專利名稱：用于降解臍橙囊衣微生物的培養基及酶制劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體而言，涉及一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基及酶制劑的制備方法。
背景技術：
我國柑橘加工長期沿襲著人工剝皮和酸堿脫囊衣等傳統工藝生產。現有酸堿法脫囊衣的酸堿處理法主要有經典酸堿二步法、改良重酸二步法、磷酸鹽NaOH —步法，以及EDTA或Na2-EDTA (乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉)為助劑的低堿去囊衣法。人工去皮和酸堿脫囊衣工藝存在勞動密集、生產效率低、產品質量不穩定等問題。目前工業化罐頭生產脫囊衣耗水量大，每噸產品耗水量達60 80噸，不僅增加產品成本，而且加劇了飲用水 資源的短缺。同時，因大量使用堿，產生大量的工業堿液廢水，增加了產品的生產成本，也污染環境，影響了產品的安全性，容易遭遇技術壁壘和綠色壁壘，削弱了我國柑橘罐頭工業在國際市場的競爭優勢。同時，在柑橘加工生產中產生了約占柑橘加工量30%左右的皮渣，通常都被丟棄掉，不僅造成資源浪費，也給環境帶來了污染。臍橙加工中脫囊衣工藝是其主要技術難點之一。目前橙汁胞的生產技術主要采用傳統柑橘罐頭酸堿處理的工藝，存在人工剝皮、分瓣，生產效率低；酸堿囊衣用水量大，環境污染嚴重，產品安全性低；由于柑橘皮與臍橙皮結構的差異，導致現有的柑橘酶法去囊衣技術不適合于臍橙橙汁胞的加工。

發明內容
本發明旨在提供一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基及酶制劑的制備方法，以高效地制備降解臍橙囊衣微生物的酶制劑。根據本發明的一個發明，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑的制備方法。該制備方法包括采用保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:M 2012160的黑曲霉C-2 (Aspergillus sp. C_2)作為發酵菌株，經過液體深層發酵或固態發酵培養制備得到降解臍橙囊衣酶制劑。進一步地，液體深層發酵或固態發酵培養之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養的步驟。進一步地，活化包括將黑曲霉C-2接種于活化培養基中進行活化，活化培養基的pH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化時間為I 2天；其中，活化培養基為以臍橙囊衣粉為碳源的固體斜面培養基，包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/UMgSO4 0. 6g/L Ig/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L IOg/L和瓊脂15g/L 20g/L，并且在121°C溫度下滅菌30min制得活化培養基。進一步地，制備孢子懸浮液的步驟包括采用無菌水洗下黑曲霉C-2的孢子，并稀釋至2 3X IO6個/mL制得孢子懸浮液，并將孢子懸浮液保存在4°C備用。進一步地，種子培養包括將孢子懸浮液接種于種子液體培養基中，控制種子液體培養基的pH值為7. O 7. 2，培養溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養12 16h ;或將孢子懸浮液接種于種子固體培養基中，控制種子固體培養基的初始PH值為6. 5，培養溫度控制在28V 30°C，培養48h ;其中，種子液體培養基為以臍橙囊衣粉為碳源的培養基，包括如下含量的組分=(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得種子液體培養基。進一步地，液體深層發酵培養的步驟包括將經過種子培養的含黑曲霉C-2的種子液體培養基接種于發酵瓶中進行深層發酵培養，發酵培養條件為12h內溫度為30°C，12h 后 28°C ；pH 值為 7. 0 7. 2 ;壓力位 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m, 12h后200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發酵時間108 120h,制得酶制劑。進一步地，固態發酵培養的步驟包括經過種子培養的含黑曲霉c-2的種子固體培養基接種入固態發酵培養基中，30°C培養108h，得到黑曲霉C-2固態發酵曲，固態發酵曲通過低溫干燥及粉碎后制得酶制劑，或通過0. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得酶制劑；其中，固態發酵培養基通過以下方法制備將麥麩95重量份、臍橙果渣或臍橙果皮粉180重量份、硫酸銨2重量份、硫酸鎂0. 5重量份、磷酸氫二鉀I重量份加入水拌勻并調節水分濕度為60%，得固態發酵培養基。進一步地，包括將酶制劑經過超濾、濃縮制得濃縮酶制劑，或將酶制劑制備成粉劑或顆粒劑。根據本發明的另一個方面，提供一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基，培養基為以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源。進一步地，包括如下含量的組分(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L Ig/L^K2HPO4lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L 10g/L 和瓊脂 15g/L 20g/L，并且在121°C溫度下滅菌30min制得培養基。進一步地，包括如下含量的組分(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L Ig/ L、K2HPO4lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得培養基。采用本發明的技術方案，以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源的培養基對本發明中的微生物(保藏號為CCTCCN0:M 2012160，保藏日為2012年5月7日)進行培養制備酶制劑，制得的酶制劑不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業的附加值，有保護了環境，具有經濟和社會雙重意義。
