專利名稱：家蠶滯育品種的轉基因方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、生物工程領域，特別是涉及一種家蠶滯育品種的轉基因方法。
背景技術：
轉基因技術是現代生物學研究中的一項重要的技術，它能將人工分離或修飾過的基因 有效的導入生物體基因組中，是實現異源或異位表達最為有力的遺傳工具。在后基因組時 代，轉基因技術在功能基因研究、生物素材創新與新產品開發，以及現代遺傳育種等方面 具有不可替代的優勢。
家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物。家蠶基因組框架圖(2004)和精細圖 譜(2008)繪制工作的相繼完成，標志著人類對家蠶的研究和認識正式進入后基因組時代。 利用高效穩定的技術大規模地研究重要基因的功能成為后基因組時代家蠶研究的重要課 題。同時，家蠶是理想的"昆蟲工廠"，利用現代基因工程技術開發絲腺生物反應器具有 巨大的市場前景。在功能基因研究和家蠶生物工廠并駕齊驅的道路上，家季轉基因技術無 疑是探索解析家蠶生長發育奧秘、奠定家蠶作為鱗翅目模式昆蟲的理論基礎，開發家蠶生 物反應器、拓展蠶業產業鏈、促進科技成果實用化進程中最為有力的武器。
自2000年日本科學家報道首次成功培育轉基因家蠶以來，國內外已陸續報道轉基因家 蠶成功的消息。但是迄今為止的報道中，絕大多數轉基因實驗都是利用多化性家蠶品系， 主要是因為多化性家蠶品種所產的卵為非滯育卵，其不需要任何的人工處理便能夠在適當 的溫濕度下連續發育直至孵化，這個特點極大地方便了轉基因實驗中的操作控制和轉基因 后的進一步實驗研究。但這些多化性家蠶品系與生產上普遍使用的實用家蠶品種比較，具 有絲量少，絲質差等經濟性狀差的特點。故利用多化性家蠶品種作為轉基因的材料具有以 下兩個方面的明顯缺陷①多化性家蠶品種經濟性狀差，利用轉基因所創造的附加性狀在 產量和質量上都無法達到直接推廣應用的標準，以多化性蠶種為原始材料的轉基因品系只 能作為育種原始材料，作為某一相關優良性狀的原始載體的角色運用于漫長而艱辛的傳統 育種之中。②多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續的詞養繁殖，這 樣需要浪費大量的人力和物力對獲得的轉基因家蠶品系進行維持和繼代，同時也大大增加 了獲得的轉基因家蠶品種資源丟失的風險。因此，利用多化性家蠶品種不但不利于進行大 規模的轉基因實驗，而且很難使研究成果快速轉化到生產實際中去。家蠶滯育品種為一化
3或二化性品系，在產卵以后便進入一個比較漫長的滯育期，這樣極有利于它們維持和繼代。另外生產上的實用家蠶品系幾乎都是滯育品系，多為一化或二化性品系。如利用普通的家蠶滯育品系進行轉基因研究可以克服多化性家蠶品種轉基因研究中所述的第二個缺陷，而利用生產上的實用家蠶滯育品系原種進行轉基因研究則可以克服多化性家蠶品種轉基因研究中所述的所有缺陷。
此外，在長達五千年的人工馴化和改造過程中，人類積累了豐富的表型突變和生理突變家蠶遺傳資源，這些遺傳資源對于重要基因功能的解析無疑是一筆寶貴的財富。對這些突變資源進行轉基因挽救操作是研究和利用相關基因必不可少的一個環節，而目前保存的突變遺傳資源中，絕大多數都是滯育品種。因此，不論是在功能基因研究等基礎研究領域，還是在生物工廠開發等應用研究領域，家蠶滯育品種的轉基因研究都具有重要意義。
生產實際中，滯育卵一般在產卵后約16-20小時左右利用常規的即時浸酸法或者經過長期的低溫冷藏能有效解除它們的滯育。而目前最有效的家蠶轉基因顯微 i射時間是在產卵后3-6小時，因為轉基因操作后卵上會上留下注射小孔，如果在注射后利用常規的即時浸酸法會導致鹽酸滲入蠶卵內，從而致死，根本無法實現家蠶滯育品種的轉基因研究，轉基因注射留下的小孔也使得蠶卵不能長期放置。因此，家蠶滯育品種卵的滯育，給轉基因操作帶來很大的限制。到目前為止，在國內外眾多的家蠶轉基因文獻報道中，僅有日本學者Satoshi Inoue等(2004)采用在產卵后4小時浸酸之后再注射的方法成功實現了滯育種的轉基因。但是重復實驗發現在產卵后4小時浸酸延誤了注射時間導致轉化率明顯偏低，于是我們探索了在蠶卵受精后立即進行浸酸的方法并成功的獲得相應的轉基因方法[家蠶滯育種的早期浸酸轉基因方法，本發明申請人已于2007年12月21日申請專利(申請號200710303904.1)，現已公開]。同時，我們還利用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性，并結合常規的家蠶轉基因技術，巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉基因蠶[家蠶滯育種的低溫催青轉基因方法，本發明申請人已于2007年12月21日申請專利(申請號200710303903.7)，現已公開]。雖然上述兩個專利已分別提供了相應的滯育種轉基因方法，據此也可以實現大多數滯育種的轉基因，但是其提供的方法都有各自的局限和缺點家蠶滯育種的早期浸酸轉基因方法(申請號200710303904.1)由于需要浸酸，顯微注射后孵化率較低，而且早期浸酸的效果在品種間的差異比較大；家蠶滯育種的低溫催青轉基因方法(申請號200710303903.7)雖然在注射后孵化率和多化性蠶卵不相上下，但是低溫催青的效果在品種間的差異非常大，對一化性和日系二化性蠶品種基本上不適用。這些缺點極大的限制了家蠶轉基因技術在功能基因研究和生物反應器開發等實用研究中的大規模應用。
因此，克服和解決上述專利中所提供方法的局限性，探索出一種更為簡便有效的、適合于絕大多數蠶品種的家蠶滯育種轉基因方法就顯得尤為必要。簡便有效的家蠶滯育種轉基因方法，也是建立穩定高效的家蠶轉基因技術體系、推進規模化功能基因研究、實現家蠶轉基因成果快速產業化的迫切需求。

發明內容
本發明的目的在于提供一種簡便有效、適合于絕大多數家蠶品種的家蠶滯育種轉基因方法。該路線方法利用親代所處環境條件與子代蠶卵的滯育性的關系，使泰代家蠶在經嚴格控制的特殊環境條件下進行催青、詞養和種繭保護，并采用適當的交配方式以獲得非滯育的子代蠶卵，得到的非滯育性蠶卵參照非滯育家蠶卵胚胎顯微注射的轉基因方法進行轉基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉基因蠶。
本發明首次系統地調查了親代所處的環境條件對家蠶滯育品種的子代蠶卵化性的影響，獲得了通過嚴格控制親代催青、飼養和種繭保護的環境條件使家蠶滯育品種產下非滯育的蠶卵的條件，并將這項技術與家蠶胚胎顯微注射技術，熒光檢測與分子生物學操作技術相結合，巧妙地突破了家蠶滯育品種轉基因技術的瓶頸，建立了一種家蠶滯育品種的轉基因技術路線方法。本發明提供的滯育種轉基因方法簡便有效、適合于絕大多數家蠶品種。
