專利名稱：貯存紅細胞的組合物和方法
貯存紅細胞的組合物和方法本申請是申請日為2005年2月17日，申請號為200580049506.0的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。John R.HessTibor J.Greenwalt關于聯邦贊助的研究或發展的聲明本工作的一部分在美國 軍隊合約DAMD17-95-C-5029下進行，美國政府在此可以孚有所有者權益。
背景技術：
本發明主要涉及與貯存紅細胞(RBCs)有關的組合物和方法。特別涉及改進RBC貯存的組合物和方法以及其應用。貯存和保存紅細胞(RBCs)用于其后再灌注到患者體內的能力是一種相對新近的作為現代外科實踐先驅的科技發展。這種保存在科學上是棘手的，而且實現長期貯存并得到高質量的再灌注用紅細胞的步驟也已經越來越多。一旦從捐贈人處收集到紅細胞，它們便開始死亡因為它們會凝結、饑餓、失去ATP、2，3-DPG、膜表面積和完整性，以及血色素(Hb)。Rous&Turner在1916年以及Robertson在1917年首先成功示范了全血的忙存。后來，檸檬酸葡萄糖(ACD，1943)，其含有作為抗凝劑的檸檬酸鹽和作為被紅細胞利用的唯一養料右旋糖，以及檸檬酸鹽磷酸鹽右旋糖溶液(CPD，1957)，其中加入了磷酸鹽作為代謝來源并用于膜固定，被認可用于貯存全血21天。含有腺嘌呤的CPD(CPDA-1，1979)隨后被引入并能將被貯存的全血和濃縮RBCs (packed RBCs)的貯存期延長至5周。最初，貯存組合物被設計為酸性的以防止葡萄糖在最后生產步驟中的熱消毒期間被焦糖化。在20世紀50年代，腺嘌呤被發現能作為添加劑并代替脫氨化引起的腺嘌呤損失。在20世紀70年代，為了血小板和生產血漿衍生物，開始期望從收集的全血中除去血漿。然而，這會導致所得“濃縮RBC(packed RBC) ”的回收率下降。為了防止這種情況發生，開發了本領域已知的作為添加溶液(AS)的組合物以補償容量、營養素和其它有用的RBC穩定劑。有必要對用于保護從全血中分離后紅細胞(RBCs)的添加溶液組合物進行特別調整以使其符合RBCs的需要。1981年開發了特定的添加溶液將RBC的貯存期延長到6周。然而，貯存在這個溶液中的紅細胞(RBCs)在約6周后卻出現了穩定的退化，因為在再灌注到人供體后24小時的循環中存活的這種細胞有75%都被確定是沒用的。已經發現在連續的冷凍貯存期間，葡萄糖以漸減的速率被消耗，因為代謝廢物，即乳酸和氫離子的濃度在增加。這種葡萄糖代謝速率的下降導致三磷酸腺苷(ATP)耗損，這在細胞重返循環時與RBCs的復原(recovery)直接相關。設計了添加溶液例如Adsol.RTM(AS-1) ,Nutricel RTM(AS_3)、0ptisol RTM(AS_5)和 ErythroSol RTM 用于下延長在1-6°C下RBCs的貯存期。最近在美國批準的所有這些ASs，AS-1, AS-3和AS-5，都包含鹽水、腺嘌呤、葡萄糖和一些檸檬酸鹽和/或甘露糖醇作為“膜保護劑”。AS-3還包含磷酸二氫鈉。每個美國批準的ASs都符合貯存RBC6周的許可要求，但是不能貯存7周。目前批準的RBC添加溶液組合物已經在知曉RBC貯存損傷(在此定義為RBCs貯存中對存活和/或功能限制的總和)是一種細胞凋亡過程前就被開發了。目前幾乎所有的收集全血都被制成組份，RBC部分以濃縮RBCs的形式被貯存。為了將血引入到添加溶液系統中，我們通過冷凍將RBCs濃縮，除去血漿以使RBCs占80%的體積，然后無菌地加入IOOml添加溶液。所得懸液的RBC體積部分約占55%。貯存在一般FDA-認可的添加溶液中的RBCs僅能被貯存6周，有24小時的體內可接受復原。為了增加在貯存一段時間后再灌注到患者體內RBCs的體內可接受復原時間，已經試圖改進了添加溶液和貯存方法。