專利名稱：一種簡(jiǎn)化的可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法
一種簡(jiǎn)化的可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于海水動(dòng)物放流領(lǐng)域，具體地涉及一種簡(jiǎn)便易操作地可實(shí)現(xiàn)對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦個(gè)體精確追溯的放流方法。
背景技術(shù)：
中國(guó)對(duì)奸(Fenneropenaeus chinensis)是我國(guó)特有的一年生大型經(jīng)濟(jì)奸類,主要分布在黃渤海沿岸海區(qū)，經(jīng)濟(jì)效益顯著。二十世紀(jì)八十年代以來，由于捕撈強(qiáng)度的不斷加大、生態(tài)變遷、水域污染、病害頻發(fā)以及人工養(yǎng)殖業(yè)對(duì)野生中國(guó)對(duì)蝦的盲目需求等綜合因素的影響，中國(guó)對(duì)蝦野生資源量急劇萎縮。為保護(hù)、恢復(fù)中國(guó)對(duì)蝦種群和漁業(yè)資源，我國(guó)于 1984年開始在特定海區(qū)進(jìn)行中國(guó)對(duì)蝦移殖/增殖放流，每年放流約30億尾仔蝦。經(jīng)過連續(xù)多年的大規(guī)模種苗放流，中國(guó)對(duì)蝦資源量得到了一定的恢復(fù)。不過由于無法準(zhǔn)確區(qū)分回捕群體中放流個(gè)體和野生個(gè)體及數(shù)量，因而無法科學(xué)評(píng)估放流群體對(duì)野生資源的補(bǔ)充水平， 分析野生資源的動(dòng)態(tài)變化并制定科學(xué)的放流規(guī)劃，這是中國(guó)對(duì)蝦放流迫切需要解決的重大問題。衡量和評(píng)估放流效果的重要指標(biāo)之一是放流回捕率估算，這是制定科學(xué)的放流規(guī)劃、 有效促進(jìn)野生中國(guó)對(duì)蝦種群資源恢復(fù)的重要指標(biāo)。但是現(xiàn)有的檢測(cè)方法由于存在各種缺陷而無法提供精確的回捕率，主要存在以下幾個(gè)原因1)回捕樣品中無法準(zhǔn)確區(qū)分放流和野生對(duì)蝦個(gè)體；2)放流個(gè)體的物理標(biāo)記過程操作繁瑣、無法大規(guī)模進(jìn)行，一般只對(duì)部分放流個(gè)體進(jìn)行標(biāo)記；3)物理標(biāo)記對(duì)個(gè)體規(guī)格要求苛刻、標(biāo)記后個(gè)體死亡率大，影響回捕率準(zhǔn)確估算。因此，目前迫切需要一種技術(shù)對(duì)放流群體進(jìn)行大批量標(biāo)志，以此為中國(guó)對(duì)蝦放流提供精確的回捕率數(shù)據(jù)。并且該技術(shù)應(yīng)該具備以下特征1)放流個(gè)體攜帶特有的標(biāo)識(shí)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可精確區(qū)分野生和人工放流個(gè)體；2)攜帶該標(biāo)識(shí)系統(tǒng)的個(gè)體可以大批量培育并維系個(gè)體一生，不會(huì)對(duì)標(biāo)識(shí)個(gè)體具有任何內(nèi)在或物理傷害；3)該標(biāo)識(shí)個(gè)體可被迅速鑒別并與其它個(gè)體區(qū)分開來；4)標(biāo)識(shí)個(gè)體放流不會(huì)破壞或影響野生中國(guó)對(duì)蝦群體資源結(jié)構(gòu)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，精確評(píng)估中國(guó)對(duì)蝦放流效果，精確評(píng)估放流回捕率，推算野生群體資源量的目的，制定科學(xué)的放流規(guī)劃、有效促進(jìn)野生中國(guó)對(duì)蝦種群資源恢復(fù)。
本發(fā)明所采用的放流效果評(píng)估方法符合放流檢測(cè)所要具備的5個(gè)條件1)具有確定遺傳背景、不攜帶特定病原的中國(guó)對(duì)蝦大規(guī)模多家系苗種培育；2)中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體/家系高效精確識(shí)別；3)攜帶特定DNA分子指紋圖譜放流個(gè)體的標(biāo)志放流；4)攜帶特定DNA分子指紋圖譜放流個(gè)體的大規(guī)模檢出；5)放流和野生資源及回捕率的精確計(jì)算。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，包括以下步驟
每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育，產(chǎn)卵后的雌蝦-75°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個(gè)體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)檢測(cè)回捕樣本，并確定放流個(gè)體的數(shù)量，最終評(píng)估中國(guó)對(duì)蝦的放流效果；
其中所述的中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)，第一組微衛(wèi)星四重 PCR引物組合及序列如下-6-FAM-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3-VIC-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3-NED-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3-PET-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3反向序列為反向序列為反向序列為反向序列為
EN0033正向序列為5 '5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'
RS0622正向序列為5 '5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'
FCKR002正向序列為5 5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'
FCKRO13正向序列為5 5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'；
進(jìn)一步，所述的第一組四重PCR引物的反應(yīng)體系為25μ I反應(yīng)體系，其中包括 2. 5μ 110XPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13 正反引物每條各為 O. 5μ1 ； IOOng 基因組 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 單位 Taq DNA 聚合酶；
