本發明涉及一種透明質酸酶突變體及其應用，屬于酶工程領域。

背景技術：

透明質酸酶(hyaluronidase,HAase)主要專一性水解透明質酸，廣泛存在于真核和原核生物中，在動物機體內參與許多重要的生物學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發育、受傷組織的修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生，是一種重要的生理活性物質。且于1928年被Duran Reynals首次發現并稱為“擴散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質酸酶。

根據透明質酸酶作用的底物特異性和催化機制，水蛭透明質酸酶屬于透明質酸3-糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，通過水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產物。

水蛭來源的透明質酸酶對底物的專一性強，與其它來源的透明質酸酶相比，它對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉糖苷活性，活性不受肝素影響。因此，水蛭透明質酸酶用于臨床藥用更具醫療價值意義。1941年Hirst首次證實水蛭透明質酸酶強有力的抗菌性。相關研究實驗已經證實透明質酸酶對治療心肌梗塞效果顯著。透明質酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經透明質酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細胞結合更多的抗癌藥物。此外，透明質酸酶在臨床上作為“藥物擴散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應用價值。

目前，水蛭來源的透明質酸酶的最適pH為5～7，最適反應溫度為36℃～38℃。該特性并不適合工業化應用。工業應用過程中，每將反應體系的溫度從室溫提高一度，都需要消耗更多的能量。

技術實現要素：

本發明旨在提供一種透明質酸酶突變體，該突變體具有更寬泛的最適反應溫度，催化活力也有提高。

所述透明質酸酶突變的氨基酸序列，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基礎上，將第121位甘氨酸G突變為亮氨酸L，同時將299位的蘇氨酸T突變為異亮氨酸I，同時將321位的丙氨酸突變為脯氨酸P。

本發明還提供一種表達所述透明質酸酶突變體的重組菌，是以枯草芽孢桿菌168為宿主， 以pMA5載體為表達載體，以wapA信號肽引導酶的分泌表達。

在本發明的一種實施方式中，將信號肽wapA通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點重組至pMA5，再通過PCR獲得編碼N端有6個組氨酸的透明質酸酶突變體基因H，將基因H片段和攜帶信號肽wapA的pMA5載體均采用EcoRI、BamHI限制性酶切位點雙切，然后連接，轉化枯草芽孢桿菌168，得到重組菌。

本發明還提供應用所述重組菌發酵生產透明質酸酶突變體的方法，是按10％的接種量將種子培養液轉接種于發酵培養基中，發酵培養基的組成為酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氫鈉15g/L，硫酸鉀4g/L，30℃220rpm培養，發酵培養60h。

本發明將所述透明質酸酶突變體采用食品級安全的工業菌株枯草芽孢桿菌進行表達，獲得了透明質酸酶生產菌株。以該重組枯草芽孢桿菌發酵，可在發酵上清液中收集得到透明質酸酶的突變體粗酶液，該酶在pH4～9的范圍內保持很好的活性，相比突變前，在耐酸性能上有了提高；在溫度25～40℃的條件下能保持很好的活性，相比突變前，在耐受低溫的性能上有了顯著提高。

具體實施方式

酶活測定方法：反應體系為1ml，用pH 5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置2mg/ml的HA，反應體系加入400μl的HA溶液、100μl的發酵上清液酶液，緩沖液補足至1ml；在38℃反應20min，立即沸水終止反應，采用DNS法測定產生的還原糖當量，1U為一小時內水解產生1μg還原糖所需酶量。

實施例1透明質酸酶突變體的獲得

(1)將SEQ ID NO.2所示出發核苷酸序列中編碼第121位甘氨酸G、299位的蘇氨酸T、321位的丙氨酸A的序列通過分布PCR分別突變為編碼亮氨酸L、異亮氨酸I、脯氨酸P的核苷酸序列。

(2)向透明質酸酶突變體N端引入6個組氨酸，設計引物PCR獲得編碼N端有6個組氨酸的透明質酸酶突變體基因H。引物序列為：

F：CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGAC

R：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAG

以枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMA5為表達載體，將信號肽wapA(MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPA)通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點重組至pMA5。

將基因H片段和攜帶信號肽wapA的pMA5載體分別采用EcoRI、BamHI限制性酶切位點雙切，載體和目的片段分別采用瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，回收產物進行連接，體系10μl：1μl雙切的載體，4μl雙切的目的片段，5μl Solution連接酶，16℃連接過夜，轉化JM109 感受態細胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進行測序，比對正確。挑選測序正確的重組克隆菌pMA5-wapA-H。重組質粒電轉入表達宿主Bacillus subtilis 168中，重組克隆子經PCR驗證正確。以相同策略表達突變前的透明質酸酶，作為對照1，以空載為陰性對照。