在“紅細胞保存的研究_7。改進的磷酸銨添加溶液的體內和體外研究”中，Greenwalt等，Vox.Sang.65:87-94 (1993)，作者確定，實驗性添加溶液(指定為EAS-2)，其含有(mM):20NH4Cl、30Na2HP04、2腺嘌呤、110右旋糖、55甘露糖醇，在PH7.15下形成，能用于延長人RBCs的貯存期限，從目前5-6周的標準到增加到8_9周的改進標準。然而，貯存在EAS-2中的濃縮RBCs不能直接注入而需要用在輸注前經洗滌步驟除去上清液，因為添加溶液中存在銨。在“紅細胞保存的研究_8。在含有甘油的添加溶液中紅細胞的液態貯存”中，Vox.Sang.67:139-143(1994)，Greenwalt等，記載了能在九周后復原73%濃縮紅細胞的添加溶液(指定為EAS-25)。然而，所得的RBC單元包含約I %的甘油，這對于大劑量的人體輸注是不安全的。在“4°C下延長紅細胞忙存”中，Transfus.Sc1.15:105-115 (1994) ,Meryman 等，證明了貯存在非常淡的懸液中以低紅細胞比容存在27周RBCs有可接受的存活力。然而,這種貯存RBC的懸液不能被直接輸注所接受因為它們的鉀和氨含量高且RBCs體積部分低。用于貯存200mLRBC且需要產生實測有益效果的5L溶液在臨床上是不可行的。就能被批準和可商購的產品而言，目前美國批準的添加溶液僅起效6周，平均復原約80%。目前歐洲批準的兩種添加溶液 起效約7周，平均復原77% (ErythroSol fromBaxter Healthcare, La Chatre, France)和 75% (PAGGS mannitol from Maco Pharma)。Kurup etal.(Vox Sang2003:85 =253-261)目前記載的新溶液預期可能有更短的貯存期，因為ATP濃度低。針對現有技術中的不足，本發明的發明人開發了含有低容積磷酸氫二鈉的堿性實驗添加溶液(EASs)，其能部分中和收集血對酸性抗凝劑溶液例如CPD (檸檬酸鹽-磷酸鹽-右旋糖)的作用，并顯示這些EASs能改善RBC ATP濃度，降低溶血，并降低RBC膜的形態變化和損失(參見美國專利6，150，085和6，447，987，Hess and Greenwalt，在此通過參考的方式將其公開內容全部引入)。各種EASs都支持9到12周的貯存期。盡管這些EASs產生了較高的性能結果，但是它們包含氯化鈉并被制成相對大的體積致使被貯存RBC被更多地稀釋，這樣在輸注到患者受體時就增加了血液被稀釋的危險性。此外，氯化鈉的存限制了緩沖鹽和磷酸鹽的溶解量使該系統能維持預期的體積。當有較高的時間要求而且還是間斷的時間要求時，例如戰爭時，以及在間斷地、分散地需要輸注血液的地理區域中，提高RBC的貯存時間就顯得非常重要。事實上，假設據報道目前的損耗水平是由于RBCs通常在實際應用以前就過了安全貯存期，因此提高RBCs的安全貯存時間就是人們目前普遍關心的問題。因此，需要在低體積常規添加溶液中能保持或提高RBC復原及性能的RBC貯存組合物。在血液貯存和輸注領域中仍然有改善RBC貯存的需求，這能使貯存時間延長，復原百分率更高，且改善了輸注RBC的生理功能。因此，仍然需要改進RBC貯存的組合物以及生產方法。還需要添加組合物，這種組合物能使加入該組合物的RBC懸液可被直接輸注到人體中，并能允許活性RBCs在輸注后有可接受的復原性，其中活性RBCs擁有增強的生理功能并且降低了在被輸注患者循環中的清除率。發明簡沭因此，本發明提供了適于貯存和保存被收集紅細胞的新的組合物。本發明的發明人意外地發現，從這種組合物中基本上除去氯化鈉(之前這被認為是正確制備貯存組合物所必須的)能提供用于增強的PH調節系統的高性能組合物，這對貯存紅細胞以及隨后的再輸注紅細胞的完整性和生理功能性質都是有益的，而且鑒于時間的延長，RBCs在貯存時就可以保持符合相關法律規定的復原性和溶血水平。