專利名稱：家蠶胚胎發育進程的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，具體涉及一種基于基因相對轉錄表達量的家蠶胚胎發育進程的精確檢測方法。
背景技術：
家蠶(Bombyx moriL.)在我國已經被人工馴養5700多年,屬鱗翅目蠶蛾科完全變態昆蟲，世代包括卵、幼蟲、蛹和成蟲(蛾)四個蟲態。家蠶卵從活化到孵化約需要13 14天，人們為了實現桑蠶卵孵化整齊，蟻蠶強健以及適時孵化的目的，在13 14天內要根據胚胎的發育進行進程對環境條件進行調整，這一操作過程稱之為催青。為了便于識別蠶卵不同的發育時期，對不同發育階段的家蠶胚胎進行編號(甲:滯育后期、乙1:滯育期后、乙2:伸展期、丙1:最長期前、丙2:最長期、丁1:肥厚期、丁 2:突起發生期、戊1:突起發達前期、戊2:突起發達后期、戊3:縮短期、己I反轉期、己2:反轉終了期、己3:氣管形成期、己4:眼點期、己5:轉青期)，其中丙2、戊3、己4是三個重要的時期，分別為加溫的起點時期、升溫時期和確定發種時期。催青的條件控制方法有很多種，但目前生產上普遍采用的是簡化催青法，即把已經活化的桑蠶卵在溫度為1(T15°C，濕度75 80%的環境下進行中間感溫7 10天，胚胎發育到丙2時期進行升溫，用22°C，濕度80 85%催青到戊3，再用25°C，濕度85、0%催青至孵化。為了鑒定胚胎不同的發育時期，在生產上需要對催青過程中的桑蠶卵進行每天解剖，對胚胎的形態特征進行鑒別，確定發育進程。由于桑蠶卵很小，早期的胚胎上還附著大量的卵黃，影響對胚胎特征的識別；另外，解剖桑蠶卵只能是逐粒進行鑒定，由于桑蠶卵的孵化控制是一個批量控制的行為，所以傳統的解剖也存在一定的誤差，即個體特征不能反應整批發育進程。家蠶不僅是重要的經濟昆蟲，也是模式昆蟲，家蠶胚胎在發育生物學、遺傳學以及基因工程等領域被廣泛應用，客觀上需要提供一種對家蠶胚胎的發育進程的精確定量方法。同時，具有相同遺傳特征的同一品種家蠶不同批次在制種和感溫處理過程中存在發育進程差異，而使用常規檢測方法對不同批次進行全部解剖需要花費大量勞力，所以建立相應的省力化檢測胚胎發育進程的方法很有必要。

發明內容
本發明的目的是提供一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，以簡便、精確地確定家蠶胚胎的發育進程。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是:一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，包括以下步驟:
(1)構建待檢測品種的家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量和胚胎發育進程的關聯關系的模型；
(2)在待測定家蠶胚胎中取一個以上作為樣本，測定樣本的乙酰膽堿酯酶一型相對表達量然后對照步驟(I)所得模型，根據待測樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對轉錄表達量確定出家蠶胚胎的發育進程；
步驟(I)具體包括如下步驟:取待檢測品種的家蠶胚胎，在催青環境條件下進行催青，根據常規方法確定家蠶胚胎的發育階段；然后提取總RNA，經DNA酶處理后，反轉錄制備cDNA ;以肌動蛋白基因3為內參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設定引物，然后進行定量聚合酶鏈式反應擴增，以乙酰膽堿酯酶一型的表達量除以肌動蛋白基因3的表達量記為乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量，然后建立不同發育階段乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量和胚胎發育進程的指數方程；
步驟(2)具體包括如下步驟:提取待測定家蠶胚胎樣本的總RNA，經DNA酶處理后，反轉錄制備cDNA，以肌動蛋白基因3為內參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設定引物，然后進行定量聚合酶鏈式反應擴增，測得待測樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對轉錄表達量，然后對照步驟(I)所得模型確定出待測定家蠶胚胎的發育進程。上述技術方案中，所述步驟(I)中的發育階段包括甲、乙1、乙、丙1、丙2、丁1、丁
