專利名稱：一種紅樺組織培養(yǎng)育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)林領(lǐng)域，更具體地涉及一種紅樺組織培養(yǎng)快速育苗方法。
背景技術(shù)：
紅樣(Betula albo-sinensis Burk)是樣木科樣木屬的落葉大喬木，中國(guó)特有種。紅樺廣泛分布于我國(guó)西南、西北和華北的天然林區(qū)，是該地區(qū)主要的森林建群樹種之一，也是一種優(yōu)異的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)樹種。紅樺根系發(fā)達(dá)，林冠下植被繁茂，枯枝落葉多，土壤疏松，截持地表徑流能力強(qiáng)，對(duì)于中山、亞高山地帶水源涵養(yǎng)、水土保持具有重要作用。紅樺木材淡紅褐色，質(zhì)地堅(jiān)硬，紋理致密，色澤均勻，有彈性，可供槍托、飛機(jī)、枕木、火柴桿、家具、樂器、細(xì)木工及軍工用材和特制用材，也是膠合板工業(yè)的重要材料。在高海拔天然林區(qū)，由于天然分布的樹種單一，適應(yīng)人工栽植的針、闊葉樹種較少，在造林時(shí)樹種選擇較為困難。而紅樺不僅具有自然分布海拔較高、生長(zhǎng)穩(wěn)定、抗病蟲害和適應(yīng)性強(qiáng)等特性，而且天然更新能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、遭受破壞后容易自然萌芽恢復(fù)及人工栽植成活率較高。基于此，作為我國(guó)西南、西北和華北天然林區(qū)高海拔區(qū)優(yōu)良的鄉(xiāng)土闊葉造林樹種，紅樺在造林實(shí)踐中表現(xiàn)出非常突出的優(yōu)勢(shì)，可與其它針葉樹種進(jìn)行混交造林，形成生長(zhǎng)穩(wěn)定的針闊混交林，起到優(yōu)化林分結(jié)構(gòu)、提升林分質(zhì)量、防止和減輕森林病蟲害的作用，對(duì)提高森林生態(tài)安全、豐富森林景觀、促進(jìn)林業(yè)增效等具有重要的意義。為此，加快紅樺種苗生產(chǎn)，是依靠紅樺進(jìn)行各項(xiàng)造林工作的基礎(chǔ)工作。目前，紅樺苗木的培育主要還是傳統(tǒng)的種子播種育苗手段，這種方法存在著育苗時(shí)間長(zhǎng)(育苗周期長(zhǎng)達(dá)2年，第3年才能出圃造林)、出苗率低等不足，而且這種方法培育的實(shí)生苗因?yàn)椴牧匣虻亩鄻有裕炝趾笊L(zhǎng)表型不一，很難達(dá)到群體高產(chǎn)的目的，也很難保持母本的優(yōu)良特性而出現(xiàn)種性的衰退。因而，如何在保持品種優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上提高種苗繁殖系數(shù)，進(jìn)而提供優(yōu)質(zhì)的紅樺種苗，成為當(dāng)前紅樺造林工程的緊迫問題和關(guān)鍵問題。植物組織培養(yǎng)快速繁殖是當(dāng)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)在生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益最大的一個(gè)領(lǐng)域。組織培養(yǎng)快速繁殖種苗具有其獨(dú)特的優(yōu)越性，首先繁殖系數(shù)大，能以比常規(guī)方法快數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)倍的速度進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，及時(shí)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，使一個(gè)新的品種能夠在短時(shí)間內(nèi)滿足生產(chǎn)的需要，加速引種和良種的推廣進(jìn)程；使用的繁殖材料小和少；繁殖苗木整齊一致，商品性高，能夠保持原品種的優(yōu)良特性；可進(jìn)行周年工廠化育苗，生產(chǎn)效率高。對(duì)一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖(無種子或種子繁殖后代出現(xiàn)種性的衰退)的植物品種的繁殖，利用組織培養(yǎng)快速繁殖更為重要。目前，雖然已有樺木屬光皮樺、鹽樺、西南樺、垂枝樺和白樺幾個(gè)樹種的組織培養(yǎng)育苗技術(shù)專利和報(bào)道發(fā)表，但還尚無紅樺組織培養(yǎng)快速育苗的報(bào)道。目前，紅樺組織培養(yǎng)育苗存在著以下一些問題直接從野外紅樺母樹上取材，很難保證母樹的遺傳品質(zhì)；野外紅樺樹齡往往較大,造成外植體再生能力低下；野外(高海拔林區(qū))取材后難以及時(shí)返回實(shí)驗(yàn)室,外植體活力大大降低；紅樺枝葉絨毛多,污染率高,難以建立無菌培養(yǎng)物。因此,尋求并探索紅樺組織培養(yǎng)快速繁殖育苗技術(shù)，是擴(kuò)大紅樺種源生產(chǎn)，解決生產(chǎn)中種苗需求的迫切任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目地是提供一種紅樺組織培養(yǎng)快速育苗方法，利用本質(zhì)為無性繁殖的植物組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)，提高紅樺的繁殖系數(shù)，擴(kuò)繁出能保持母本原品種優(yōu)良特性的無性系苗木,從而為保證造林材料的均一性,提高林木生產(chǎn)力打下扎實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種紅樺組織培養(yǎng)快速育苗方法由無菌培養(yǎng)物的建立、芽苗的誘導(dǎo)、叢生芽的增殖、芽苗生根培養(yǎng)以及組培苗的移栽5個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)構(gòu)成，并按以下操作步驟分別實(shí)施。