專利名稱：一種滁菊離體NaN₃誘變育種技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的化學(xué)誘變育種技術(shù)。
背景技術(shù)：
i除菊 Dendranthema morifolium ‘Chuju，，菊科 Asteraceae,菊屬 Chrysanthemum多年生草本植物，是全國四大藥菊之一，安徽著名地道藥材，以花入藥，是一味重要的中藥，屬藥、茶兼用佳品。具有清熱解毒、舒筋活血、護(hù)肝明目，增強(qiáng)人體免疫功能。對(duì)高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化療效顯著。近年研究發(fā)現(xiàn)滁菊對(duì)癌癥等有良好的預(yù)防作用，對(duì)糖尿病有明顯的治療作用。滁菊已經(jīng)成為當(dāng)?shù)刂еa(chǎn)業(yè)，在滁州地區(qū)大面積種植，是重要的中草藥及經(jīng)濟(jì)作物。然而，由于長期的扦插無性繁殖，品種退化及病蟲害嚴(yán)重，采用常規(guī)育種方法無法進(jìn)行品種改良與更新，同時(shí)，在自然條件下，芽變的幾率很低，優(yōu)異變異的幾率更低，遠(yuǎn)不能適應(yīng)菊農(nóng)對(duì)品種產(chǎn)量和品質(zhì)的要求，為了提高滁菊品種的典型性，有關(guān)菊花的組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖雖然已有不少報(bào)道，但是在滁菊新品種的選育尚未見報(bào)道。菊花誘發(fā)突變的方法很多，包括物理誘變和化學(xué)誘變兩大類，主要集中在采用輻射誘變的方法培育菊花新品種，楊保安等(1996)采用60Coy射線輻射與組培相結(jié)合育成‘金光四射’等14個(gè)菊花新品種；王彭偉等(1996)利用菊花葉柄組培能產(chǎn)生單細(xì)胞植株，用60Coy射線輻照對(duì)切花菊進(jìn)行單細(xì)胞突變育種，選育出11個(gè)新品種。郭安熙等(1997)60Coy輻射與組培相結(jié)合，可大幅度提高細(xì)胞突變的顯現(xiàn)機(jī)率。林祖軍等(2000)煙臺(tái)市農(nóng)科院應(yīng)用電子束輻射菊花組培苗誘變育種，獲得花色、花型、花瓣變異后代。日本學(xué)者(2003)用低能重離子注入、激光等在菊花上應(yīng)用，培育出6個(gè)菊花新品種。化學(xué)誘變劑包括烷化劑、堿基類似物、吖啶類(嵌入劑)、無機(jī)或簡單有機(jī)類化合物和生物堿等，采用化學(xué)誘變的方法應(yīng)用于菊花育種的較少，陳發(fā)棣等(2002)和祝朋芳等(2010)分別采用秋水仙素誘變菊花，產(chǎn)生染色體數(shù)目變異的突變體。所獲得的突變體大都是染色體數(shù)目增加，使開花期推遲，因而不能在滁菊品種改良中應(yīng)用。

在滁菊育種中，本發(fā)明采用莖段、莖尖或葉片為外植體，借助于組織培養(yǎng)技術(shù)，在分化增殖的同時(shí)，利用NaN3處理誘導(dǎo)滁菊突變體的產(chǎn)生，通過堿基替換和染色體的斷裂愈合修復(fù)錯(cuò)誤，產(chǎn)生優(yōu)良變異單株，以提高其菊花產(chǎn)量和品質(zhì)，克服滁菊長期無性繁殖出現(xiàn)的品種退化和品種過于單一等問題，這對(duì)擴(kuò)大滁州地道藥材的種植面積，提高滁菊的種植收入，同時(shí)，進(jìn)行滁菊品種的復(fù)壯、改良與創(chuàng)新具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)發(fā)明的目的是通過滁菊莖段、莖尖或葉片為外植體，利用離體培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，在增殖培養(yǎng)基上，通過添加一定濃度的NaN3進(jìn)行化學(xué)誘變處理，使DNA序列發(fā)生堿基替換，導(dǎo)致單鏈斷裂和愈合修復(fù)錯(cuò)誤，使滁菊產(chǎn)生變異，通過生根處理形成完整植株，結(jié)合田間篩選和室內(nèi)鑒定，獲得優(yōu)良滁菊新品種，它不僅克服了長期種植滁菊出現(xiàn)的退化問題，而且可縮短育種年限，快速獲得滁菊優(yōu)良突變體。
一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)，其特征在于所述的誘變育種技術(shù)的核心是滁菊的組織培養(yǎng)和NaN3的化學(xué)誘變。其過程包括①滁菊的離體培養(yǎng)苗的制備、②NaN3化學(xué)誘變、③誘變苗的促壯生根、④煉苗和田間栽培、⑤田間選擇和室內(nèi)鑒定。其具體步驟如下
①離體培養(yǎng)苗的制備
將滁菊幼莖和嫩葉用中性洗衣粉洗滌并沖洗干凈，然后進(jìn)行表面消毒，將消毒后的幼莖用無菌水漂洗4-5次，將帶腋芽莖段或嫩莖尖外植體接種于MS+NAA O.1mgL^1培養(yǎng)基，每瓶接種外植體2-3個(gè)，20-30天可繼代一次，形成大量的無菌苗?；?qū)⒛廴~外植體接種于叢芽分化培養(yǎng)基MS+TDZ O. 1-0. 2mgL-1+ NAAO. 1-0. 2mgL_1或MS+KT3-411^171+NAAO. 1-0. 4mgL_1,培養(yǎng) 40_50d 形成叢芽；