2、戍1、戍2、戍3、己1、己2、己3、己4、己5共15個時期。上述技術方案中，步驟(I)中每個發育階段用于提取總RNA的家蠶胚胎的總質量大于50mg。上述技術方案中，所述家蠶胚胎發育進程的檢測方法適用于所有品種。上述技術方案中，步驟(I)中，催青環境條件的控制方法為常規方法，并且所述催青環境與步驟(2)中待檢測的家蠶胚胎所在的催青環境相同；在確定胚胎的各個發育階段時采用的是常規的解剖方法， 為了避免因個體的不同而導致誤差，每一處理需要同時重復識別10個以上的胚胎。優選的技術方案中，建立家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量和胚胎發育進程的關聯關系的模型時，以胚胎發育階段的時間為橫坐標，以胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量為縱坐標，得到一標準曲線。本發明中，總RNA的提取、DNA酶處理和反轉錄合成cDNA處理根據分子克隆實驗指南(第三版)進行。家蠶卵從活化到孵化是胚胎由小到大的逐漸成長的連續的過程，在這個胚胎逐步發育的過程中，卵內的大量基因的轉錄表達水平呈現規律性的變化。乙酰膽堿酯酶的作用是在神經傳遞過程中水解乙酰膽堿，隨著家蠶胚胎的不斷發育，家蠶的神經系統逐漸成熟，乙酰膽堿酯酶基因的相對轉錄表達量也呈現上升的規律。家蠶的乙酰膽堿酯酶基因具有兩種類型，由于乙酰膽堿酯酶一型(ace I)的表達量高于乙酰膽堿酯酶二型(ace2)，選定ace I作為標志基因，通過測定其相對表達量精確測定家蠶胚胎發育進程是可行的。本發明根據家蠶acel的開放閱讀框堿基的序列以及定量聚合酶鏈式反應(PCR)引物設計的規則，設計跨內含子acel引物一對，為acel-Pl:5/ - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG-3'以及 acel-P2:5' - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3'，其中 N 為 A、T、C、G 其中之一；同樣設計肌動蛋白基因 3 (Actin3)引物，為 Actin3-Pl:5' -CGGCTACTCGTTCACTACC -3'以及 Actin3-P2:5' -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3'。本發明中取樣存放于液N中保存，避免RNA降解，并且應在所有樣品取樣完成后，盡快進行總RNA提取以及后面的步驟，存放時間不宜超過30天。
本發明中定量PCR的原理及數據分析方法已經被J.H.Schefe公開(J.H.Schefe, K.E.Lehmann,1.R.Buschmann, T.Unger, H.Funke-Kaiser, Quantitativereal-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel “geneexpression’s CT difference” formula, Journal of Molecular Medicine 2006 (84):901 - 910)，本領域技術人員可以參考。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點:
1.本發明提供了一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，其只需采用少量蠶卵為樣本即可以實現對蠶卵整體的發育階段進行準確的測定，較傳統方法更具有代表性，這對于以家蠶卵為對象的生命科學研究具有重要意義；
2.本發明的測定方法是對蠶卵發育的綜合評價，避免傳統方法的判斷誤差，具有結果準確、操作方便、實用性強的特點，適合推廣應用。


圖1為實施例中acel相對轉錄表達量和胚胎發育進程的相對關系曲線圖。圖2為是實例中的胚胎解剖圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步描述:
實施例一:一種家蠶胚胎發育進程的測定方法 ⑴材料及設備:
家蠶卵采用蘇州大學育成的品種(蘇秀X春豐)，催青控制箱為廣東省韶關鑫騰科普儀器有限公司生產的250D人工氣候箱，天平為日本島津公司生產的萬分之一克精度的電子天平，定量PCR儀為ABI7300。樣本:每區取50mg卵，設3個重復，同時設5000粒平行區用于解剖鑒定發育階段。⑵活化、感溫及催青
活化為低溫自然解除，感溫為15°C處理10天，催青按照簡化催青技術處理。⑶蠶卵解剖及形態鑒定
采用堿法(20% K0H)進行解剖,將存有50mL堿液的小燒杯置于酒精燈燒開后移去酒精燈，將存有50粒左右的桑蠶卵置于堿液5秒，經溫水(35°C )漂洗后放于存有溫水9cm的二重皿內，用膠頭吸管反復沖洗，直到胚胎逸出，取出胚胎用顯微鏡進行形態鑒定。⑷定量PCR分析