此外，本發明組合物在常規體積下保持了較好的性能，這使得它們特別適于貯存紅細胞，其中紅細胞可以是多次或大量輸注給患者的。本發明的一個實施方案提供了用于在約I到約6°C下貯存紅細胞的組合物。該組合物主要由以下物質組成:腺嘌呤、右旋糖、至少一個不可代謝的膜保護劑糖，和pH緩沖系統。pH緩沖系統含有碳酸氫鈉和磷酸氫二鈉并以足夠使pH為約8到約9的量存在。該組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH，其中該組合物以在貯存期間足夠在紅細胞中建立并保持下述反應平衡的量被加入到懸液中，所述平衡是一種抑制從I，3-DPG合成2，3- 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存期間的反應平衡中產生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。本發明的另一個實施方案提供了基本上不含氯化鈉的組合物。本發明更具體的實施方案是提供特定的組份及其含量，摩爾滲透壓濃度范圍和組合物的pH。其它具體 實施方案是針對能使紅細胞的pH保持在特定數值范圍內的本發明組合物。本發明的另一個實施方案是提供含有本發明組合物的紅細胞懸液。還提供了方法實施方案。一個這樣的實施方案是針對在貯存期間保存紅細胞(RBCs)的方法。該方法包含:(a)將含有需有待貯存的RBCs和血漿的被收集全血樣品與抗凝血劑溶液混合，由此形成所收集的全血的懸液；(b)對所收集的全血的懸液進行處理以除去血漿并濃縮RBCs，由此形成濃縮RBCs ； (c)將袋裝RBCs與一定量的組合物混合，該量足以形成有約35%到約70%體積RBCs的RBCs懸液；(d)冷卻RBCs懸液到約I至約6°C ；以及(e)根據標準存儲步驟貯存冷卻的RBCs懸液。該組合物主要由以下物質組成:腺嘌呤；右旋糖；至少一個不可代謝的膜保護劑糖；和PH緩沖系統。該pH緩沖系統包含碳酸氫鈉和磷酸氫二鈉并以足夠使組合物的PH為約8到約9的量存在。該組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH，其中該組合物以在貯存期間足夠在紅細胞中建立并保持反應平衡的量被加入到懸液中，這種平衡是一種抑制從1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存期間的反應平衡中產生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。還提供了更具體的實施方案。還提供了另外的實施方案，它是針對使用本發明組合物以在貯存期改進紅細胞(RBC)的膜維持和抑制RBC凋亡的方法，以降低貯存期紅細胞(RBC)的脆弱性并抑制RBC溶血，以及提高隨后進入貯存期和輸注到需要這種輸注的患者體內后紅細胞(RBC)的存活力，并降低患者輸注后對RBC的清除率。
根據本發明生成的組合物和RBC懸液為RBCs提供了這樣一種貯存期，即在整個貯存期內，有充足治療量的RBCs是可復原的并且能直接輸注到患者體內而無需用建立和驗證RBCs輸注的已知標準方法進行處理。本發明的這些和其它實施方案以及各個方面將通過參考附圖簡述、對以下提供的優選實施方案和實施例的詳述而得到更充分的理解。附圖筒沭