具體實施例方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣微生物。該微生物的保藏名稱為黑曲霉C-2(Aspergillus sp. C-2)，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:M 2012160，保藏日為2012年5月7日。本發明的降解臍橙囊衣微生物是通過以下步驟篩選獲得的從腐爛臍橙表面、土壤等樣品中篩選目標菌株，然后經過紫外誘變后，通過反復的篩選獲得對臍橙囊衣具有高效降解作用的菌株。本發明的準用菌株經鑒定為黑曲霉C-2 (Aspergillus sp.C-2)，其主要生物學特征為在固體培養基上，培養3d 5d，菌落蔓延迅速，初為白色，后變成褐色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2. 5 4. O Pm。分生孢子頭球狀，直徑700 800 ym，褐黑色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。分生孢子梗自基質中伸出長約I 3mm,壁厚而光滑。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑。該酶制劑采用上述降解臍橙囊衣微生物制得。由于該降解臍橙囊衣酶制劑不涉及酸堿的大量使用，通過生物酶解作用進行臍橙囊衣的脫除，因此可大大提升生產效率、減少臍橙果破碎率、使產品質量穩定，并且能夠降低生產成本，無殘留、綠色環保、安全性高、不污染環境。優選地，該酶制劑采用上述降解臍橙囊衣微生物經液體深層發酵或固態發酵培養制得。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種降解臍橙囊衣酶制劑的制備方法。該 制備方法包括采用上述黑曲霉C-2作為發酵菌株，經過液體深層發酵或固態發酵培養制備得到降解臍橙囊衣酶制劑。在臍橙囊衣的脫除過程中起主要作用的是該黑曲霉C-2及其代謝物，因為此制備也可以采用現有技術中的常規方法進行，優選地，黑曲霉C-2經過液體深層發酵或固態發酵培養制備得到降解臍橙囊衣酶制劑，因為這些酶制劑的制備方法簡單，便于工業化生產，而且不會造成環境污染。優選地，液體深層發酵或固態發酵培養之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養的步驟，增加這些步驟可以使菌株的活性增強，有利于酶制劑的生產效率提高，以及在后續使用過程中使酶制劑保持較高的活性。根據本發明一種典型的實施方式，活化包括將黑曲霉C-2接種于培養基中進行活化，培養基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化時間為I 2天。冷凍保藏的產酶黑曲霉C-2菌種細胞通過該活化程序，可使該微生物產酶的能力快速恢復正
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巾o根據本發明一種典型的實施方式，種子培養包括將活化的孢子懸浮液接種于種子液體培養基中，控制種子液體培養基的PH值為7. 0 7. 2，培養溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養12 16h，最終獲取一定數量和質量的純種子，可作為大規模發酵生產的菌種。根據本發明一種典型的實施方式，液體深層發酵培養包括將經過種子培養的含黑曲霉C-2的種子液體培養基接種于發酵瓶中進行深層發酵培養，發酵培養條件為12h內溫度為300C，12h 后 280C ；pH 值為 7. 0 7. 2 ;壓力位 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m，12h后200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發酵時間108 120h,制得酶制劑。通過液體深層發酵能夠保證養分均勻分配和氧氣充足，具有發酵產酶生產周期短、產量高、效益大等優點。根據本發明一種典型的實施方式，固態發酵培養的步驟包括經過所述種子培養的含黑曲霉C-2的所述種子固體培養基接種入固態發酵培養基中，30°C培養108h，得到黑曲霉C-2固態發酵曲，所述固態發酵曲通過低溫干燥及粉碎后制得所述酶制劑，或通過0. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得所述酶制劑。固態發酵模擬菌種自然生長環境，使微生物保持與自然界相似的生長狀態，發酵結束時，培養基是濕物料狀態，目的產物濃度高且提取工藝簡單。根據本發明一種典型的實施方式，活化用的培養基為固體斜面培養基；制備孢子懸浮液的步驟包括采用無菌水洗下黑曲霉C-2的孢子，并稀釋至2 3X IO6個/mL制得孢子懸浮液，并將孢子懸浮液保存在4°C備用。優選地，種子培養步驟中將孢子懸浮液按5%的接種量接種于種子液體培養基中；液體深層發酵培養步驟中將經過種子培養的含黑曲霉C-2的種子液體培養基按8% 10%的接種量接種于發酵瓶中進行深層發酵培養。