專利名稱：一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種家蠶品種的選育方法，更具體地說，是涉及一種采用分子標記輔助選擇法選育雙限性多絲量家蠶品種的育種方法。
背景技術：
養蠶繅絲在我國已經有五千多年的歷史，是我國最具特色的傳統優勢產業之一，也是我國能夠主導國際市場的少數產品之一，目前，我國的蠶繭和生絲產量均居世界第一，分別占世界總產量的70%左右。蠶絲業不僅對增加農民收入和擴大勞動就業方面具有重要的作用，而且蠶的食物一桑樹在環境保護、退耕還林等方面也具有重要的作用和意義，因此，許多地區在生態保護和退耕還林中，把發展蠶桑業作為首選和重點項目。家蠶新品種選育是蠶絲業科技進步的基礎和核心之一，在新中國成立后，我國的家蠶品種選育取得了巨大的成就，在全國范圍內先后進行了 4-5次蠶品種的更新換代，極大地促進了蠶絲業的發展。然而，隨著我國經濟的快速發展，勞動力成本也隨之增加，在蠶種場繁育生產用一代雜交蠶種的過程中，蛹期的性別鑒定工作量巨大，而采用限性品種時，在幼蟲期即可根據期斑紋將雌雄性別分開，從而大大減少蛹期的工作量，達到降低生產成本的目的。目前，生產上使用的限性品種主要為中系限性品種，且主要為強健性的夏秋用品種如秋豐、871等，其絲量與春用品種還是有一定的差距。生產中使用的限性日系品種很少。隨著分子標記技術的發展，本課題組主要成員參與了家蠶SSR分子遺傳連鎖圖的構建，其中第的普斑(+P)、素斑(P)等位基因已經被定位(Xuexia Miao等，PNAS，2005，102 (45): 16303-16308)，并篩選了家蠶繭絲性狀相關的數量性狀位點(Quantitativetrait locus, QTL)的分子標記(Shuai Zhan等,BMC Genomics, 2009Aug21; 10:389 ;王修業，中國農業科學院研究生院碩士論文，2010年)。到目前為止，還沒有將分子標記技術用于家蠶雙限性多絲量蠶品種選育的報道。

發明內容
解決的技術問題:本發明的目的是為了解決分子標記用于家蠶雙限性多絲量蠶品種選育的技術問題，提供一種采用分子標記輔助選擇法選育雙限性多絲量家蠶品種的育種方法。技術方案:為了實現上述目標，本發明的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其技術方案包括如下步驟:(I)以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個體與“菁松”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個體與回交I代中雌性個體連續回交，獲得回交8代；對每一世代在飼育過程中進行農藝性 狀選擇，留種個體采用分子標記選擇絲量性狀的基因型，獲得遺傳背景與“菁松”相同，且為限性品種的JsQXian ；
(2)以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個體與“皓月”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個體與回交I代中雌性個體連續回交，獲得回交8代后自交2代；對每一世代在飼育過程中進行農藝性狀選擇，留種個體采用分子標記選擇其斑紋性狀和絲量性狀的基因型，自交后代選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區繼代。獲得遺傳背景與“皓月”相同，且為限性品種的HyQXian ；(3)將目標材料JsQXian與目標材料HyQXian進行雜交，獲雜交I代，即為雙限性
多絲量家蠶品種。步驟(I)、(2)所述的連續回交為至少8次。有益效果:本發明所提供的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法與傳統的雜交回交育種技術相比具有如下優點:傳統的雜交育種技術存在工作量大，選擇可靠性差，選育周期長，目前常用的生產用春用多絲量家蠶品種如菁松、皓月、蘇鎮、春光等多為非限性品種或者僅中國系統為限性品種且主要是強健性，絲量相對較少的夏秋用蠶品種如秋豐、871等。本發明通過分子標記輔助選擇輪回親本的遺傳背景和供體親本的目標性狀，可在3-4年內快速高效培育出高產、優質、繁育過程中用工省的雙限性多絲量家蠶新品系。本發明方法育成的品種“JsQXian” ；主要特征為，中系二化性四眠品種，幼蟲為限性斑紋，雌為普通斑，雄為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發育整齊，老熟齊涌，體質強健，絲量多，與菁松相當。催青經過10日，幼蟲期經過23-24天，蛹期經過14-15天，繭形橢圓，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.9-2.1g,繭層率24%左右，繭絲長1350米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產卵性能良好，單蛾卵數500-600粒，與HyQXian對交需推遲2日開始飼養。

