專利名稱：具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及生物防治領(lǐng)域，具體地說，涉及一種具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
近年來，由新疆地區(qū)長期滴灌而產(chǎn)生的次生鹽潰化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。鹽潰化土壤面積已占耕地面積的約30%，嚴(yán)重制約和影響了該地區(qū)棉花的產(chǎn)量和棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因棉種質(zhì)量，環(huán)境條件和管理措施不當(dāng)造成的棉花苗期病害直接威脅棉花的產(chǎn)量。現(xiàn)有應(yīng)對次生鹽潰化土壤和棉花苗期病害的措施具有種種弊端，而且收效不甚顯著。近年發(fā)展起來的生物學(xué)防治方法，因其效果較顯著和對環(huán)境友好等優(yōu)點逐漸受到人們的重視。例如，從植物根圍促生菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria,簡稱PGPR)與植物互作的角度入手，分離出能夠顯著提高棉花在鹽脅迫下的發(fā)芽率，促進棉花根長和干重的增加，分泌植物生長素和溶磷等作用的PGPR解鹽促生菌植生拉烏爾菌(Raoultella planticola)RS-2、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) RS-5、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)RS-35和具有生物防治功能的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SL-13。PGPR在促進植物生長、提高植物抗逆性和富集重金屬離子改良環(huán)境等方面具有重要作用。其中一類具有ACC脫氨酶活性的PGPR菌在降低植物體內(nèi)乙烯的含量，減緩植物衰老，提高植物抗逆性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以上篩選到的三株P(guān)GPR菌植生拉烏爾菌RS-2、產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5和陰溝腸桿菌RS-35均具有ACC脫氨酶活性，能很好的緩解次生鹽潰化對棉花種子發(fā)芽和苗期發(fā)育的影響。篩選到的枯草芽孢桿菌SL-13對棉花苗期病害具有一定的防治作用。前期的研究中，通過組合這兩類菌制備了既具有解鹽促生功能，又具有苗期生防作用的生物菌劑，在田 間試驗也取得了較好的效果，但需要多批次大規(guī)模的菌體培養(yǎng)，費時費力，不利于節(jié)約成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌，其為基因組中整合有ACC脫氨酶基因的枯草芽孢桿菌SL-13。本發(fā)明還提供構(gòu)建上述重組菌的方法將來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5中的ACC脫氨酶基因構(gòu)建到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，如PHCMC04上，并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SL-13中。例如，可以通過電擊法將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SL-13的感受態(tài)細胞中。本發(fā)明還提供所述重組枯草芽孢桿菌在促進植物生長、提高植物抗逆性以及改良根系周圍土壤環(huán)境方面的應(yīng)用。例如，所述植物為棉花等。本發(fā)明還提供一種復(fù)合微生物菌劑，其有效成分為所述具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌，以及其它不發(fā)生相互拮抗作用的促生菌或具有生物防治功能的微生物。本發(fā)明進一步提供一種微生物復(fù)合肥，包括上述復(fù)合微生物菌劑和氮磷鉀肥。任選其它可在作物肥料中使用的添加劑。本發(fā)明獲得的具有解鹽促生作用和生物防治功能的雙效菌株，在鹽濃度為0. 7%的脅迫條件下，進行重組菌的功能分析。用重組菌發(fā)酵液浸泡棉花種子進行發(fā)芽實驗，結(jié)果表明，用重組菌處理后的棉種發(fā)芽率比對照提高了 10. 1%;對棉苗立枯病的抑菌實驗表明，與野生枯草芽孢桿菌SL-13相比，重組菌仍具有較強的對棉苗立枯病的防治效果。


圖1為本發(fā)明ACC脫氨酶基因PCR電泳圖；其中，M:DL2000DNAmarker ；1和2:PCR擴增產(chǎn)物。(DNA Marker 由上至下依次為2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)·