此接種量既不會造成菌種的浪費，又有利于黑曲霉C-2的快速繁衍。優選地，活化用的以臍橙囊衣粉為碳源的培養基包括如下含量的組分=(NH4)2SO42g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉6g/L 10g/L和瓊脂15g/L 20g/L，并且活化用的培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養基適合用于黑曲霉C-2的活化，因為以臍橙囊衣粉為碳源，冷凍保藏的產酶黑曲霉C-2菌種細胞通過該活化程序，可使該微生物產生臍橙囊衣降解 酶的能力快速恢復正常。優選地，種子液體培養用的以臍橙囊衣粉為碳源的培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且種子液體培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養基適合用于黑曲霉C-2的培養，最終獲取一定數量和質量的純種子，可作為大規模發酵生產的菌種。并且液體深層發酵培養的過程中也可以采用此培養基進行。因為以臍橙囊衣粉為碳源，可使該微生物產生的臍橙囊衣降解酶保持高活力。根據本發明一種典型的實施方式，步驟4)之后根據實際需要進一步包括將酶制劑經過超濾、濃縮制得濃縮酶制劑，或將酶制劑制備成粉劑或顆粒劑等，濃縮酶制劑方便使用，粉劑或顆粒劑等更便于保藏與運輸。通過本發明方法制備的酶制劑酶解效率較高；并且經過該方法制得的酶制劑在酶發酵液經過過濾除菌、超濾濃縮、防腐處理后室溫保存6個月后酶活仍然保持95%以上。根據本發明一種典型的實施方式，上述降解臍橙囊衣酶制劑在臍橙、柑橘脫囊衣上的應用。優選地，酶制劑的應用包括以下步驟酶制劑稀釋后與削皮臍橙于45 50°C水浴保溫90 120min。根據本發明一種典型的實施方式，降解臍橙囊衣的具體方法為將削皮殘留囊衣的臍橙果球備用，將濃縮的發酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到45 °C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。本發明在對降解臍橙囊衣微生物菌株選育的同時對其發酵產酶的工藝進行了優化，適合工業化大規模生產該酶制劑。根據本發明的一種典型的實施方式，提供一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基。該培養基為以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源。用作微生物活化時，優選地包括如下含量的組分(NH4) 2S04 2g/L 2. 5g/L、MgS04
0.6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L lOg/L 和瓊脂15g/L 20g/L，并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養基。用于種子液態培養時，優選地包括如下含量的組分。(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 0. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養基。下面將結合實施例進一步說明本發明的有益效果。活化培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L Ig/UK2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L 10g/L 和瓊脂 15g/L 20g/L，并且活化用的培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養基效果相似。種子液體培養基包括如下含量的組分(NH4) 2S04 2g/L 2. 5g/L、MgS04 0 . 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣 15g/L 20g/L ；并且種子液體培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養基適合用于黑曲霉C-2的培養，并且液體深層發酵培養的過程中也可以采用此培養基進行。
實施例1本實施例考察液體深層發酵液中本發明的黑曲霉C-2菌株CCTCCN0:M 2012160發酵液對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑活化培養基包括如下含量的組分=(NH4)2SO42g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、臍橙囊衣粉6g/L和瓊脂15g/L，并且活化用的培養基在121 °C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養基效果相似。種子液體培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0. 6g/L、K2HPO4 lg/L、NaCl lg/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L ;并且種子液體培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養基適合用于黑曲霉C-2的培養，并且液體深層發酵培養的過程中也可以采用此培養基進行。步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 29°C，活化培養2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于種子液體培養基中，控制種子培養基的pH值為7. 