②NaN3化學(xué)誘變
選擇生長15d-20d的無菌苗切成帶腋芽莖段或剝離莖尖接種于含有NaN3誘變劑的MS+TDZ O. 1-0. 2mgL_1+NAA0. 1-0. 2mgL_1 或 MS+KT 3-4mgL_1+NAA0. 1-0. 4mgL_1 叢芽分化培養(yǎng)基上，處理35d-45d，使部分莖尖、腋芽或莖段基部形成叢芽；
③誘變苗的促壯生根
將誘變處理形成的叢芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA O.1mgr1的壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15_20d形成壯苗，將壯苗切成帶腋芽莖段接種在1/2MS+NAA O.1mgr1的培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)7_10d ；
④煉苗和田間栽培
將生根苗移栽到細(xì)沙育苗盤中，煉苗30-40d，而后定植到大田，進(jìn)行常規(guī)管理；
⑤田間選擇和室內(nèi)鑒定
在開花期根據(jù)育種目標(biāo)要求，在田間選擇花朵性狀優(yōu)良的植株，并在室內(nèi)進(jìn)行鑒定。上述方法還具有以下特征1.步驟①中所述的表面消毒的方法為75%乙醇處理30-90sec，然后用O. l%HgCl2溶液滅菌 6-lOmin。2.步驟①中所述的表面消毒的最佳方法為75%乙醇處理60sec，然后用O. l%HgCl2 溶液滅菌 8min。3.步驟②在增殖培養(yǎng)基中添加4-lOmg!/1 NaN3處理35_45d。4.步驟②中在增殖培養(yǎng)基中添加NaN3的最佳處理濃度為6-8mgL_l，處理40_45d。5.步驟①、②和③所述的培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂粉的添加量為O. 45%。6.步驟①、②和③所述離體培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23±2°C，每天光照12h，光照強(qiáng)度 1500-2000Lx。本發(fā)明所述滁菊突變體誘變體系的方法優(yōu)點(diǎn)在于
誘變材料的選擇，滁菊為多年生草本植物，直接在田間進(jìn)行誘變，條件難以控制，即使形成嵌合體也很難得到表現(xiàn)，本發(fā)明利用在分化增殖過程中胚性細(xì)胞、胚性愈傷組織或不定芽為誘變材料，有利于突變體再生植株的形成，提高誘變效率，拓展選擇范圍，降低篩選
工作量。誘變劑的選擇，NaN3是一種點(diǎn)突變的化學(xué)誘變劑，其與DNA的作用方式是堿基替換，使DNA單鏈斷裂和染色體的斷裂愈合修復(fù)錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致點(diǎn)突變的產(chǎn)生。NaN3易透過膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具有誘變效率高、Ml生理損傷小、毒性低、殘效時(shí)間適中(20-30天)等優(yōu)點(diǎn)，是一種安全、高效的化學(xué)誘變。誘變方法的選擇，本發(fā)明利用組織培養(yǎng)技術(shù)，在分化增殖培養(yǎng)基中添加一定濃度的NaN3誘發(fā)胚性細(xì)胞或愈傷組織、腋芽、不定芽突變，有利于NaN3進(jìn)入細(xì)胞、組織和器官，利用該誘變劑殘效期短的特性，連續(xù)誘變，不需要進(jìn)行繼代直接形成叢芽后，再依次轉(zhuǎn)接到壯苗和生根培養(yǎng)基形成完整植株。操作程序簡便、誘發(fā)突變頻率高、效果好。


圖1為發(fā)明葉片外植體誘導(dǎo)叢芽圖。圖2為本發(fā)明莖段基部誘導(dǎo)叢芽圖。圖3為本發(fā)明正常分化增殖培養(yǎng)(左1:CK)與添加不同濃度NaN3叢芽分化比較圖。圖4為本發(fā)明叢芽壯苗圖。圖5為本發(fā)明滁菊生根圖。圖6為本發(fā)明原始品種(CK)與突變體花色、花型比較圖。圖7為本發(fā)明原始品種(CK)與 突變體不同發(fā)育時(shí)期花蕾POD同工酶的比較圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