圖2為本發(fā)明穿梭質(zhì)粒pHCMC04電泳圖；其中，M DNA marker I kb ；1 :質(zhì)粒PHCMC04 ；2 =SmaI 單酶切后的 pHCMC04 質(zhì)粒。(DNAMarker 由上至下依次為IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)圖3為本發(fā)明雙酶切ACC脫氨酶基因和質(zhì)粒pHCMC04的電泳圖；其中，M=DNAmarker Ikb ；1 :SpeI和SmaI雙酶切后ACC脫氨酶基因；2 :SpeI和SmaI雙酶切后的PHCMC04質(zhì)粒。(DNA Marker 由上至下依次為10000bp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 30OObp,2000bp, IOOObp)圖4為本發(fā)明ACC脫氨酶基因穿梭表達載體構(gòu)建過程示意圖。圖5為本發(fā)明重組質(zhì)粒的鑒定PCR電泳圖；其中，M DNA markerDL2000 ；1 :以pMD18_Koacds質(zhì)粒為模板；2 :以菌落為模板。(DNAMarker由上至下依次為2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,IOObp)圖6為本發(fā)明重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖；其中，M DNA Marker Ikb ；1 =SpeI和SmaI雙酶切后的重組菌質(zhì)粒。(DNAMarker由上至下依次為IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)圖7為本發(fā)明電轉(zhuǎn)化后菌落PCR產(chǎn)物電泳圖；其中，M =DNAmarker DL2000 ；CK :陽性對照；1_10 :以菌落為模板。(DNA Marker由上至下依次為2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp,250bp,IOObp)圖8為本發(fā)明電轉(zhuǎn)化后重組子雙酶切電泳圖；其中，M =DNAmarker Ikb ；1 :重組質(zhì)粒；2 =SacI和SphI雙酶切后的質(zhì)粒。(DNAMarker的大小由上至下依次為IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)圖9為本發(fā)明重組枯草芽孢桿菌SL-13對立枯絲核病菌的抑菌效果；其中，CK LB培養(yǎng)基對照；1 RS-5菌液；2 :重組枯草芽孢桿菌SL-13 ；3 :野生枯草芽孢桿菌SL-13。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。所用原料均為市售商品。實施例1具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌SL-13的構(gòu)建
1.構(gòu)建ACC脫氨酶基因穿梭表達載體1.1ACC脫氨酶基因的獲得通過在NCBI網(wǎng)站上搜索已經(jīng)報道的ACC脫氨酶基因序列，進行序列比對后，在保守序列處設(shè)計引物，以產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5的基因組DNA為模板進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行測序。序列已提交GenBank，登錄號為FJ357241。1. 2ACC脫氨酶基因及其序列驗證擴增產(chǎn)物ACC脫氨酶基因大小為1017bp。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，擴增片段大小在IOOObp左右，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。1. 3穿梭質(zhì)粒pHCMC04的提取與酶切驗證提取穿梭質(zhì)粒PHCMC04后，用內(nèi)切酶SmaI進行單酶切驗證。瓊脂糖凝膠電泳顯示，條帶大小完全正確，在8000bp左右(圖2)。1. 4ACC脫氨酶基因和pHCMC04質(zhì)粒雙酶切為了使ACC脫氨酶基因與PHCMC04穿梭質(zhì)粒定向連接，用內(nèi)切酶SpeI和SmaI進行同步雙酶切。進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切后基因和質(zhì)粒大小完全正確，分別為8000bp 和 IOOObp (圖 3)。ACC脫氨酶基因穿梭表達 載體的構(gòu)建過程如圖4所示。1. 5ACC脫氨酶基因與質(zhì)粒PHCMC04的連接對酶切后回收的ACC脫氨酶基因和質(zhì)粒PHCMC04進行了連接，由于內(nèi)切酶SmaI切除堿基序列后產(chǎn)生平末端，較難進行連接，因此對連接時間進行了延長，4度條件下連接48小時。連接后直接用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a。1. 6ACC脫氨酶基因穿梭表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a為大量獲得構(gòu)建好的穿梭表達載體，首先將連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a，通過氨芐青霉素抗性平板篩選重組菌，經(jīng)擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，再通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SL-13。