0 7. 2，種子培養時的溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養12 16h ;培養基中臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L。(3)液體深層發酵培養將上述培養后的種子黑曲霉C-2菌種按液體深層發酵培養基8% 10%的接種量接種入發酵瓶中進行深層發酵培養，所述液體深層發酵培養基的配方與所述種子液體培養基相同，發酵培養條件為12h內溫度為30°C，12h后28°C ；自動調節 pH 7. 0 7. 2 ;罐壓 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m，12h 后 200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發酵時間108 120h。全流程培養時間大約在10天，將液體深層發酵所得的酶液立即使用，將所述發酵所得到的酶液經過超濾濃縮得到濃縮酶液，或通過其他加工方式得到的不同的降解臍橙囊衣酶制劑，如粉劑或顆粒劑等，備用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將濃縮的發酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例2本實施例考察液體深層發酵液中本發明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160發酵液對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑活化培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO42. 5g/L, MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、NaC12g/L、臍橙囊衣粉10g/L和瓊脂20g/L，并且活化用的培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養基效果相似。種子液體培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2. 5g/L、MgSO4 lg/L、K2HPO4 2g/L、2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣20g/L ;并且種子液體培養基在121°C溫度下滅菌30min 制得。此種種子液體培養基適合用于黑曲霉C-2的培養，并且液體深層發酵培養的過程中也可以采用此培養基進行。步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在29°C 30°C，活化培養2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于種子液體培養基中，控制種子培養基的pH值為7. 0 7. 2，種子培養時的溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養12 16h ;培養基中臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣20g/L。(3)液體深層發酵培養將上述培養后的種子黑曲霉C-2菌種按液體深層發酵培養基8% 10%的接種量接種入發酵瓶中進行深層發酵培養，所述液體深層發酵培養基的配方與所述種子液體培養基相同，發酵培養條件為12h內溫度為30°C，12h后28°C ；自動調節 pH 7. 0 7. 2 ;罐壓 0. 06MPa 0. 08MPa ;攪拌速度 12h 內 180r/m，12h 后 200r/m ;通氣量1:1. 0 1. 5 ;發酵時間108 120h。全流程培養時間大約在10天，將液體深層發酵所得的酶液立即使用，將所述發酵所得到的酶液經過超濾濃縮得到濃縮酶液，或通過其他加工方式得到的不同的降解臍橙囊衣酶制劑，如粉劑或顆粒劑等，備用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將濃縮的發酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例3本實施例考察固態發酵中本發明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160固態發酵曲對臍橙囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發明的黑曲霉C-2固體曲活化培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO42. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41. 5g/L、NaCl1. 5g/L、臍橙囊衣粉8g/L和瓊脂18g/L，并且活化用的培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種活化培養基適合用于黑曲霉C-2的活化。上述組分范圍內的培養基效果相似。種子液體培養基包括如下含量的組分(NH4)2SO4 2. 3g/L、MgSO4 0. 8g/L、K2HPO41.5g/L、NaCl1. 5g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣18g/L ;并且種子液體培養基在121°C溫度下滅菌30min制得。此種種子液體培養基適合用于黑曲霉C-2的培養，并且液體深層發酵培養的過程中也可以采用此培養基進行。