專利名稱：一種柑橘全爪螨若螨的rna干擾方法
技術領域：
本發明涉及ー種柑橘領域，具體地說，特別涉及ー種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法。
背景技術：
柑橘全爪螨是ー種世界性柑橘害螨，對柑橘產量和品質影響較大。目前化學防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施，化學農藥施用不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥，害螨抗藥性直接制約了農藥的使用年限、范圍及防治效果。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是ー種非常具有前途的控制害蟲的新方法,可為生產上更好地防治影響糧食及經濟作物產量的害蟲提供新的途徑，該技術是傳統病蟲害防治技術的新突破，具有廣闊的應用前景，目前許多重要害蟲特異的RNA干擾技術已經構建，但用于柑橘全爪螨特別是其若螨的RNA干擾技術還沒建立。因此，有必要針對柑橘全爪螨建立相應的RNA干擾技術，進而為其防治提供新的思路。

發明內容
本發明的目的在于提供一種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，基于柑橘全爪螨幾丁質基因，合成特異的dsRNA，從而將柑橘全爪螨幾丁質酶基因沉默，使柑橘全爪螨無法完成正常的生長發育，最終實現柑橘全爪螨的控制。為達到上述目的，本發明的技術方案為一種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，其特征在于按照如下步驟完成(I)、柑橘全爪螨若 螨的飼養在培養皿內制成梯級濾紙隔離臺，取洗凈的柑橘葉片，將葉面向下置于濾紙隔離臺上，用濕脫脂棉條壓住葉沿，在葉片上接種橘全爪螨雌成螨，產卵24h后去除雌成螨，將雌成螨產的卵置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為25土 1°C,相對濕度為70% -80%,光周期為L D= (14 10) h連續培養5-7天，得到柑橘全爪螨若螨；(2)、對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理將孵化的若螨挑在新的葉片上，在處理好的葉片上滴一滴dsRNA溶液，用0號毛筆將若螨逐個輕輕挑于液滴上，浸5s后挑出，將浸過液的若螨置于恒溫光照培養箱中控制溫度為25±1°C，相対濕度為70% -80%，光周期L D=(14 10)h培養；其中步驟(2)所用dsRNA溶液為shRNAl溶液，其中shRNAl的堿基序列為shRNAl 5' -GATCGTCTGTTATTTCACC-3' SEQ NO IshRNAl 溶液濃度為 2. 0-6. 0 u g/ml ；(3)、測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。米用上述技術方案,本發明通過處理柑橘全爪螨若螨,將柑橘全爪螨若螨與dsRNA接觸后，觀察RNAi對柑橘全爪螨若螨的蛻皮情況，從而評價RNA干擾對柑橘全爪螨的作用效果。該方法為柑橘全爪螨的控制提供了新的策略，同時也為減少化學農藥使用提供了新的措施，因而具有極其廣闊的應用前景。在上述技術方案中，為了更好的培育柑橘全爪螨，所述步驟(I)中，梯級濾紙隔離臺通過取直徑為9cm的培養皿鋪上0. 7cm厚的海綿，海綿上鋪直徑略小于海綿的濾紙，加水至濾紙邊緣，制成梯級水隔離臺。在上述技術方案中，為了柑橘全爪螨提供夠足夠的食物，所述步驟⑴中，柑橘葉片為剛采摘完整、生長旺盛的柑橘葉片。在上述技術方案中，為了 RNA干擾效果更好，所述步驟(2)中，dsRNA是通過幾丁質酶和綠色熒光蛋白的cDNA序列，設計合成雙鏈dsRNA。有益效果該方法設計新穎、合理，本方法將柑橘全爪螨的生長發育相關基因沉默，使該螨無法完成正常的生長發育，達到防治的效果，進而對柑橘全爪螨的控制發揮重要作用，同時減少化學農藥使用量，因而具有極其廣闊的市場前景。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進ー步的說明實施例1(I)、柑橘全爪螨若螨的飼養將徑為9cm培養皿洗凈擦干，在培養皿上鋪0. 7cm厚的海綿，海綿上鋪直徑略小于海綿的濾紙，加水至與濾紙相平，制成梯級水隔離臺。摘取完整、生長旺盛的柑橘葉片，浸水洗浄，葉面向下置于梯級水隔離臺的濾紙上，用濕脫脂棉條壓住葉沿。在葉片上接種橘全爪螨雌成螨，產卵24h后去除雌成螨，所產卵置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為25°C，相對濕度為70%-80%，光 周期L D=(14 10)h，即為長光照短光照=(14 10)h，連續培養5天。