圖1:是表示RBCs貯存效果的混合(pooling)研究結果的圖解表示，以時間(星期)為函數，涉及4個不同的添加溶液組合物:l)AS-3，體積IlOmL, (- O -) ;EAS_61，體積170mL(- -) ；EAS-78,170mL, (-.-);和 EAS-81，IlOmL,(-〇-)。含有碳酸氫鹽的組合物，以圓圈表示，與不含碳酸氫鹽的等體積組合物(以菱形表示)相比，產生了較高的ATP濃度，如圖A所示。這些組合物還涉及較高的乳酸鹽濃度(圖D)，較高的胞外和胞內pH(圖E和F)，以及較高的碳酸氫鹽和PCO2濃度(圖E和F)。體積較大的組合物，以實心圖表示，說明溶血降低和貯存的紅細胞比容降低，這分別在圖B和C中予以說明。圖2:說明將貯存在EAS-81中6周(n = 6), EAS-81中8周(η = 6)的RBCs再輸注到受試者體內后24小時取樣的紅細胞在體內的復原性，與以往的對照進行比較，對AS-3的許可實驗由Simon等在1985年公布。這兩個研究均使用了 51Cr單-標簽法(single-labelmethod)。 Licensure study優選實施方案的描述本發明涉及與紅細胞(RBC)貯存有關的組合物和方法。特別涉及新的的添加溶液組合物和與貯存RBCs相關的方法，其中RBCs已經從全血中分離出來，其中全血在檸檬酸鹽磷酸鹽右旋糖(CPD)溶液中，其變體，檸檬酸磷酸鹽雙重右旋糖(CP2D)溶液中收集，或在酸性檸檬酸鹽右旋糖(ACD )或類似溶液中通過提取(Aphaeresis)(從患者或供體中除去全血)收集。 就本發明的目的來說，在此使用的術語“復原”指在再灌注到最初的人供體后，在循環中保留24小時的貯存RBCs部分。在此使用的“氯化物”指的是陰離子氯化物。因此，術語“氯化物”包括陰離子氯化物及其鹽形式，例如可以由氯化物陰離子和生理上可接受的陽離子形成。術語“氯化物”不包括其中氯原子是以共價鍵聯接到例如有機分子中碳原子上的化合物。在此使用的短語“生理上可接受的緩沖劑”指的是能產生陽離子和陰離子的緩沖齊U，其中該離子一般可見于人的血、血漿或血清中，或當引入人體時能被耐受。適宜的陽離子包括質子、銨陽離子和金屬陽離子。適宜的金屬陽離子包括但不限于鈉、鉀、鈣和鎂陽離子形式，其中優選鈉和鉀，更優選鈉。銨陽離子，即式R4N+化合物，其中R是氫或有機基團，只要是生理上可接受的就能被使用。在優選的實施方案中，陽離子選自氫(即質子)、鈉、鉀、鈣、鎂及其組合。在此使用的“緩沖劑”指的是能調整和調節組合物PH的試劑。在此公開的本發明組合物是含水的，即它們在水中形成。本發明優選的水是被處理的以便基本上不含熱原(即滅菌)。在此使用的“mEq/L”指的是與水存在量成比例存在的特定成分(溶質)的濃度。更具體為，mEq/L指的是每升水中溶質的毫當量數。每升的毫當量通過以下方法計算，將溶質的每升摩爾數與每分子溶質的電荷種類(組)數相乘，然后乘以因子1，000。
本發明的一個實施方案提供了用于在約I到約6°C下貯存紅細胞的含水組合物。該組合物主要由以下物質組成:腺嘌呤；右旋糖；至少一個不可代謝的膜保護劑糖，和PH緩沖系統。該PH緩沖系統含有生理上可接受緩沖劑的組合物，并且必須包括至少一個能提供碳酸氫根陰離子的試劑，至少一個能提供磷酸根陰離子的試劑和至少一個能提供鈉陽離子的試劑。本發明預期，單個緩沖鹽可以滿足這些要求中的一個以上。已知在紅細胞的保存領域中，紅細胞懸液系統中的ATP濃度是與身體健康最相關的。紅細胞經糖酵解通過d-葡萄糖(右旋糖)的糖分解轉化最終產生乳酸鹽，由此產生ATP。因此，乳酸鹽的濃度曲線也就是ATP合成的良好指示劑。不管系統的保存力如何，紅細胞的壽命都是有限的而且收集的紅細胞包括紅細胞年齡的正態分布并接近于自然死亡。由于沒有新的RBCs進入保存系統，因此對最大貯存期就產生了限制，其中該最大貯存期將提供再灌注后必要的復原百分比。因此，盡管系統在整體上產生ATP的能力將隨時間下降；但是一般能看到加入添加液體后最初是升高的因為它提供了比自然濃度高的營養素，而且RBC最初經歷了 “溶脹”，這也與ATP利用下降有關。不囿于任何理論，我們發現，當貯存在根據本發明的添加溶液中時，營養素溶液的體積增加能使底物數量增加以便能以可接受的濃度被輸送，而且提供了用于稀釋代謝廢物的溶質由此降低了葡萄糖代謝的反饋抑制。