步驟如下(I)活化將所述選育得到的黑曲霉C-2種子接種于新鮮的固體斜面培養基中進行活化，所述活化過程中，控制固體斜面培養基的PH值為7. 0 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化培養2 3天，用無菌水洗下黑曲霉C-2孢子，制備孢子懸浮液并稀釋至2 3X IO6個/mL，并將其保存在4°C備用；(2)種子培養將上述活化后的黑曲霉C-2孢子懸浮液按5%接種量接種于滅菌的由麥麥麩95重量份、臍橙果渣或果皮粉180重量份、硫酸銨2重量份、硫酸鎂0. 5重量份、磷酸氫二鉀I重量份，以上各組分加入水拌勻并調節水分濕度為60%。(初始pH 6. 5)，30°C培養48h。 (3)固態發酵培養將上述活化的黑曲霉C-2種子曲按10%接種量接入50kg固態發酵培養基中，所述固態發酵培養基各組分與上述固態種子培養基組分相同，種子曲與固態發酵培養基混合均勻后，30°C培養108h，得到黑曲霉C-2固態發酵曲，該固態發酵曲可以通過低溫干燥及粉碎后使用，也可通過0. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得液體酶液后使用。臍橙50kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約40kg含囊衣的臍橙果球，備用。將上述低溫干燥、粉碎的黑曲霉C-2固態發酵曲12kg加入120kg的生理鹽水中，攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min，得到脫囊衣臍橙果球，果球經過分散機處理后的到橙汁胞，該黑曲霉C-2固態發酵曲可以在上述條件下重復使用3 5次。實施例4本實施例考察液體深層發酵液中本發明的黑曲霉C-2菌株CCTCC N0:M 2012160發酵液對柑橘囊衣的降解。采用以下方法制備一種本發明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑制備過程同實施例1。雪峰蜜桔50kg，經過洗滌、熱湯后剝皮，分瓣并清除橘瓣上的脈絡，得到橘瓣約35kg備用。將濃縮的發酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到400C，然后加入35kg去皮除脈絡橘瓣(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度40 45°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 lOOmin，得到全脫囊衣橘瓣，內胞破碎率低，并且保持了柑橘原有的風味及色澤。該酶制劑可以在上述條件下重復使用3 5次。對比例在本對比例中采用的是傳統的真菌培養基，考察液體深層發酵液中本發明的黑曲霉C-2菌株CCTCC NO:M 2012160發酵液對臍橙囊衣的降解效果。傳統的真菌培養基配方稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水IOOOmL煮沸半個小時，紗布過濾，再加15g葡萄糖(活化15g瓊脂)，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝后121°C滅菌20分鐘。采用傳統的真菌培養基配方制備本發明的黑曲霉C-2菌株的酶制劑的步驟與方法與實施例1相同。
臍橙100kg，經過削皮機兩端打孔及削皮后，得到約80kg含囊衣的臍橙果球，平均分為兩份備用。分別將不同培養基發酵濃縮得到的發酵酶制劑以5% 8%的濃度稀釋后攪拌均勻，夾層鍋汽浴升溫到40°C，然后加入削皮的臍橙(料液比1:3)，用檸檬酸調pH值到4. 5，在溫度45 50°C條件下，不斷攪拌并保持恒溫90 120min。通過實施例1到4及對比例的實驗結果可以看出，通過傳統的真菌培養基配方發酵液對臍橙囊衣的沒有觀察到降解效果，而通過本發明所提供的培養基配方發酵液處理得到全脫囊衣的臍橙果球。通過對比試驗發現本發明培養基配方不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業的附加值，有保護了環境，具有經濟和社會雙重意義。綜上，與現有技術相比，本發明的優點在于
1、本發明的降解臍橙囊衣微生物酶制劑可工業化大規模生產，經過除菌、防腐及濃縮處理后，酶制劑在常溫保存6個月其酶活性保持95%以上，使用方便，生產成本低。2、該酶制劑對臍橙囊衣降解作用高效、完全，徹底分解，且不損傷內部橙汁胞，提高生產效率，降低勞動強度，降低生產成本。3、本發明與酸堿工藝相比，生物酶制劑降解囊衣后的營養成分被破壞及流失優于傳統的酸堿法，其保持了臍橙原有的風味及色澤。4、避免了傳統酸堿工藝造成的重金屬等有害物質的殘留的食品質量安全技術壁壘和酸堿排放造成的環境污染，節約大量的水資源，實現了經濟效益、生態效益及社會效益的統一。5、本發明培養基配方不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業的附加值，有保護了環境，具有經濟和社會雙重意義。總體來說，本發明的黑曲霉C-2菌株及其發酵產酶具有生產成本小、使用方便、臍橙囊衣降解效果好等優點，適合在全國柑橘生產企業大范圍推廣使用。本發明對于保護生態環境，提升食品質量安全，保持臍橙原有風味，促進臍橙精深加工發展等方面具有重要意義。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種降解臍橙囊衣酶制劑的制備方法，其特征在于，采用保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2012160的黑曲霉c-2作為發酵菌株，經過液體深層發酵或固態發酵培養制備得到所述降解臍橙囊衣酶制劑。