照周期8 h Cf1、光照強度800 Ix和溫度22±2°C條件下培養； (3)將種苗擴繁后的小植株從培養瓶中取出，栽植到經消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂比=2: 2: I的基質中，控制溫度為20±2 °C，保持12 h Cf1的自然光照。
2.按照權利要求I所述的山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法，其特征在于外植體是將山楂海棠枝條剪成段后，用塑料袋包好后放入冰柜內低溫休眠，溫度控制在_5 0°C,45 d后取出進行水培促其休眠芽萌發；待休眠芽萌發長至3. 00 cm時，將休眠芽剪下，去除嫩葉和葉柄，用體積分數70%乙醇涮洗30 s,移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,無菌水沖洗7次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成I葉I段即得。
3.按照權利要求I或2所述的山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法，其特征在于山楂海棠嫩莖段平均生根率達98. 0%以上。
4.按照權利要求I或2所述的山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法，其特征在于小植株成活率92. 8%以上。
全文摘要
本發明涉及一種植物繁殖，即一種山楂海棠嫩莖段試管內一步快速成苗方法。其步驟如下(1)10月下旬，采集山楂海棠枝條，低溫休眠，水培促其休眠芽萌發；處理后切割成1葉1段作為外植體備用；(2)山楂海棠生根同時莖段腋芽萌發生長的培養基為培養基＋6-BA(0.07～0.09mg·L-1)＋IBA(0.02～0.04mg·L-1)＋GA3(0.09～0.13mg·L-1)；本發明有利于山楂海棠嫩莖段試管內生根同時腋芽萌發生長，生根率高，腋芽萌發生長速度快，可操作性強，從莖段接種到出苗僅用1種低成本培養基，屬一步成苗方法，可以滿足工廠化育苗的需要。
文檔編號A01H4/00GK102972292SQ20121050277
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者顧地周, 朱俊義, 姜云天, 郭志欣, 楊麗娟, 梁宇, 陸爽, 潘雨, 張學士 申請人:通化師范學院