I、無菌培養(yǎng)物的建立選取當(dāng)年生新發(fā)嫩梢，剪去葉片和葉柄，切割成I. O I. 5cm長(zhǎng)帶有頂芽和腋芽的節(jié)段，將帶芽節(jié)段置于自來水下沖洗2 3h，然后用洗衣粉液浸泡10 30min，用軟刷刷洗節(jié)段后再置流水下沖洗30min。在超凈工作臺(tái)上，用70%乙醇浸泡15 30s，無菌水沖洗3次，然后用O. 1%的氯化萊處理6 8min,用無菌水沖洗4 6次,最后用濾紙吸干帶芽節(jié)段獲得無菌培養(yǎng)物(外植體)。2、芽苗的誘導(dǎo)將上述步驟獲得的無菌帶芽節(jié)段接種到芽苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上促進(jìn)腋芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS、1/2MS、1/4MS基本培養(yǎng)基，附加O. 5 I. 5mg/L的BA, O. I O. 5mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為 5. 8 6. O。3、芽苗的增殖待培養(yǎng)物出現(xiàn)點(diǎn)狀芽后，把上述步驟獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到芽苗增殖培養(yǎng)基進(jìn)行芽苗的繼代擴(kuò)繁增殖。增殖培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加O. 5 2. Omg/L的BA，O. 2 O. 8mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。在該階段反復(fù)繼代增殖，在獲得足夠的芽苗后進(jìn)入下一步。4、芽苗生根培養(yǎng)選取步驟3中增殖的2. 5cm左右長(zhǎng)的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根以獲得完整的植株。生根培養(yǎng)基為MS、1/2MS、1/4MS基本培養(yǎng)基，附加O. 6 I. Omg/L的IBA, O. I O. 3mg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為 5. 8 6. O。以上誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±2°C，濕度75%左右，光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間 16h/d。5、煉苗與移栽移栽前，把步驟4獲得的生根芽苗在培養(yǎng)架上煉苗I 2周，逐漸降低培養(yǎng)容器濕度，并適當(dāng)增加光照，以促進(jìn)莖葉保護(hù)組織的發(fā)生和氣孔功能的恢復(fù)。煉苗后取出生根組培苗，洗凈根上滯留的瓊脂培養(yǎng)基，用殺菌劑護(hù)根處理后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，控制環(huán)境濕度80 90%，稍后逐漸降低環(huán)境濕度。待有新芽發(fā)出后按常規(guī)苗圃育苗措施管理。上述步驟2所述芽苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加I. 5mg/L的BA，O. 3mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為 5. 8 6. O。上述步驟3所述芽苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加2. Omg/L的BA，O. 4mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為 5. 8 6. O。上述步驟4所述芽苗生根培養(yǎng)基優(yōu)選為1/4MS基本培養(yǎng)基，附加O. 8mg/L的IBA，O. lmg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為 5. 8 6. O。本發(fā)明的紅樺組織培養(yǎng)快速育苗方法，成功的將當(dāng)代生物技術(shù)的重要組成部分一組織培養(yǎng)快繁技術(shù)應(yīng)用于紅樺的種苗繁育，采用以芽繁芽的增殖途徑，兼顧了擴(kuò)大種苗數(shù)量和保持遺傳性狀的目的。利用本方法進(jìn)行紅樺組織培養(yǎng)快速育苗具有芽誘導(dǎo)率高、增殖系數(shù)大、生根率高和移栽成活率高的優(yōu)點(diǎn)，一般芽誘導(dǎo)率可以達(dá)到75%以上，月增殖系數(shù)到達(dá)4，生根率80%以上，移栽成活率大于85%，可以為林業(yè)生產(chǎn)中紅樺的大規(guī)模栽培提供一種繁殖速度快、生產(chǎn)周期短、遺傳穩(wěn)定性好的育苗方法，擴(kuò)大紅樺種源生產(chǎn)，解決生產(chǎn)中對(duì)紅樺種苗的需求。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。