育成的品種“HyQXian” ；主要特征為，日系二化性四眠品種，幼蟲為限性斑紋，雌為普通斑，雄為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發育整齊，老熟較齊，體質強健，絲量多，與皓月相當。催青經過10日，幼蟲期經過24-25天，蛹期經過15-16天，繭形淺束腰，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.8-2.0g,繭層率23.5%左右，繭絲長1300米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產卵性能良好，單蛾卵數500-600粒，與JsQXian對交需提前2日開始飼養。


圖1.分子標記S0106在HyQXian選育過程中對繭絲性狀的選擇的擴增效果。L 皓月；2.(755X 皓月)Fl ;3.755 ;4-5.回交 I 代；6-7 ;回交 2 代；8-9.回交 3代；10-11.回交4代；12-13.回交5代；14-15.回交6代；16-17.回交7代；18-19.回交8代；20-24.自交后純合品種；圖2.分子標記S0214在HyQXian選育過程中對斑紋性狀的選擇的擴增效果圖。L 皓月；2.(755Χ 皓月)Fl ;3.755;4-5.回交 I 代；6-7;回交 2 代；8-9.回交 3代；10-11.回交4代；12-13.回交5代；14-15.回交6代；16-17.回交7代；18-19.回交8代；20-24.自交后純合品種
具體實施例方式實施例1:一、對采用材料的說明已有的研究結果表明，家蠶繭絲性狀有多基因控制，目前已經篩選到多個位點的分子標記(王修業.家蠶繭絲相關性狀QTL和無鱗毛基因nlw的定位.中國農業科學院研究生院碩士論文，2010 年 5 月；Shuai Zhan,等.An integrated genetic linkage map forsilkworms withthree parental combinations and its application to the mapping ofsingle genes and QTL BMCGenomics2009，10:389)。(一)、限性品種資源755(公知公用，《中國家蠶品種志》農業出版社，1987年5月，第262頁)；1、來源:中國農業科學院蠶業研究所選育的家蠶品種，目前生產上已經不再使用，僅用作育種素材 。2、主要特征特性:中國系統、二化性，四眠。良卵率90.8%，普通孵化率91.0%，壯蠶體色青白，限性普通斑，雌普通斑，雄素斑，食桑旺盛，行動活潑。繭橢圓形，全繭量1.6g，繭層量0.4g，繭絲長1147m。催青經過10日，幼蟲期經過24日7小時，蛹期經過17日。(二 )、輪回親本菁松、皓月菁松X皓月是由中國農業科學院蠶業研究所選育，在我國使用最為廣泛的一對家蠶雜交組合，它的產量高、絲質優、體質強健，菁松幼蟲為素斑，皓月幼蟲為普通斑，是目前蠶業生產上使用最多的蠶品種。二、具體實施步驟:(I)、用菁松為輪回親本，755為限性斑紋性狀供體，用755雌與菁松雄進行雜交后，得其Fl雌再與菁松雄連續回交，飼育過程中對品種的農藝性狀進行綜合篩選，采用分子標記對目標性狀進行篩選，獲得遺傳背景與菁松相同，且幼蟲為限性斑紋的JsQXian。(2)用皓月為輪回親本，755為限性斑紋性狀供體，用755雌與皓月雄進行雜交后，得其Fl雌再與皓月雄連續回交8代后，自交2代，選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區繼代。飼育過程中對品種的農藝性狀進行綜合篩選，采用分子標記對目標性狀進行篩選，獲得遺傳背景與皓月相同，且幼蟲為限性斑紋的HyQXian。(3)用JsQXian與HyQXian進行雜交，獲得雜交I代，即為雙限性多絲量家蠶品種。三、對 多絲量及斑紋基因的PCR的檢測提取待檢測的家蠶蛾的基因組DNA，取20_50ng作模板，用與繭絲性狀主效QTL連鎖的SSR或STS標記C232S1、S0106、S2304、S2324 (4對引物均為公知公用，分別見文獻:王修業.家蠶繭絲相關性狀QTL和無鱗毛基因nlw的定位.中國農業科學院研究生院碩士論文，2010 年 5 月；Shuai Zhan, Jianhua Huang, Qiuhong Guo, Yunpo Zhao, WeihuaLi，Xuexia Miao，Marian R Goldsmith，Muwang Li and Yongping Huang.An integratedgeneticlinkage map for silkworms with three parental combinations and itsapplication to the mapping ofsingle genes and QTLBMC Genomics2009，10:389)，用與等位基因普通斑(+P)/素斑(P)連鎖的SSR標記S0215和S0214(公知公用，間文獻XuexiaMiao 等，Simple sequencerepeat-based consensus linkage map of Bombyx mor1.PNAS,2005，102 (45): 16303-16308)檢測日本系統品種中的斑紋基因。