定量PCR引物的合成:根據家蠶acel的開放閱讀框堿基的序列和定量PCR引物設計的規則，設計跨內含子引物一對(分別為acel-Pl:5' - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG -3'、acel-P2:5' - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3' ) (N 為 A、T、C、G 其中之一)；選取 Actin3 為內參基因，同樣設計其引物(Actin3-Pl:5' -CGGCTACTCGTTCACTACC -3'和 Actin3_P2:5' -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3')?？俁NA的提取、DNA酶 處理和反轉錄合成cDNA:總RNA的提取、DNA酶處理和反轉錄合成cDNA處理根據分子克隆實驗指南(第三版)進行。定量PCR檢測:采用熒光染料SYBR Green I在ABI 7300上進行。PCR反應體系:SYBR Premix Ex Taq (2X) 10 ML，上游引物(10 MmoI/L) 0.4 ML，下游引物(10 MmoI/L)0.4 ML，ROX Reference Dye (50 X) 0.4 ML，模板 2.0 ML，dH20 6.8 ML，總體系 2O ML15PCR程序:兩步法 PCR 擴增，50 V 2 min ；95 °C預變性 I min ;95 V 15 s，60 V 31 s，45 個循環，每個樣品重復測定3次。(5)數據統計
分別把目標基因和內參基因進行稀釋10倍、100倍和1000倍，按照J.H.Schefe公開的方法，根據測定得的Ct值制定標準曲線，acel的標準曲線方程為Y = -0.6869x+26.923，R2 = 0.9988 ；Actin-3 的標準曲線方程為 Y = -0.7988x+22.985，R2 = 0.9987。根據各樣本測定的Ct值，經三組平均后，分別求出對應的log值，再根據2 一AACT法求出對應的表達量如下表。表I蘇秀X春豐胚胎各發育特征與acel相對轉錄表達量關系
權利要求
1.一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)構建待檢測品種的家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量和胚胎發育進程的關聯關系的模型； (2)在待測定家蠶胚胎中取一個以上作為樣本，測定樣本的乙酰膽堿酯酶一型相對表達量，然后對照步驟(I)所得模型，根據待測樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對轉錄表達量確定出家蠶胚胎的發育進程； 步驟(I)具體包括如下步驟:取待檢測品種的家蠶胚胎，在催青環境條件下進行催青，根據常規方法確定家蠶胚胎的發育階段；然后提取總RNA，經DNA酶處理后，反轉錄制備cDNA ;以肌動蛋白基因3為內參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設定引物，然后進行定量聚合酶鏈式反應擴增，以乙酰膽堿酯酶一型的表達量除以肌動蛋白基因3的表達量記為乙酰膽堿酯酶 一型相對轉錄表達量，然后建立不同發育階段乙酰膽堿酯酶一型相對轉錄表達量和胚胎發育進程的指數方程； 步驟(2)具體包括如下步驟:提取待測定家蠶胚胎樣本的總RNA，經DNA酶處理后，反轉錄制備cDNA，以肌動蛋白基因3為內參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設定引物，然后進行定量聚合酶鏈式反應擴增，得到待測樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對轉錄表達量，然后對照步驟(I)所得模型確定出待測定家蠶胚胎的發育進程。
2.根據權利要求1所述的家蠶胚胎發育進程的測定方法，其特征在于:所述步驟(I)中的發育階段包括甲、乙1、乙、丙1、丙2、丁1、丁 2、戊1、戊2、戊3、己1、己2、己3、己4、己5共15個時期。
3.根據權利要求1所述的家蠶胚胎發育進程的測定方法，其特征在于:所述步驟(I)中每個發育階段用于提取總RNA的家蠶胚胎的總質量大于50mg。
全文摘要
本發明公開了一種家蠶胚胎發育進程的測定方法，具體包括以下步驟(1)構建待檢測品種的家蠶胚胎的一型乙酰膽堿酯酶(ace1)相對轉錄表達量和胚胎發育進程的關聯關系的模型；(2)在待測定家蠶胚胎中取一個以上作為樣本,測定樣本的ace1相對表達量然后對照步驟(1)所得模型,根據待測樣本的ace1的相對轉錄表達量確定出家蠶胚胎的發育進程。該方法可以通過對少量蠶卵胚胎的發育進程進行測定而精確定量蠶卵整體的發育階段，減少人為操作帶來的誤差，簡化了測定流程，為家蠶胚胎的分子生物學研究提供發育進程的鑒定方法。
文檔編號A01K67/04GK103070141SQ20131005995
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月26日 優先權日2013年2月26日
發明者李兵, 方藝璇, 王彬彬, 顧芝亞, 沈衛德, 洪法水 申請人:蘇州大學