1. 7重組子的鑒定1. 7.1 菌落 PCR轉(zhuǎn)化后，挑取陽性菌落為模板進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示，目標(biāo)條帶與對照一致，大小在IOOObp左右(圖5)。1. 7. 2ACC脫氨酶基因和pHCMC04質(zhì)粒雙酶切重組質(zhì)粒雙酶切泳結(jié)果顯示，酶切后出現(xiàn)一個8000bp左右條帶和一個IOOObp左右條帶，與預(yù)期結(jié)果完全相符。結(jié)果表明目標(biāo)基因已正確插入到穿梭質(zhì)粒PHCMC04的多克隆位點SpeI和SmaI之間，證明含ACC脫氨酶基因的穿梭表達質(zhì)粒pHCMC04已構(gòu)建成功(圖6)。2. ACC脫氨酶基因穿梭表達載體電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌SL-132.1枯草芽孢桿菌SL-13電擊法轉(zhuǎn)化條件的摸索在進行電轉(zhuǎn)化前，對枯草芽孢桿菌SL-13的電擊轉(zhuǎn)化條件進行了初步摸索，以獲得最佳電轉(zhuǎn)化條件和較高的電轉(zhuǎn)化效率。2.1.1枯草芽孢桿菌SL-13生長曲線測一般認為芽胞桿菌的感受態(tài)是在細菌生長對數(shù)后期產(chǎn)生的。這種生理狀態(tài)的形成受到感受態(tài)信息素的調(diào)節(jié)，只有當(dāng)細胞達到一定的數(shù)目(一般在對數(shù)后期)并且由細胞分泌到培養(yǎng)基中的感受態(tài)信息素的濃度達到一定臨界值時才能誘導(dǎo)感受態(tài)的形成。從枯草芽孢桿菌SL-13的生長曲線可以看出，當(dāng)0D_為0. 9，培養(yǎng)時間為4. 5小時左右，基本達到對數(shù)后期，應(yīng)收集此時的枯草芽孢桿菌SL-13制備感受態(tài)細胞。2.1. 2質(zhì)粒濃度和感受態(tài)體積據(jù)文獻報道，當(dāng)電擊時間低于4ms時，轉(zhuǎn)化效率會急劇下降。感受態(tài)體積首先選擇了 50iil、80ii I和150 ill三個梯度。在選擇了上述梯度進行電擊后發(fā)現(xiàn)，加入IOOu I和150 u I感受態(tài)細胞與加入50 y I感受態(tài)細胞相比，電擊時間較短，大都達不到4ms。因此，最佳感受態(tài)體積，選擇了 80 ill體系。質(zhì)粒的濃度與感受態(tài)細胞的比例對于電轉(zhuǎn)化條件比較重要。試驗中選擇了質(zhì)粒濃度分別為IOng/ V- l、20ng/ u l、50ng/ ii I和IOOng/ ii I四個濃度梯度。2.1. 3電場強度據(jù)文獻報道，利用高滲透壓法進行電轉(zhuǎn)化，每微克DNA可獲得1. 4X106個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率比正常電擊轉(zhuǎn)化提高近5000倍，最佳電轉(zhuǎn)場強為23KV/cm。因此，本實施例中以此電場強度為依據(jù)，電轉(zhuǎn)化時分別選用了 IlKV/cm、13KV/cm、15KV/cm、17KV/cm、19KV/cm、21KV/cm、23KV/cm和25KV/cm。電轉(zhuǎn)化后涂板，37°C過夜恒溫培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電場強度低于20KV/cm時長出的菌落數(shù)目較多，且較易形成菌苔；電場強度為25KV/cm時，菌體大量死亡，活菌數(shù)目很少。而當(dāng)電場強度為21KV/cm和23KV/cm時，電轉(zhuǎn)化后涂板長出的菌落數(shù)目較為一致。因此選定了這兩個電壓梯度。2.1. 4轉(zhuǎn)化后感受態(tài)細胞復(fù)蘇時間的選擇因質(zhì)粒含有抗生素抗性基因`，將質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入宿主菌體后，細胞較為脆弱，需要用含營養(yǎng)較豐富的復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇。一方面是使細胞恢復(fù)電轉(zhuǎn)化前的生理狀態(tài)，減少菌體死亡量；另一方面，導(dǎo)入宿主菌的質(zhì)粒上含有抗生素基因，用復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇一段時間，可以使質(zhì)粒的上的抗性基因得以表達，便于篩選。復(fù)蘇培養(yǎng)基的成分和復(fù)蘇時間的長短對轉(zhuǎn)化效率有重要影響。復(fù)蘇時間分別選擇了 I個小時、兩個小時和三個小時，共三個復(fù)蘇時間梯度。電轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示結(jié)果表明復(fù)蘇時間為3小時時，能夠獲得較多的轉(zhuǎn)化子。2.1. 5電轉(zhuǎn)化條件的確定在確定了上述質(zhì)粒濃度、感受態(tài)體積、電場強度和復(fù)蘇時間這幾個主要的影響電擊轉(zhuǎn)化的因素后，進行了電擊轉(zhuǎn)化。實驗最終獲得陽性克隆的電擊轉(zhuǎn)化條件是質(zhì)粒濃度IOOng/ill、感受態(tài)體積80iU、場強23KV和3小時的復(fù)蘇時間。2. 2重組質(zhì)粒的鑒定2. 2.1 菌落 PCR電擊法轉(zhuǎn)化后取200 Ul菌液涂板，37°C恒溫培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行鑒定。因宿主菌是枯草芽孢桿菌，為革蘭氏陽性，細胞壁較厚，故PCR前用牙簽挑取少量菌落加入