I、取材選擇紅樺優(yōu)樹家系優(yōu)良單株作為取材母株，于5 6月晴天的中午，在母樹上的上、中、下三個(gè)部位分別取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的當(dāng)年生新發(fā)枝條作為外植體。2、無菌培養(yǎng)物的建立將采集的枝條，剪去葉片和葉柄后，切割成2. Ocm長(zhǎng)帶有腋芽的節(jié)段，將帶芽節(jié)段置于自來水下沖洗3h，然后用洗衣粉液浸泡20min，用軟刷刷洗節(jié)段后再流水沖洗30min。在超凈工作臺(tái)上，用70%乙醇浸泡30s，無菌水沖洗3次，然后用O. I %的氯化汞(加I 2滴吐溫80)處理8min，用無菌水沖洗6次，最后用濾紙吸干帶芽節(jié)段獲得無菌培養(yǎng)物。3、芽苗的誘導(dǎo)在無菌接種室，先將上述步驟獲得的無菌帶芽節(jié)段的兩端與消毒液接觸的切口削去部分，保留節(jié)段長(zhǎng)度I. 5cm，以減輕消毒液的毒害，加快節(jié)段腋芽的啟動(dòng)生長(zhǎng)。然后把制備后的帶芽節(jié)段接種到芽苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS、1/2MS、1/4MS基本培養(yǎng)基的任意一種，附加O. 5 I. 5mg/L的BA, O. I O. 5mg/L的IBA,以及30g/L的鹿糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。4、芽苗的增殖待培養(yǎng)物出現(xiàn)點(diǎn)狀芽后，把上述步驟獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到芽苗增殖培養(yǎng)基進(jìn)行芽苗的繼代擴(kuò)繁增殖以獲得叢生芽。增殖培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加0. 5 2. 0mg/L的BA，O. 2 O. 8mg/L的IBA,以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。經(jīng)增殖培養(yǎng)獲得叢生芽后，按3 4苗分離叢生芽，轉(zhuǎn)移到在增殖培養(yǎng)反復(fù)繼代增殖，以獲得更多的芽苗，在這一階段實(shí)現(xiàn)芽苗數(shù)量的快速增加。
5、芽苗生根培養(yǎng)在增殖的芽苗中選取3cm長(zhǎng)的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基生根中。生根培養(yǎng)基為MS、1/2MSU/4MS 基本培養(yǎng)基，附加 O. 6 I. Omg/L 的 IBA, O. I O. 3mg/L 的 NAA,以及 20g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。以上誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±2°C，濕度75%左右，光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間 16h/d。6、煉苗與移栽移栽前，生根芽苗先在培養(yǎng)室培養(yǎng)架上煉苗I 2周，逐漸降低培養(yǎng)容器濕度，逐漸增加光照強(qiáng)度，以促進(jìn)莖葉保護(hù)組織的發(fā)生和氣孔功能的恢復(fù)。煉苗后取出生根組培苗，洗凈根上滯留的瓊脂培養(yǎng)基，馬上用500倍多菌靈殺菌液浸根5min，護(hù)根處理后移入用甲 醛消毒過的由蛭石+珍珠巖+園土(I I 8)配制成的營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，控制環(huán)境濕度80 90%，稍后逐漸降低環(huán)境濕度，成活率可以達(dá)到85%以上。根據(jù)苗木生長(zhǎng)狀況，可以葉面噴施尿素和磷酸二氫鉀的水溶液，待有新芽發(fā)出后按常規(guī)苗圃育苗措施管理。對(duì)比實(shí)施例I :取材部位對(duì)外植體培養(yǎng)效果的影響本實(shí)驗(yàn)是在母樹不同部位采集枝條制備外植體，然后接種在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，考察污染率、褐變率以及存活率等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下述表I。表I不同部位外植體對(duì)培養(yǎng)效果的影響
權(quán)利要求
1.一種紅樺組織培養(yǎng)育苗方法，其包括如下步驟(1)無菌培養(yǎng)物的建立選取當(dāng)年生新發(fā)紅樺嫩梢，剪去葉片和葉柄，切割成I. O I. 5cm長(zhǎng)帶有頂芽和腋芽的節(jié)段，將帶芽節(jié)段置于自來水下沖洗2 3h，然后用洗衣粉液浸泡10 30min，用軟刷刷洗節(jié)段后再置流水下沖洗30min ;在超凈工作臺(tái)上，用60-80%乙醇浸泡15 30s，無菌水沖洗2 4次,然后用O. 05 O. 15%的氯化萊處理6 8min,用無菌水沖洗4 6次,用濾紙吸干帶芽節(jié)段獲得無菌培養(yǎng)物；(2)芽苗的誘導(dǎo)將上述步驟獲得的無菌帶芽節(jié)段接種到芽苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上促進(jìn)腋芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS、1/2MSU/4MS基本培養(yǎng)基中的任意一種或者兩種的組合，加入O. 