(3)驗證正確的重組枯草芽孢桿菌菌株pMA5-wapA-H進行發酵培養表達。單克隆接種于5ml的LB培養基，37℃、200rpm培養16h。按10％的接種量轉接于25ml的表達無機鹽培養基(酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氫鈉15g/L，硫酸鉀4g/L)，30℃220rpm培養，發酵培養60h，離心收集發酵上清液，作為粗酶液，SDS-PAGE電泳分析發酵上清液的結果表明在58kDa左右出現目標條帶，發酵液上清中酶活為1945.5U/ml，未突變的透明質酸酶的活力為15894U/ml，陰性對照未檢出透明質酸酶活力。

實施例2透明質酸酶突變體的活性測定

(1)pH對酶活的影響

在加酶之前，以0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液調整酶活測定體系的pH為別為2、3、4、5、6、7、8、9，分別測定透明質酸酶突變體、未突變的透明質酸酶的活力。以兩酶各自在pH 5.5的酶活反應體系為基礎，計算各自的殘余酶活。

表1

(2)溫度對酶活的影響

將透明質酸酶突變體、未突變的透明質酸酶的粗酶液分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，保溫30min，然后用于測定酶活。以兩酶各自在38℃的酶活為基礎，計算各自的殘余酶活。

表2

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 吳銀娣

<120> 一種透明質酸酶突變體及其應用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> 水蛭

<400> 1

Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser

20 25 30

Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe

35 40 45

Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr

50 55 60

Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys

65 70 75 80

Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe

100 105 110

Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe

115 120 125

Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met

130 135 140

Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys

145 150 155 160

Val Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu

165 170 175

Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu

180 185 190

Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr

210 215 220

Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr

225 230 235 240

Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr

245 250 255

Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val

260 265 270

Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu

275 280 285

Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp

290 295 300

Arg Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr

325 330 335

Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp

340 345 350

Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val

355 360 365

Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr

370 375 380

Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu

385 390 395 400

Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu

420 425 430

Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu

435 440 445

Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys

450 455 460

Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser

465 470 475 480

Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys

485

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> 水蛭

<400> 2

atgaaagaga tcgcggtgac aattgacgat aagaacgtta ttgcctctgt cagcgagtca 60

ttccatggtg ttgcctttga tgcgtcgtta ttttcaccga aggggttgtg gagctttgtt 120

gacattacct caccgaaatt gtttaaactc ttggagggtc tctctcctgg ttacttcagg 180

gttggaggaa cgtttgctaa ctggctgttc tttgacttag atgaaaataa taagtggaaa 240

gactattggg cttttaaaga taaaacaccc gagactgcaa caatcacaag gaggtggctg 300

tttcgaaaac aaaacaacct gaaaaaagag acttttgacg acttagtcaa actaaccaaa 360

ggaagcaaaa tgagactgtt atttgattta aacgctgaag tgagaactgg ttatgaaatt 420

ggaaagaaaa tgacatccac ttgggatagc tcggaagctg aaaaattatt caaatactgt 480

gtgtcaaaag gttatggaga taatattgat tgggaacttg gtaatgaacc ggaccatacc 540

tccgcacaca atcttactga aaagcaagtt ggagaggact ttaaagccct gcataaagtg 600

ctagagaaat atccgacgtt gaataaagga tcgcttgttg gacctgacgt tggatggatg 660

ggagtctctt atgtgaaagg attagcagac ggggctggtg atcacgtaac cgcttttact 720

cttcatcagt attattttga cggcaatacc tcagatgtgt caacatacct tgacgctact 780

tattttaaaa aacttcaaca gctgtttgac aaagttaagg atgtcttgaa aaattctcca 840

cataaagata aaccgctctg gcttggagaa acaagttctg gatacaacag cggcacaaaa 900

gatgtatccg atcgatatgt tagcggattt ctaacattgg acaagttggg actcagtgca 960

gcgaacaatg tgaaagttgt gataagacaa acgatctata atggatacta cggacttctt 1020

gataaaaata ctctagagcc aaatccggat tattggctaa tgcatgttca caattctctg 1080

gttggaaata cggtttttaa agttgacgtt agtgacccta caaataaagc tagagtttat 1140

gcacagtgca ccaaaacaaa tagcaaacat actcagagta gatactacaa gggctcattg 1200

acgatctttg ctcttaatgt tggagatgaa gatgtgacgt tgaagattga tcaatacagt 1260

ggaaaaaaga tttattcata tattctgacc ccagaaggcg gccaacttac atcacaaaaa 1320

gttcttttga atggaaaaga attaaaatta gtgtcggatc aattgccaga actgaatgca 1380

gacgagtcga aaacctcttt cactctgtct ccaaagacat ttggattttt tgttgttagc 1440

gatgctaacg ttgaagcctg caaaaaataa 1470

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattcc accaccacca ccaccacatg aaagagatcg cggtgac 47

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggatcct tattttttgc aggcttcaac gttag 35

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> wapA

<400> 5

Met Lys Lys Arg Lys Arg Arg Asn Phe Lys Arg Phe Ile Ala Ala Phe

1 5 10 15

Leu Val Leu Ala Leu Met Ile Ser Leu Val Pro Ala

20 25