①將滁菊幼莖用中性洗衣粉洗滌并沖洗干凈，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接著用O. l%HgCl2溶液滅菌6-10min，將消毒后的幼莖用無菌水漂洗4_5次，將帶腋芽莖段外植體接種于MS+NAA O.1mgr1培養(yǎng)基，每瓶接種外植體2_3個(gè)，20_30d可繼代一次，形成大量的無菌苗。②選擇生長15d-20d的無菌苗切成帶腋芽莖段種于MS+TDZ O. 1-0. 2mgr1+NAA. 01-O. 2mgL ^NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3_4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 叢芽分化培養(yǎng)基上，處理35d-45d部分莖尖、葉腋或莖段基部形成叢芽。③將誘變處理形成的叢芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA O.1mgL^1的壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15_20d
培養(yǎng)壯苗。④將上述壯苗切成帶腋芽莖段接種在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培養(yǎng)基上生根，培養(yǎng)7-10d,移栽到細(xì)沙育苗盤中，煉苗30-40d，而后定植到大田，進(jìn)行常規(guī)管理。⑤開花期的田間選擇，可根據(jù)育種目標(biāo)要求，選擇無花心，全舌狀花瓣的變異單株，入選率為3-5%，并進(jìn)行產(chǎn)量和藥用有效成分含量分析。實(shí)施例2
①將滁菊幼莖用中性洗衣粉洗滌并沖洗干凈，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接著用O. l%HgCl2溶液滅菌6-10min，將消毒后的幼莖用無菌水漂洗4_5次，剝離莖尖外植體接種于MS+NAA O.1mgL-1培養(yǎng)基，每瓶接種外植體2_3個(gè)，30_40d可繼代一次，形成大量的
無菌苗。②選擇生長15d-20d的無菌苗切成帶腋芽莖段接種于MS+TDZ O. 1-0. 2mg^1+NAA. 01-0. 2mgL ^NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3_4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 叢芽分化培養(yǎng)基上，處理35d-45d部分莖尖、葉腋或莖段基部形成叢芽。③將誘變處理形成的叢芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA O.1mgL^1的壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15_20d培養(yǎng)壯苗。④將上述壯苗切成帶腋芽莖段接種在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培養(yǎng)基上生根，培養(yǎng)7-10d,移栽到細(xì)沙育苗盤中，煉苗30-40d，而后定植到大田，進(jìn)行常規(guī)管理。⑤開花期的田間選擇，可根據(jù)育種目標(biāo)要求，選擇無花心，全舌狀花瓣的變異單株，入選率為3-5%，并進(jìn)行產(chǎn)量和藥用有效成分含量分析。實(shí)施例3
a、將滁菊嫩葉用中性洗衣粉洗滌并沖洗干凈，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接著用O.1ffigCl2溶液滅菌6-10min，將消毒后的嫩葉用無菌水漂洗4_5次，將嫩葉切成O. 5X0. 3cm2 左右的小塊，接種到 MS+TDZ O. 1-0. 2mgL_1+NAA. 01-0. 2mgr1+NaN3 4-8mgL_1 或MS+KT β-^Γ'+ΝΑΑ. 01-0. 4mgL-1+ NaN3 4-811^171叢芽分化培養(yǎng)基上，每瓶接種外植體2-3個(gè)，培養(yǎng)40-50d，葉片外植體20-30%形成叢芽。b、將叢芽無菌苗切成帶腋芽莖段接種于MS+TDZ O. 1-0. 2mgr1+NAA. 01-0. 2mgL^+NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3-4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 叢芽分化培養(yǎng)基上，處理35d-45d部分莖尖、葉腋或莖段基部形成叢芽。C、將誘變處理形成的叢芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA O.1mgL^1的壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15_20d
·培養(yǎng)壯苗。d、將上述壯苗切成帶腋芽莖段接種在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培養(yǎng)基上生根，培養(yǎng)7-10d,移栽到細(xì)沙育苗盤中，煉苗30-40d，而后定植到大田，進(jìn)行常規(guī)管理。e、開花期的田間選擇，可根據(jù)育種目標(biāo)要求，選擇無花心，全舌狀花瓣的變異單株，入選率為3-5%，并進(jìn)行產(chǎn)量和藥用有效成分含量分析。
權(quán)利要求