更進一步假定，本發明添加溶液的另一個特征是它們最初能產生溶脹的RBCs隨后在貯存期間紅細胞體積逐漸降低。這個過程已經被稱為“調節性體積降低”。假定在這個過程中，RBC中酪氨酸磷酸酶的活性被抑制，或者酪氨酸激酶被激活。已證明這兩個酶在這些細胞的膜中是很大量的(Zipser, Y.andKosower, N.S.(1996)Biochem.J.314:881 ；Mallozzi C.等(1997)FASEB J.11:1281)。預期RBC膜上帶3蛋白的純磷酸化將導致從其與帶3的結合狀態中釋放細胞質內的磷酸果糖激酶、醛縮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Harrison, M.L.等(1991) J.Biol.Chem.266:4106 ；Cossins, A.R.and Gibson J.S.(1997) J.Exper.Biol.200:343 ；Low, P.S.等(1993)J.Biol.Chem.268:14627 ；Low,P.S.等(1995) Protoplasmal84:1961)。糖酵解途途徑中這三個酶的有效性將預期能提高RBC的葡萄糖代謝，由此促進了 ATP的合成水平和RBCs中ATP的濃度。因此，制備添加溶液組合物的目的是將ATP的合成在盡可能長的時間內保持在較高的速率上。本發明的發明人發現，將系統的ATP合成保持在最大化的關鍵是將胞內RBC的pH保持在盡可能接近7.2的水平上，盡可能達到而不必完全達到。在貯存期間，ATP濃度的特點是保持在一定水平上或甚至是在貯存的早期升高然后下降。當RBC ATP濃度下降到2 μ mol/g Hb以下時，RBC的復原一般就低于75%。RBC在貯存早期損失2，3-DPG。起始濃度的特點是為約15ymol/g Hb或約1.1 μ mol/g Hb。在7到10天內，濃度一般下降到起始量的十分之一。2，3-DPG的合成速率是pH的函數，在pH大于7.2時出現但在低于這個pH時就下降。通過增加貯存系統的PH來提高2，3-DPG合成的嘗試已經被限制了，因為伴隨每個2，3-DPG分子的形成都會一摩爾一摩爾地損失ATP的合成。因此，增加RBC的2，3_DPG濃度，這在以前就被認為是所期望的，事實上是傾向于降低RBC的貯存時間。更偏酸性的環境降低了 RBC的代謝。7.2的pH是關鍵，其中觸發了一種機理，其已知是Rappaport 旁路(參見Hess等"堿性CPD和紅細胞2，3-DPG的保存"(2002)Transfusion, 42:747_752，在此通過參考全部引入)，其中2,3-DPG由1，3_DPG合成，消耗了合成ATP所需的磷酸鹽，另外還有糖酵解步驟，該步驟生成了由糖酵解產生的兩個ATPs。系統的純作用是損耗ATP。如果胞內pH能保持在7.2以下，那么該旁路就被有效地關閉，ATP合成也就被最大化。在自然狀態下，該旁路發揮了一定程度的作用，一些2，3-DPG的產生和保持相對于其它細胞事件是重要的。然而，本發明的發明人發現，在體內以外的環境中貯存時，出于對紅細胞保護的目的，期望能將這種旁路作用最小化。因此，本發明組合物的實施方案就提供了以足夠滿足以下條件的量存在的pH緩沖系統:其中該組合物以在貯存期間足以在紅細胞中建立并保持下述反應平衡的量被加入到懸液中，上述平衡是一種抑制從1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存期間的反應平衡中產生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。本發明組合物的具體實施方案提供了能保持RBC懸液pH的組合物，其中該組合物已經以約6.4到7.4的PH值被加入到懸液中。