本發明家蠶滯育品種的轉基因方法，依次通過以下步驟實現
(1) 將家蠶滯育品種的蠶卵通過人工孵化處理后，置于15'C恒溫、相對濕度75%、黑暗的環境中催青至孵化；
(2) 逐天收集孵化的蟻蠶，置于23'C恒溫、相對濕度85%、黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結束；
(3) 將四齡起蠶轉移至27'C恒溫、相對濕度75%、光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟；
(4) 將上蔟后的家蠶轉移至25'C恒溫、相對濕度75%、光照的環境中，待其化蛹完畢后削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26'C恒溫、相對濕度75%、光照的環境中進行種繭保護；
(5) 待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25'C的環境中保護；
(6) 以收集蠶卵時間開始記時，于收集后2h-4h用顯微注射儀將10-15nL、總濃度400ng/uL的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼上注射留下的小孔；
(7)將注射完成的蠶卵在35-37y。的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25。C、相對濕度85%以上的濕度條件下，進行催青直到孵化，詞養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得滯育性的G1代蠶卵，G1代蠶卵經即時浸酸處理后于胚胎發育第六天在熒光顯微鏡下掃描獲得轉基因個體；最后將獲得的轉基因個體正常飼養、繼代，即完成家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作。
上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。
本發明的優點是-
本發明關于家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作方法，首次利用親代所處環境條件與子代蠶卵的滯育性的關系，使親代家蠶在經嚴格控制的特殊環境條件下進行催青、飼養和種繭保護，并采用適當的交配方式以獲得非滯育的子代蠶卵，并參照和結合非滯育家蠶卵胚胎顯微注射的轉基因方法進行轉基因，巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的瓶頸，克服了之前有關滯育種轉基因方法的缺陷。本發明的優點是，利用上述技術路線，'可以簡便有效地實現絕大多數家蠶滯育品種的轉基因操作。而利用家蠶滯育品種創造的轉基因蠶品系，
可以克服多化性品系轉基因家蠶的所有缺點，其具有以下的明顯優勢①家蠶滯育品種，
尤其是生產上采用的實用性品種，各種經濟性狀都比較良好，外源或內源的轉基因目標性狀也非常優良，在利用這些家蠶品種作為生物反應器時，其目的產物的產量與質量遠遠超
過多化性品系的轉基因家蠶；②現今蠶業生產中所采用的蠶品種多為滯育性的一化或二化性品種，在利用轉基因技術創造新的遺傳素材或品種資源時，直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，大大的縮短了育種的周期，也節約了大量的人力和物力；③滯育性家蠶在自然條件下一年繁殖一個或兩個世代以后便自動進入一個漫長的滯育期，要保存其品種資源只需要在一年內進行一次或兩次的飼養和簡單的蠶種管理即可，對其生產和管理可以根據計劃的需要人為地進行調節，而且實用性家蠶品種的各項性狀通過長期育種的選擇，都比較穩定，所以利用這些家蠶滯育品種作為家蠶轉基因研究的材料，可以簡化資源保存的工作，降低品種資源丟失的風險，增強轉基因工作的計劃性，使轉基因工作與實際生產更加緊密地結合。④家蠶滯育品種，特別是生產上的實用滯育品種一般個體較大，其蠶卵也遠大于一般的多化性家蠶品種，抗逆性強，具有耐注射的特性。此外，家蠶滯育品種的蠶卵一般具有一層著色的漿膜，可以降低熒光檢測時激發光對胚胎的傷害，這些特點都降低了家蠶轉基因操作的難度，有助于轉基因的成功。其次，目前保存的表型突變和生理突變家蠶遺傳資源絕大多數都是滯育種，本發明為研究和利用這些寶貴的遺傳資源奠定了堅實的技術基礎。最后，轉基因技術已經在果蠅、伊蚊、蜜蜂等20余種昆蟲中建立，但是報道比較多的蠅、蚊、蜂等昆蟲多屬于多化性，所以本發明也將為其他昆蟲特別是卵滯育性的鱗翅目昆蟲轉基因技術的建立提供有用借鑒和參考。
具體實施方式
-
實施例h
利用家蠶滯育品種"大造"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化
處理后置于15'C恒溫、相對濕度75%、絕對黑暗的環境中催青至孵化。逐禾收集孵化的蟻蠶，置于23'C恒溫、相對濕度85%、絕對黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結束。將四齡起蠶迅速轉移至27'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟。將上蔟后的家蠶轉移至25'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中，待其化蛹完畢后立即削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中進行種繭保護。待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25。C的環境中保護。于產卵后3h用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nL、總濃度400ng/uL的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的;w'g^^ac載體和輔助載體，共同注射進入325粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經35。/。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%的高濕度環境中催青孵化，將孵化的169頭GO代蟻蠶用人工飼料收集伺養至化蛾，獲得的152頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得81蛾圈Gl代蠶卵，用01y卿u^電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 81蛾圈Gl代蠶卵并獲得30個陽性蛾圈，共獲得254頭家蠶滯育品種"大造"的轉基因蠶，轉化效率為37. 04%。實施例2:
利用家蠶滯育品種"碧 波"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化處理后置于15t:恒溫、相對濕度75%、絕對黑暗的環境中催青至孵化。逐天收集孵化的蟻蠶，置于23"C恒溫、相對濕度85%、絕對黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結束。將四齡起蠶迅速轉移至27'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟。將上蔟后的家蠶轉移至25X:恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中，待其化蛹完畢后立即削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26。C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中進行種繭保護。待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25t:的環境中保護。于產卵后2h用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nL、總濃度400ng/uL的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的載體和輔助載體，共同注射進入506粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經36冗的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%的高濕度環境中催青孵化，將孵化的295頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的237頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得113蛾圈Gl代蠶卵，用01ympuss電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 50蛾圈Gl代蠶卵并獲得14個陽性蛾圈，共獲得263頭家蠶滯育品種"碧 波"的轉基因蠶，轉化效率為28. 00%。實施例3:
利用家蠶滯育品種"872"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化處理后置于15'C恒溫、相對濕度75%、絕對黑暗的環境中催青至孵化。逐天收集孵化的蟻蠶，置于23'C恒溫、相對濕度85%、絕對黑暗的環境中用桑葉或者人工詞料詞養至三眠結束。將四齡起蠶迅速轉移至27'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟。將上蔟后的家蠶轉移至25"C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中，待其化蛹完畢后立即削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中進行種繭保護。待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25"C、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25。C的環境中保護。于產卵后4h用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nL、總濃度400ng/uL的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的綠色熒光蛋白標記的;w'^7^3c載體和輔助載體，共同注射進入813粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經37。/。的甲酸蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%的高濕度環境中催青孵化，將孵化的349頭G0代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾，獲得的301頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得184蛾圈Gl代蠶卵，用Oly即uss電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 64蛾圈Gl代蠶卵并獲得9個陽性蛾圈，共獲得128頭家蠶滯育品種"872"的轉基因蠶，轉化效率為14. 06%。
實施例4:
利用家蠶滯育品種"秋豐"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化處理后置于15'C恒溫、相對濕度75%、絕對黑暗的環境中催青至孵化。逐天收集孵化的蟻蠶，置于23。C恒溫、相對濕度85%、絕對黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結