C232S1 引物序列:左端引物序列:5'-GTCCGGTATACGCGAACATT-3'右端引物序列:5'-GGCGATACCGTTGTTTCATT-3'SO106引物序列:左端引物序列:5'-GCATTCAAACCTAAGTCAAATCAAA-3'右端引物序列:5'-TGGCACAGTCTTTATGTTTGGCT-3'S2304引物序列:左端引物序列:5'-ATGACAATACGCTTTATCACCAGG-3'右端引物序列:5'-ATGGGTTAGTTCGCTCGTCG-3'S2324引物序列:左端引物序列:5'-CGTTTATACCATCGCACCGC-3'右端引物序列:5'-TTATGGGTACGCATACAGTCCAA-3'S0214引物序列:左端引物序列:5'-CAGGTCGGTTGATGCCCATT-3'右端引物序列:5'-CATCCGTCATCCACAAGCCT-3'S0215引物序列:左端引物序列:5'-CAGCGTGACCAAGCGGAATG-3'右端引物序列:5'-CCGAAAITTGTAATGTAAAAGAACTCA-3'PCR反應程序按照文獻的程序:95°C變性3min，63°C退火40s，72°C延伸Imin ；16個 Touchdown 循環，94°C、45s，退火溫度依次遞減 0.5°C直到 56°C 40s，72°C Imin ；94°C 40s,56°C 40s, 72°C lmin，24 個循環；72°C IOmin0 PCR 產物用 eGene 的 HAD-GT12 全自動毛細管核酸分析系統檢測。回交過程中BCl代選擇的個體PCR產物經HAD-GT12全自動毛細管核酸分析系統檢測為2條帶的，為雜合型，為I條帶的為純合型，由于是與菁松、皓月回交，因此，繭絲性狀的標記分別選擇與菁松、皓月一致的純合型條帶，淘汰雜合型條帶個體，從而純合基因。(附圖1為分子標記S0106在HyQXian選育過程中對繭絲性狀的選擇的擴增效果。)斑紋限性的性狀選擇中，由于菁松的素斑相對普斑為隱性性狀，因此，在菁松回交過程中，無需進行特別的選擇，只需選擇農藝性狀即可。而對于皓月回交的過程中，所有個體的表現型均為普通斑，因此，需要選擇S0214和S0215表現為雜合的個體繼代，用皓月的雄連續回交8代后自交后代，選擇S0214和S0215均表現與755 —致的純合型繼代，淘汰雜合型位點的個體，從而保證第二染色體上的P位點為純合型素斑基因P。(附圖2.分子標記S0214在HyQXian選育過程中對斑紋性狀的選擇的擴增效果圖。)SEQUENCE LISTING〈110〉江蘇科技大學〈120〉一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法〈130〉

<160>12<170>PatentIn version3.3<210>權利要求
1.一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個體與“菁松”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個體與回交I代中雌性個體連續回交，獲得回交8代；對每一世代在飼育過程中進行農藝性狀選擇，留種個體采用分子標記選擇絲量性狀的基因型，獲得遺傳背景與“菁松”相同，且為限性品種的JsQXian ； (2)以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個體與“皓月”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個體與回交I代中雌性個體連續回交，獲得回交8代后自交2代；對每一世代在飼育過程中進行農藝性狀選擇，留種個體采用分子標記選擇其斑紋性狀和絲量性狀的基因型，自交后代選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區繼代，獲得遺傳背景與“皓月”相同，且為限性品種的HyQXian ； (3)將目標材料JsQXian與目標材料HyQXian進行雜交，獲雜交I代，即為雙限性多絲量家蠶品種。
2.根據權利要求1所述的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其特征在于:步驟(I)、(2)所述的連續回交為 至少8次。
全文摘要
一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，包括如下步驟以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交，獲得限性品種的JsQXian；以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個體為斑紋限性性狀供體親本進行雜交對每一世代在飼育過程中進行農藝性狀選擇，獲得限性品種的HyQXian；將目標材料JsQXian與目標材料HyQXian進行雜交，即為雙限性多絲量家蠶品種。本發明通過分子標記輔助選擇輪回親本的遺傳背景和供體親本的目標性狀，可在3-4年內快速高效培育出高產、優質、繁育過程中用工省的雙限性多絲量家蠶新品系。
文檔編號A01K69/04GK103081872SQ20131004273
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者李木旺, 侯成香, 譚安江, 黃勇平 申請人:江蘇科技大學