在更具體的實施方案中，該組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH值，其中該組合物已經以7.0到低于約7.2的pH被加入到懸液中。在更具體的實施方案中，該組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH值，其中該組合物已經以大于約7.1到小于7.2的pH被加入到懸液中。本發明的發明人已經制備了基本上不含氯化物的添加溶液組合物，其令人驚奇地沒有對系統產生負性作用并允許額外增加緩沖系統的量以提供額外的PH緩沖。本發明的一個實施方案是針對用于在約I到約6°C下貯存紅細胞的含水組合物。這個組合物包含:腺嘌呤；右旋糖；至少一個不可代謝的膜保護劑糖，和PH緩沖系統。該pH緩沖系統含有生理上可接受緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括至少一個能提供碳酸氫根陰離子的試劑，至少一個能提供磷酸根陰離子的試劑，和至少一個能提供鈉陽離子的試劑。其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的pH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3- 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。該組合物基本上不含外源性的氯離子。在此使用的“基本上不含外源性的氯離子”的定義是不論氯離子是否是被提供的，都沒有氯離子被加入到組合物中。另外的實施方案是針對含有任何本發明組合物的紅細胞懸液，以及其中懸液適于直接輸注到需要這種輸注的患者中的實施方案。本發明組合物的其它實施方案提供的是，至少一個能提供鈉陽離子的試劑，其選自碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。在更具體的實施方案中，能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑是碳酸氫鈉。另外的實施方案提供了能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑，其選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及其組合。在更具體的實施方案中，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑是磷酸氫二鈉。在本發明組合物的其它實施方案中，生理上可接受緩沖劑的組合還含有至少一個能提供生理上可接受陽離子的試劑，其中陽離子選自H+、鉀、銨、鎂及其組合。在本發明組合物的另一個實施方案中，至少一個非代謝的膜保護劑糖是甘露糖醇。一些糖醇，特別是衍生自單糖的糖醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇)，是能容易地擴散過一些類脂屏障并可能在細胞穩定性中發揮重要作用的親水性小分子。特別是甘露糖醇，它是已知的在體內作為羥基清除劑的抗氧劑。它在維持細胞膜穩定性中發揮了主要作用并被認為是膜保護 劑糖。其它的小多元醇也可以作為膜保護劑糖。值得注意的是，葡萄糖和甘露糖醇有相同的分離量，即180g/摩爾。糖醇不會被紅細胞代謝。在此使用的所謂摩爾滲透壓濃度是來自經驗的數值。摩爾滲透壓濃度是穿過完全半透膜(允許水自游通過并完全阻斷溶質轉運的一種膜)的溶液產生的滲透壓與純水相比的測量值。摩爾滲透壓濃度取決于溶液中的粒子數但不依賴于粒子的性質。單純溶液的摩爾滲透壓濃度等于摩爾濃度乘以每分子的粒子數。真溶液可能更加復雜。