1.一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)，其特征在于，在離體培養(yǎng)的條件下利用NaN3對(duì)滁菊進(jìn)行誘變育種。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的誘變育種技術(shù)，其特征在于，所述的誘變育種過程包括① 滁菊離體培養(yǎng)苗的制備、②NaN3化學(xué)誘變、③誘變苗的促壯生根、④煉苗和田間栽培、⑤田間選擇和室內(nèi)鑒定，其具體步驟如下①離體培養(yǎng)苗的制備將滁菊幼莖和嫩葉用中性洗衣粉洗滌并沖洗干凈，然后進(jìn)行表面消毒，將消毒后的幼莖用無菌水漂洗4-5次,然后a)將帶腋芽莖段或嫩莖尖外植體接種于MS+NAAO.1mgL-1培養(yǎng)基，每瓶接種外植體 2-3個(gè)，20-30天再繼代一次，形成大量的無菌苗；b)或?qū)⒛廴~外植體接種于叢芽分化培養(yǎng)基MS+TDZO. 1-0. 2mgL-l+ NAAO. 1-0. 2mgL_l 或 MS+KT 3-4mgL-l+NAA0. 1_0. 4mgL_l，培養(yǎng) 40_50d 形成叢芽(圖1)；②NaN3化學(xué)誘變選擇生長15d-20d的無菌苗切成帶腋芽莖段或剝離莖尖接種于含有NaN3誘變劑的 MS+TDZ O. 1-0. 2mgL-l+NAA0. 1-0. 2mgL_l 或 MS+KT 3-4mgL-l+NAA0. 1-0. 4mgL_l 叢芽分化培養(yǎng)基上，處理35d-45d，使部分莖尖、葉腋或莖段基部形成叢芽(圖2、圖3);③誘變苗的促壯生根將誘變處理形成的叢芽轉(zhuǎn)移到MS+NAA O.1mgL-1的壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15_20d形成壯苗(圖4)，將壯苗切成帶腋芽莖段接種在1/2MS+NAA O.1mgL-1的培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)7_10d (圖 5)；④煉苗和田間栽培將生根苗移栽到細(xì)沙育苗盤中，煉苗30-40d，而后定植到大田，進(jìn)行常規(guī)管理；⑤田間選擇和室內(nèi)鑒定在開花期根據(jù)育種目標(biāo)要求，在田間選擇花朵性狀優(yōu)良的植株(圖6)，并在室內(nèi)進(jìn)行鑒定(圖7)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟①中所述的表面消毒的方法為75%乙醇處理30_90sec,然后用O. l%HgC12溶液滅菌6-lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的表面消毒的最佳方法為75%乙醇處理60sec,然后用O. l%HgC12溶液滅菌8min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟②中，在增殖培養(yǎng)基中添加4-10mgL-l NaN3 處理 35-45d。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟②中，在增殖培養(yǎng)基中添加NaN3最佳處理濃度6-8mgL-l，處理40-45d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟①、②和③所述的培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂粉的添加量為O. 45%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述離體培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度 23±2°C，每天光照12h，光照強(qiáng)度1500-2000LX。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的化學(xué)誘變育種技術(shù)。尤其涉及一種滁菊離體NaN3誘變育種技術(shù)。首先利用滁菊的嫩莖、莖尖或葉片離體培養(yǎng)形成無菌苗；以無菌苗的莖尖和莖段為外植體，在增殖過程中采用疊氮化鈉(NaN3)處理，誘發(fā)突變；將試管苗生根處理并移栽；最后于花期在田間選育優(yōu)良的突變體。此方法能有效地克服無性繁殖植物品種改良的障礙和在自然條件下芽變頻率低，突變范圍小的約束，在很短的時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)良突變體，誘變效率高，對(duì)具有藥用和觀賞價(jià)值的滁菊無性繁殖的遺傳改良有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103039369SQ20131002930
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者張子學(xué), 許峰, 胡能兵, 周玉麗, 何克勤, 林平 申請(qǐng)人:安徽科技學(xué)院