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述液體深層發酵或固態發酵培養之前進一步包括活化、制備孢子懸浮液、種子培養的步驟。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述活化包括將所述黑曲霉C-2接種于活化培養基中進行活化，所述活化培養基的pH值為7. O 7. 2，活化溫度控制在28°C 30°C，活化時間為I 2天；其中，所述活化培養基為以臍橙囊衣粉為碳源的固體斜面培養基，包括如下含量的組分=(NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgSO4 O. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉6g/L 10g/L和瓊脂15g/L 20g/L，并且滅菌制得所述活化培養基。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述制備孢子懸浮液的步驟包括采用無菌水洗下所述黑曲霉C-2的孢子，并稀釋至2 3 X IO6個/mL制得孢子懸浮液，并將所述孢子懸浮液保存備用。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養包括將所述孢子懸浮液接種于種子液體培養基中，控制所述種子液體培養基的PH值為7.O 7. 2，培養溫度控制在28°C 30°C，200r/m培養12 16h ;或將所述孢子懸浮液接種于種子固體培養基中，控制所述種子固體培養基的初始PH值為6. 5，培養溫度控制在28°C 30°C，培養24 48h ；其中，所述種子液體培養基為以臍橙囊衣粉為碳源的培養基，包括如下含量的組分 (NH4)2SO4 2g/L 2. 5g/L、MgS04 O. 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、 臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述種子液體培養基。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述液體深層發酵培養的步驟包括 將經過所述種子培養的含黑曲霉C-2的所述種子液體培養基接種于發酵瓶中進行液體深層發酵培養，液體深層發酵培養基同所述種子液體培養基，發酵培養條件為12h內溫度為30°C，12h后28°C ;pH值為7· O 7· 2 ;壓力位O. 06MPa O. 08MPa ;攪拌速度12h內 180r/m, 12h后200r/m ;通氣量1:1. O 1. 5 ;發酵時間108 120h,制得所述酶制劑。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述固態發酵培養的步驟包括經過所述種子培養的含黑曲霉C-2的所述種子固體培養基接種入固態發酵培養基中， 30°C培養108h，得到黑曲霉C-2固態發酵曲，所述固態發酵曲通過低溫干燥及粉碎后制得所述酶制劑，或通過O. 5mol/L pH=6. 5磷酸緩沖液中浸提獲得所述酶制劑；其中，所述固態發酵培養基通過以下方法制備將麥麩95重量份、稻草秸桿粉90重量份、臍橙果洛或臍橙果皮粉90重量份、硫酸銨2重量份、硫酸鎂O. 5重量份、磷酸氫二鉀I 重量份加入水拌勻并調節水分濕度為60%，得所述固態發酵培養基。
8.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，進一步包括將所述酶制劑經過超濾、濃縮制得濃縮酶制劑，或將所述酶制劑制備成粉劑或顆粒劑。
9.一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基，其特征在于，所述培養基為以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源。
10.根據權利要求9所述的培養基，其特征在于，包括如下含量的組分=(NH4)2SO42g/ L 2. 5g/L、MgSO4 O. 6g/L lg/L、K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉 6g/L 10g/L和瓊脂15g/L 20g/L，并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養基。
11.根據權利要求9所述的培養基，其特征在于，包括如下含量的組分=(NH4)2SO42g/ L 2. 5g/L、MgS04 O. 6g/L lg/L,K2HPO4 lg/L 2g/L、NaCl lg/L 2g/L、臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣15g/L 20g/L ;并且在121°C溫度下滅菌30min制得所述培養基。
全文摘要
本發明公開了一種用于降解臍橙囊衣微生物的培養基及酶制劑的制備方法。其中，該制備方法包括采用保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M 2012160的黑曲霉C-2(Aspergillus sp.C-2)作為發酵菌株，經過液體深層發酵或固態發酵培養制備得到降解臍橙囊衣酶制劑。采用本發明的技術方案，以臍橙囊衣粉或臍橙皮果渣為碳源的培養基對本發明中的微生物進行培養制備酶制劑，制得的酶制劑不僅降解臍橙囊衣效果明顯，還利用臍橙果渣發酵產酶，變廢為寶，既提高了臍橙產業的附加值，有保護了環境，具有經濟和社會雙重意義。
文檔編號A23N15/06GK102994461SQ201210559099
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者趙良忠, 尹樂斌, 李文, 伍桃英, 肖凱, 郭育齊, 周小虎, 蔣瓊華, 周曉潔 申請人:湖南李文食品有限公司