5 I. 5mg/ L的BA，O. I O. 5mg/L的IBA,以及20 40g/L的蔗糖和5 8g/L的瓊脂，用HCl和/或 NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O ;(3)芽苗的增殖待培養(yǎng)物出現(xiàn)點(diǎn)狀芽后，把上述步驟獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到芽苗增殖培養(yǎng)基進(jìn)行芽苗的繼代擴(kuò)繁增殖，增殖培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基，加入O. 5 2. Omg/L的BA，O. 2 O. 8mg/L 的IBA，以及20 40g/L的蔗糖和5 8g/L的瓊脂，用HCl和/或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8 6. O ;重復(fù)上述繼代增殖步驟以獲得足夠的芽苗；(4)芽苗生根培養(yǎng)選取步驟(3)中增殖的2 3cm左右長(zhǎng)的芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根以獲得完整的植株，生根培養(yǎng)基為MS、1/2MS、1/4MS基本培養(yǎng)基，附加O. 6 I. Omg/L的IBA，O. I O. 3mg/ L的NAA，以及10 30g/L的蔗糖和5 8g/L的瓊脂，用HCl和/或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為 5. 8 6. O。(5)煉苗與移栽移栽前，把步驟(4)獲得的生根芽苗在培養(yǎng)架上煉苗I 2周，逐漸降低培養(yǎng)容器濕度，并適當(dāng)增加光照，以促進(jìn)莖葉保護(hù)組織的發(fā)生和氣孔功能的恢復(fù)；煉苗后取出生根組培苗，洗凈根上滯留的瓊脂培養(yǎng)基，用殺菌劑護(hù)根處理后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，控制環(huán)境濕度 80 90%，稍后逐漸降低環(huán)境濕度，待有新芽發(fā)出后按常規(guī)苗圃育苗措施管理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育苗方法，步驟(2)所述芽苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加I. 5mg/L的BA, O. 3mg/L的IBA,以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用lmol/L的 HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育苗方法，步驟(3)所述芽苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為1/2MS基本培養(yǎng)基，附加2. Omg/L的BA, O. 4mg/L的IBA,以及30g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用Imol/ L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育苗方法，步驟(4)所述芽苗生根培養(yǎng)基優(yōu)選為1/4MS基本培養(yǎng)基，附加O. 8mg/L的IBA, O. lmg/L的NAA,以及20g/L的蔗糖和6. 5g/L的瓊脂，用Imol/ L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5. 8 6. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育苗方法，其特征在于誘導(dǎo)、增殖和/或生根培養(yǎng)的條件為 培養(yǎng)溫度為22±2°C，濕度70 80%，光照強(qiáng)度2000 40001x，光照時(shí)間14 18h/d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅樺組織培養(yǎng)快速育苗方法，由無菌培養(yǎng)物的建立、芽苗的誘導(dǎo)、叢生芽的增殖、芽苗生根培養(yǎng)以及組培苗的移栽5個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)構(gòu)成。利用本方法進(jìn)行紅樺組織培養(yǎng)快速育苗具有芽誘導(dǎo)率高、增殖系數(shù)大、生根率高和移栽成活率高的優(yōu)點(diǎn)，一般芽誘導(dǎo)率可以達(dá)到75％以上，月增殖系數(shù)到達(dá)4，生根率80％以上，移栽成活率大于85％，可以為林業(yè)生產(chǎn)中紅樺的大規(guī)模栽培提供一種繁殖速度快、生產(chǎn)周期短、遺傳穩(wěn)定性好的育苗方法，擴(kuò)大紅樺種源生產(chǎn)，解決生產(chǎn)中對(duì)紅樺種苗的需求。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102972301SQ20121055134
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月8日
發(fā)明者鐘宇, 鄭陽(yáng)霞, 胡庭興, 章婷, 張魯, 萬(wàn)雪琴, 張健, 李賢偉, 馮茂松, 范川 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)