10U I無菌水中稀釋后煮沸30分鐘，以此為模板進行PCR擴增。PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，3號菌落的條帶較亮，且大小正確，推測其為陽性克隆(圖7)。2. 2. 2重組質(zhì)粒雙酶切選擇內(nèi)切酶SacI和SphI雙酶切重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)了兩個條帶，分別在5500bp和3500bp處，與預(yù)期結(jié)果一致(圖8)。
實施例2重組枯草芽孢桿菌SL-13對棉苗發(fā)芽率影響在0. 7%的鹽脅迫條件下，用0D_為0. 3的重組枯草芽孢桿菌SL-13 (將重組枯草芽胞桿菌SL-13接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于30mL LB培養(yǎng)基(含100 y g/ml氨芐青霉素)中，200rpm培養(yǎng)2小時，加入0. 6mM的IPTG，在37°C下誘導(dǎo)表達5tT8h，4°C保存)、野生枯草芽孢桿菌SL-13和產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5發(fā)酵液對棉花種子浸泡處理，進行了棉花種子培養(yǎng)皿發(fā)芽實驗，其中以LB培養(yǎng)基(CK)作為對照，結(jié)果如下圖。用重組枯草芽孢桿菌SL-13處理的棉種發(fā)芽率比對照提高了 10. 1%，也高于產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5發(fā)酵液及野生型SL-13處理。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入ACC脫氨酶基因的重組枯草芽孢桿菌SL-13具有促進棉花發(fā)芽和提高棉種耐鹽性的作用。(表I)表I不同菌株處理對棉花發(fā)芽率的影響
權(quán)利要求
1.具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，其為基因組中整合有ACC脫氨酶基因的枯草芽孢桿菌SL-13。
2.構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，將來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌RS-5中的ACC脫氨酶基因構(gòu)建到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體PHCMC04上，并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SL-13中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用電擊法將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌SL-13的感受態(tài)細胞中。
4.權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌在促進植物生長、提高植物抗逆性以及改良根系周圍土壤環(huán)境方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為棉花。
6.一種復(fù)合微生物菌劑，其特征在于，其有效成分為權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，以及其它不發(fā)生相互拮抗作用的促生菌或具有生物防治功能的微生物。
7.—種微生物復(fù)合肥，其特征在于，包括權(quán)利要求6所述的復(fù)合微生物菌劑和氮磷鉀肥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有解鹽促生與生物防治功能的重組枯草芽孢桿菌，其為基因組中整合有ACC脫氨酶基因的枯草芽孢桿菌SL-13。本發(fā)明獲得的具有解鹽促生作用和生物防治功能的雙效菌株，在鹽濃度為0.7%的脅迫條件下，進行重組菌的功能分析。用重組菌發(fā)酵液浸泡棉花種子進行發(fā)芽實驗，結(jié)果表明，用重組菌處理后的棉種發(fā)芽率比對照提高了10.1%；對棉苗立枯病的抑菌實驗表明，與野生枯草芽孢桿菌SL-13相比，重組菌仍具有較強的對棉苗立枯病的防治效果。
文檔編號A01N63/02GK103060251SQ201210562810
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者王艷, 鄭嫣然, 余宏燕 申請人:蚌埠豐原涂山制藥有限公司