8束。將四齡起蠶迅速轉移至27'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中用桑葉或者人工 飼料詞養至上蔟。將上蔟后的家蠶轉移至25'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中， 待其化蛹完畢后立即削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26。C恒溫、相對濕度75%、絕對光照 的環境中進行種繭保護。待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配 4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一 次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25'C的環境中保護。于產卵后4h用E卯endorf顯微注射儀， 將10-15nL、總濃度400ng/uL的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的綠色熒光蛋白標記的 pi^7^^載體和輔助載體，共同注射進入339粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經 35y。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%的高濕度環境中催青孵化，將 孵化的103頭G0代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾，獲得的75頭G0代蠶蛾，通過自交或回 交共獲得41蛾圈G1代蠶卵，用01ympu^電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 41蛾圈Gl代 蠶卵并獲得ll個陽性蛾圈，共獲得380頭家蠶滯育品種"秋豐"的轉基因蠶，轉化效率 為26.83%。 實施例5:
利用家蠶滯育品種"871"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化 處理后置于15〔恒溫、相對濕度75%、絕對黑暗的環境中催青至孵化。逐天收集孵化的蟻 蠶，置于23'C恒溫、相對濕度85%、絕對黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結 束。將四齡起蠶迅速轉移至27t恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中用桑葉或者人工 飼料詞養至上蔟。將上蔟后的家蠶轉移至25'C恒溫、相對濕度75%、絕對光照的環境中， 待其化蛹完畢后立即削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26。C恒溫、相對濕度75%、絕對光照 的環境中進行種繭保護。待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配 4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一 次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25。C的環境中保護。于產卵后3h用Eppendorf顯微注射儀， 將10-15nL、總濃度400ng/uL的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的 /7ig^^sc載體和輔助載體，共同注射進入447粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經 36。/。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%的高濕度環境中催青孵化，將 孵化的176頭G0代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾，獲得的141頭G0代蠶蛾，通過自交或回 交共獲得68蛾圈Gl代蠶卵，用01y卿u^電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選f 68蛾圈Gl代 蠶卵并獲得15個陽性蛾圈，共獲得128頭家蠶滯育品種"871"的轉基因蠶，轉化效率為 22.06%。
權利要求
1、一種家蠶滯育品種的轉基因方法，其特征在于依次通過下列步驟實現(1)將家蠶滯育品種的蠶卵通過人工孵化處理后，置于15℃恒溫、相對濕度75％、黑暗的環境中催青至孵化；(2)逐天收集孵化的蟻蠶，置于23℃恒溫、相對濕度85％、黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結束；(3)將四齡起蠶轉移至27℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟；(4)將上蔟后的家蠶轉移至25℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中，待其化蛹完畢后削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中進行種繭保護；(5)待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25℃、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25℃的環境中保護；(6)以收集蠶卵時間開始記時，于收集后2h-4h用顯微注射儀將10-15nL、總濃度400ng/uL的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼上注射留下的小孔；(7)將注射完成的蠶卵在35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25℃、相對濕度85％以上的濕度條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得滯育性的G1代蠶卵，G1代蠶卵經即時浸酸處理后于胚胎發育第六天在熒光顯微鏡下掃描獲得轉基因個體；最后將獲得的轉基因個體正常飼養、繼代，即完成家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作。上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。
全文摘要
一種家蠶滯育種的轉基因蠶的制作方法利用親代所處環境條件與子代蠶卵的滯育性的關系，利用在轉基因操作的前一個世代對滯育性家蠶品種進行環境條件的控制以改變該品種在轉基因操作當代的滯育性，隨后對所得的非滯育性的蠶卵進行蠶卵胚胎顯微注射并利用熒光蛋白標記進行篩選，制作轉基因家蠶該方法巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙，并有效地克服了現有轉基因方法的缺陷，將為家蠶轉基因技術在功能基因研究和生物反應器開發等實用研究中的大規模應用奠定堅實的技術基礎。
文檔編號C12N15/85GK101503704SQ20091010339
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春, 馬三垣 申請人:西南大學