進(jìn)一步，所述的第一組四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火Imin (每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C)，72°C延伸lmin，共循環(huán)5 次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)8次；再進(jìn)行循環(huán)3 :94°C變性40s,64°C退火Imin (每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C),72°C延伸lmin,共循環(huán)4 次；進(jìn)行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并結(jié)束程序。
其中所述的中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)，第二組微衛(wèi)星四重 PCR引物組合及序列如下
RSllOl 正向序列為5 ‘-6-FAM—CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列為5’ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘
FCKR005正向序列為 5’ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3
FCKR007正向序列為 5， -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3
FCKR009正向序列為 5’ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-35(-Vic—CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 (-NED—CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 (-PET—GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為
進(jìn)一步，所述的第二組四重PCR引物的反應(yīng)體系為25μ I反應(yīng)體系，其中包括2.5μ 110XPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13 正反引物每條各為 O. 5μ1 ； IOOng 基因組 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 單位 Taq DNA 聚合酶；
進(jìn)一步，所述的第二組四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s，52°C退火lmin，72min延伸lmin，共循環(huán)10次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 -MV 變性40 s，51°C退火Imin(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低O. 5°C)，72°C延伸Imin，共循環(huán)4次；再進(jìn)行循環(huán)3 :94°C變性40 s，49°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)10次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并結(jié)束程序。
進(jìn)一步，放流效果的確定是按如下公式計(jì)算的放流回捕率=放流個(gè)體數(shù)量/樣品總數(shù)。
本發(fā)明進(jìn)行個(gè)體準(zhǔn)確追溯的原理是利用中國(guó)對(duì)蝦同一家系內(nèi)個(gè)體具備相同分子指紋圖譜，在單一母本已知的情況下，同一家系個(gè)體可被精確識(shí)別的特點(diǎn)，結(jié)合中國(guó)對(duì)蝦大規(guī)模多家系育苗，生產(chǎn)放流群體。秋汛回捕時(shí)，利用精確高效分子指紋圖譜分析識(shí)別，從回捕樣品中識(shí)別放流個(gè)體，計(jì)算放流個(gè)體數(shù)量和野生個(gè)體數(shù)量，從而達(dá)到精確評(píng)估放流回捕率。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)地域所有放流群體母本精確選擇，為放流后回捕個(gè)體的精確追溯奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)勢(shì)主要在于簡(jiǎn)化了放流群體的制備，即本發(fā)明僅需對(duì)生產(chǎn)放流苗種的中國(guó)對(duì)蝦母本進(jìn)行樣本采集，并利用兩組熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR對(duì)采集的放流樣本進(jìn)行親子溯源分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦的跟蹤識(shí)別。避免了現(xiàn)有技術(shù)需要大批量制備中國(guó)對(duì)蝦全同胞家系、越冬中國(guó)對(duì)蝦親體培育、雄蝦親本識(shí)別的繁瑣操作。
本發(fā)明用于回捕個(gè)體的檢測(cè)方法是通過兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR 個(gè)體識(shí)別技術(shù)，利用分子指紋圖譜分析，從回捕樣品中識(shí)別放流個(gè)體，該標(biāo)記為個(gè)體遺傳物質(zhì)，對(duì)于放流的任意規(guī)格中國(guó)對(duì)蝦個(gè)體都能起到標(biāo)識(shí)作用，且可以維系一生，不會(huì)對(duì)標(biāo)記個(gè)體造成任何內(nèi)在或物理損傷。并且在整個(gè)放流過程中，放流個(gè)體具備與其它個(gè)體相同的生活生態(tài)習(xí)性行、相同的洄游路線，不會(huì)比其它個(gè)體具備更明顯的生存/死亡優(yōu)勢(shì)；放流標(biāo)識(shí)個(gè)體通過微衛(wèi)星四重PCR技術(shù)可被迅速鑒別并與其它個(gè)體區(qū)分開來，可以用來對(duì)回捕樣品中放流、野生群體數(shù)量及回捕率進(jìn)行精確計(jì)算；且標(biāo)識(shí)個(gè)體放流不會(huì)破壞或影響野生中國(guó)對(duì)蝦群體資源結(jié)構(gòu)。因此本發(fā)明的方法可以準(zhǔn)確評(píng)估中國(guó)對(duì)蝦的放流效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :標(biāo)記放流種群及方法的確立
一、具有特定分子指紋圖譜中國(guó)對(duì)蝦家系個(gè)體的追溯