(2)、對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理將若螨挑在新的葉片上，通過在柑橘全爪螨轉錄組數據中發現幾丁質酶基因上存在 SNP(single nucleotide polymorphism)位點，SNP 即單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism)是由于單個核苷酸的改變而導致的核酸序列多態性，經真實性檢測發現確實存在，為檢測幾丁質酶基因與抗性之間的關系，以幾丁質酶為靶標基因進行RNA干擾檢測該基因沉默后對柑橘全爪螨生命活動的影響，根據幾丁質酶和綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA序列，設計合成dsRNA，在每片葉片上滴一滴濃度為2. Oii g/ml的dsRNAshRNAl溶液，用0號毛筆將若螨逐個輕輕挑于液滴上，浸5s后挑出。將處理好的若螨置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為25°C，相対濕度為70%-80%，光周期L D= (14 10)h，即為長光照短光照=(14 10)h，培養24h，以清水處理為對照組。(3)、測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。將處理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鮮葉片上，每片葉片上放置100頭處理后的若螨，每個處理重復3次。將處理放于光照培養箱中培養，控制溫度為25°C，相対濕度為70%-80%,光周期L D=(14 10)h，即為長光照短光照=(14 10)h。每天用雙目鏡觀察它的發育情況，直至若螨全部發育完全為止，另以未處理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨為對照。處理結果發現喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨會有致死性的表型，即僅頭部舊表皮開裂，其余部分仍包裹在舊表皮中。其中該致死表型的致死率為35%，而未處理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蛻皮在內的完整發育史，未出現致死性表型。實施例2(I)、柑橘全爪螨若螨的飼養將徑為9cm培養皿洗凈擦干，在培養皿上鋪0. 7cm厚的海綿，海綿上鋪直徑略小于海綿的濾紙，加水至與濾紙相平，制成梯級水隔離臺。摘取完整、生長旺盛的柑橘葉片，浸水洗浄，葉面向下置于梯級水隔離臺的濾紙上，用濕脫脂棉條壓住葉沿。在葉片上接種橘全爪螨雌成螨，產卵24h后去除雌成螨，所產卵置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為26°C，相對濕度為70%-80%，光周期L D= (14 10) h連續培養7天。(2)、對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理將若螨挑在新的葉片上，根據幾丁質酶和綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA序列，設計合成dsRNA，在每片葉片上滴一滴濃度為6. 0 ii g/ml的dsRNAshRNAl溶液，用0號毛筆將若螨逐個輕輕挑于液滴上，浸5s后挑出。將處理好的若螨置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為26°C，相対濕度為70%-80%，光周期L D= (14 10) h培養24h，以清水處理為對照組。(3)、測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。將處理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鮮葉片上，每片葉片上放置100頭處理后的若螨，每個處理重復3次。將處理放于光照培養箱中培養，控制溫度為25°C，相対濕度為70%-80%,光周期L D=(14 10)h，即為長光照短光照=(14 10)h。每天用雙目鏡觀察它的發育情況，直至若螨全部發育完全為止，另以未處理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨為對照。處理結果發現喂食 dsRNA后的柑橘全爪螨若螨會有致死性的表型，即僅頭部舊表皮開裂，其余部分仍包裹在舊表皮中。其中該致死表型的致死率為25%，而未處理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蛻皮在內的完整發育史，未出現致死性表型。實施例3(I)、柑橘全爪螨若螨的飼養將徑為9cm培養皿洗凈擦干，在培養皿上鋪0. 7cm厚的海綿，海綿上鋪直徑略小于海綿的濾紙，加水至與濾紙相平，制成梯級水隔離臺。摘取完整、生長旺盛的柑橘葉片，浸水洗浄，葉面向下置于梯級水隔離臺的濾紙上，用濕脫脂棉條壓住葉沿。在葉片上接種橘全爪螨雌成螨，產卵24h后去除雌成螨，所產卵置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為24°C，相對濕度為70%-80%，光周期L D= (14 10) h連續培養6天。