每對(duì)父母繁育的后代都有一致的DNA分子指紋，該分子指紋為個(gè)體/家系特有而區(qū)別于其它家系和個(gè)體且維系一生。利用這種特異性的分子指紋圖譜，參照親本基因型， 即可從混合群體中準(zhǔn)確識(shí)別出特定的個(gè)體/家系。中國(guó)對(duì)蝦微衛(wèi)星在基因組中分布廣泛， 遺傳變異水平豐富，具遺傳選擇中性特點(diǎn)。微衛(wèi)星分子標(biāo)記不同基因型組合而形成的分子指紋圖譜是進(jìn)行個(gè)體/家系識(shí)別的理想工具。以實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的中國(guó)對(duì)蝦微衛(wèi)星位點(diǎn)為例，大多數(shù)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量在7-13個(gè)不等。在單一親本已知的情況下，利用八個(gè)互不連鎖的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為10個(gè)，則理論上此四個(gè)微衛(wèi)星組成的分子指紋圖譜識(shí)別體系可以達(dá)到家系/個(gè)體排除率99. 9999%的水平。也就是說，同一家系內(nèi)的個(gè)體間其分子指紋圖譜是一致的，而區(qū)別于其它個(gè)體的分子指紋圖譜。
二、多家系放流種群的獲得
每年春季放流苗種生產(chǎn)季節(jié)，海捕對(duì)蝦中挑選已交尾的雌蝦個(gè)體若干，進(jìn)行眼柄標(biāo)記(即在對(duì)蝦眼柄上套上帶有標(biāo)記信息的塑料環(huán))。營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化后進(jìn)行苗種培育，隨后進(jìn)行中國(guó)對(duì)蝦苗種放流。
三、回捕、以及放流效果評(píng)估
秋季，在各放流洄游點(diǎn)進(jìn)行放流個(gè)體的捕撈，每個(gè)放流地點(diǎn)采樣數(shù)量為5000尾。 每個(gè)樣品取游泳附肢采用常規(guī)酚/氯仿抽提方法進(jìn)行DNA提取。然后進(jìn)行熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR檢測(cè)分析。首先進(jìn)行第一組熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為 25 μ I反應(yīng)體系，其中包括2.5 μ 110XPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物(引物組合及序列見表I)的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為 O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13正反引物每條各為O. 5 μ I ;100ng基因組 DNA,250 μ mol/L dNTPs2. 5 μ 1、2· OmmoI/L Mg2+ 2· O μ 1、1 單位 Taq DNA 聚合酶；擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火lmin (每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C)，72°C延伸lmin，共循環(huán)5次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C 延伸lmin，共循環(huán)8次；再進(jìn)行循環(huán)3 :94°C變性40s，64°C退火Imin(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C)，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次;然后進(jìn)行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸5min，4°C保存并結(jié)束程序。PCR產(chǎn)物檢測(cè)在ABI3130 測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)上進(jìn)行，利用GeneMapper軟件進(jìn)行峰值轉(zhuǎn)化及微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因判讀。采用同樣方法對(duì)母本進(jìn)行四個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型檢測(cè)。家系親本及樣品數(shù)據(jù)分別輸入Cervus 3. O軟件中進(jìn)行親本及子代個(gè)體識(shí)別，第一組檢測(cè)中放流個(gè)體與親本等位基因不相符的個(gè)體排除掉，與親本等位基因相符的個(gè)體利用第二組熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR體系再檢測(cè)一次，其數(shù)據(jù)與母本數(shù)據(jù)分別輸入Cervus 3. O軟件中進(jìn)行母本及子代個(gè)體識(shí)別。以此推斷檢測(cè)樣品中放流個(gè)體及其數(shù)量。放流回捕率=放流個(gè)體數(shù)量 /樣品總量(％)。
表I.中國(guó)對(duì)蝦個(gè)體/家系識(shí)別所用微衛(wèi)星引物組合及序列
權(quán)利要求
1.一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特征在于包括以下步驟每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育，生產(chǎn)完成的雌蝦-75°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個(gè)體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)檢測(cè)放流個(gè)體及數(shù)量，最終確定中國(guó)對(duì)蝦的放流效果； 所述的兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)，第一組微衛(wèi)星四重PCR引物組合及序列如下 EN0033 正向序列為5 ' -6-FAM-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3 '，反向序列為5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'； RS0622 正向序列為5 ' -VIC-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3 '，反向序列為5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'； FCKR002 正向序列為5 ' -NED-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3 '，反向序列為5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'； FCKRO13 正向序列為5 ' -PET-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3 '，反向序列為:5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'； 所述的兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)，第二組微衛(wèi)星四重PCR引物組合及序列如下 RSllOl 正向序列為5 ' -6-FAM-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 '，反向序列為5' -TATTCCCACGCTCTTGTC-3' FCKR005 正向序列為5 ' -VIC-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 '，反向序列為5' -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3' FCKR007 正向序列為5 ' -NED-CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 '，反向序列為5' -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3' FCKR009 正向序列為5 ' -PET-GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 '，反向序列為5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特在于所述的第一組微衛(wèi)星四重PCR引物的反應(yīng)體系為25iU反應(yīng)體系，其中包括2.5iillOXPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為lOiiM，EN0033正反引物每條各為0.25 iil，RS0622正反引物每條各為0. 5u I, FCKR002正反引物每條各為0. 5u I, FCKRO13正反引物每條各為 0. I ;100ng 基因組 DNA、250iimol/LdNTPs 2. 5 y 1、2. Ommol/L Mg2+2.0 ill、I單位Taq DNA聚合酶，余量用雙蒸水補(bǔ)足。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特在于所述的第一組微衛(wèi)星四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s, 70°C退火lmin,每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C,72°C延伸Imin,共循環(huán)5次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)8次；再進(jìn)行循環(huán)3 94°C變性40s，64°C退火lmin，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次；進(jìn)行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸5min，4°C保存并結(jié)束程序。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特在于所述的第二組微衛(wèi)星四重PCR引物的反應(yīng)體系為25iU反應(yīng)體系，其中包括.2.5iillOXPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為lOiiM，EN 0033正反引物每條各為.0. 25 iil，RS0622正反引物每條各為0. 5u I, FCKR002正反引物每條各為0. 5u I, FCKRO13正反引物每條各為 0.5iil ； IOOng 基因組 DNA、250iimol/LdNTPs 2. 5 u 1,2. Ommo I/LMg2+2.0u IU單位Taq DNA聚合酶，余量用雙蒸水補(bǔ)足。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特在于所述的第二組微衛(wèi)星四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :.94°C變性40s，52°C退火lmin，72min延伸lmin，共循環(huán)10次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 :94°C變性40s，51°C退火lmin，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0. 5°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次；再進(jìn)行循環(huán).3 :94°C變性40 s，49°0退火11^11，721延伸lmin，共循環(huán)10次;最后72°C延伸5min，4°C保存并結(jié)束程序。
全文摘要
一種可對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，包括以下步驟每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并進(jìn)行眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育。生產(chǎn)完成的雌蝦-75℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個(gè)體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國(guó)對(duì)蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個(gè)體識(shí)別技術(shù)檢測(cè)放流個(gè)體及數(shù)量，最終確定中國(guó)對(duì)蝦的放流效果；本發(fā)明僅需對(duì)生產(chǎn)放流苗種的中國(guó)對(duì)蝦母本進(jìn)行樣本采集，并利用兩組熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR對(duì)采集的放流樣本進(jìn)行親子溯源分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)放流中國(guó)對(duì)蝦的跟蹤識(shí)別。避免了現(xiàn)有技術(shù)需要大批量制備中國(guó)對(duì)蝦全同胞家系、越冬中國(guó)對(duì)蝦親體培育、雄蝦親本識(shí)別的繁瑣操作。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102972322SQ20121055959
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者王偉繼, 張凱, 孔杰, 金顯仕, 阮曉紅 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所