(2)、對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理將孵化的若螨挑在新的葉片上，根據幾丁質酶和綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA序列，設計合成dsRNA，在每片葉片上滴一滴濃度為4. 0 ii g/ml的dsRNAshRNAl溶液，用0號毛筆將若螨逐個輕輕挑于液滴上，浸5s后挑出。將處理好的若螨置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為24°C，相対濕度為70%-80%，光周期L D= (14 10) h培養24h，以清水處理為對照組。(3)、測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。將處理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鮮葉片上，每片葉片上放置100頭處理后的若螨，每個處理重復3次。將處理放于光照培養箱中培養,控制溫度為25°C,相對濕度為70% -80%,光周期L D=(14 10)h，即為長光照短光照=(14 10)h。每天用雙目鏡觀察它的發育情況，直至若螨全部發育完全為止，另以未處理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨為對照。處理結果發現喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨會有致死性的表型，即僅頭部舊表皮開裂，其余部分仍包裹在舊表皮中。其中該致死表型的致死率為30%，而未處理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蛻皮在內的 完整發育史，未出現致死性表型。
權利要求
1.一種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，其特征在于按照如下步驟完成 (1)、柑橘全爪螨若螨的飼養 在培養皿內制成梯級濾紙隔離臺，取洗凈的柑橘葉片，將葉面向下置于濾紙隔離臺上，用濕脫脂棉條壓住葉沿，在葉片上接種橘全爪螨雌成螨，產卵24h后去除雌成螨，所雌成螨產的卵置于恒溫光照培養箱中，控制溫度為25土 1°C,相對濕度為70% -80%,光周期為L D=(14 10)h連續培養5-7天，得到柑橘全爪螨若螨。
(2)、對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理 將孵化的若螨挑在新的葉片上，在處理好的葉片上滴一滴dsRNA溶液，用0號毛筆將幼螨逐個輕輕挑于液滴上，浸5s后挑出，將浸過液的若螨置于恒溫光照培養箱中控制溫度為25±1°C，相対濕度為70%-80%，光周期L D=(14 10)h培養24h。所用dsRNA溶液為shRNAl 溶液，其中 shRNAl 的堿基序列為shRNAl :5' -GATCGTCTGTTATTTCACC-3' SEQNO IshRNAl 溶液濃度為 2. 0-6. 0 u g/ml ； (3)、測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況 記錄喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蛻皮及存活情況，評價RNA干擾效果。
2.根據權利要求1所述的ー種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，其特征在于所述步驟(I)中，梯級濾紙隔離臺通過取直徑為9cm的培養皿鋪上0. 7cm厚的海綿，海綿上鋪直徑略小于海綿的濾紙，加水至濾紙邊緣，制成梯級水隔離臺。
3.根據權利要求1所述的ー種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，其特征在于所述步驟(I)中，柑橘葉片為剛采摘完整、生長旺盛的柑橘葉片。
4.根據權利要求1所述的ー種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，其特征在于所述步驟(2)中，dsRNA是通過幾丁質酶和綠色熒光蛋白的cDNA序列，設計合成的雙鏈RNA。
全文摘要
本發明公開了一種柑橘全爪螨若螨的RNA干擾方法，按照如下步驟完成(1)柑橘全爪螨若螨的飼養；(2)對柑橘全爪螨若螨進行dsRNA溶液處理；(3)測定處理后柑橘全爪螨若螨蛻皮及存活情況，對RNA干擾效果進行評價。該方法設計新穎、合理，建立的RNA干擾導致柑橘全爪螨無法完成正常蛻皮而死亡，從而達到防治柑橘全爪螨的目的，有利于減少化學農藥使用量，因而具有極其廣闊的應用前景。
文檔編號A01K67/033GK103053480SQ20131003023
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者冉春, 陳飛, 劉浩強, 李鴻筠, 張云飛 申請人:中國農業科學院柑桔研究所