具有許多當量/L的蛋白質，可能對摩爾滲透壓濃度僅有很小量的貢獻，因為它們由少數非常大的“粒子”組成。不是所有的離子在溶液中都是游離的。陽離子可能與其它陰離子或蛋白質結合。不是所有的溶液容量都是含水的。真實準確地說，所有這些因素都應該被計算在內。張力，與摩爾滲透壓濃度高度相關并且對描述生物細胞環境更加有用的值，是能通過細胞膜物質的滲透壓與血漿相比的測量值。摩爾滲透壓濃度衡量了水的有效梯度，假定所有的滲透性溶質都完全沒有滲透。計算溶解的粒子數是很簡單的。例如，300mM的葡萄糖溶液和150mM的NaCl溶液有相同的摩爾滲透壓濃度。然而，置于任何這些溶液中的細胞其行為卻是非常不同的。張力是描述溶液抵抗細胞內容量擴張趨勢的功能性術語。其它實施方案提供的是具有約200到約310m0sm摩爾滲透壓濃度的本發明組合物。在更具體的實施方案中，組合物具有約221到約280m0sm的摩爾滲透壓濃度。在非常具體的實施方案中，摩爾滲透壓濃度為約270m0sm。如所述的那樣，RBCs將葡萄糖(d-葡萄糖=“右旋糖”)代謝為ATP。廢物是乳酸鹽和質子。質子堆積，壓低了 PH并抑制進一步的代謝。碳酸氫鹽已經被建議作為緩沖系統，其中它能與質子結合，在存在RBC碳酸酐酶的情況下轉化為水和二氧化碳。在允許二氧化碳擴散的貯存容器中 ，逆反應被抑制了，該反應朝著生成CO2的方向進行。基于碳酸氫鹽的緩沖系統已經具有相當可觀的容量。添加溶液中生理濃度的碳酸氫鹽能在溶液中產生PCO2,其驅使每周從600mL PVC袋中擴散高達I到2mmol的C02。然而，就增加ATP合成和延長有效的貯存期來說，先前嘗試制備含有碳酸氫鹽的RBC貯存添加溶液已經是失敗的。例如，Beutler(BAG-PM)記載將碳酸氫鹽加入到RBC貯存溶液中，但是沒能控制較高的pH致使ATP被迅速耗盡。由于發現鹽水不是RBC添加溶液組合物的必須成分，而且右旋糖的濃度能被降低而對ATP合成沒有負面作用，因此本發明的發明人能利用溶液參數中所產生的增強“作用”去提高并調整PH緩沖系統。本發明公開的緩沖系統不僅對添加溶液組合物提供了最初的適宜pH，而且還能賦予RBC懸液一個pH，并依次將RBC的胞內pH調節到能最大化合成ATP的值。緩沖系統在貯存期內實現了這些PH調節目標。因此，pH緩沖系統的緩沖力或強度能被有意地控制。本發明組合物的一個實施方案提供了 PH為約8到約9的組合物。在更具體的實施方案中，pH為約8.2到約8.8。在更具體的實施方案中，組合物的pH為約8.4到約8.6，在非常具體的實施方案中，組合物的pH為約8.5。另一個實施方案針對的是這樣的本發明組合物，其中緩沖系統在紅細胞(RBC)中具有這樣的緩沖力，組合物被加入后在6周的貯存期內提高到至少約2mEq且pH為6.5到7.2。本發明公開的緩沖系統應該提供至少為這個值的緩沖力，也應該能對RBC懸液提供更好的緩沖力由此使貯存期進一步延長。本發明的發明人確定了組合物所必須成分的范圍，其中成分的優點隨后公開。在本發明組合物的一個實施方案中，組合物包含約l_3mM的腺嘌呤，約20到約115mM的右旋糖，約15到約60mM的非可代謝膜保護劑糖，約20到約130mM的碳酸氫鈉和約4到約20mM的磷酸氫二鈉。在更具體的實施方案中，組合物包含約2mM的腺嘌呤，約60到約IOOmM的右旋糖，約40到約60mM的非可代謝膜保護劑糖，約22到約40mM的碳酸氫鈉和約7到約15mM的磷酸氫二鈉。在更具體的實施方案中，組合物包含約2mM的腺嘌呤，約80mM的右旋糖，約55mM的非可代謝膜保護劑糖，約26mM的碳酸氫鈉和約12mM的磷酸氫二鈉，組合物的pH為約 8.5。本發明還提供了方法實施方案。在一個這種實施方案中，提供了保存紅細胞(RBCs)經過一段貯存期的方法。該方法包含:(a)將包含有待貯存的RBCs和血漿的經收集的全血樣品與抗凝劑溶液混合，由此形成所收集的全血的懸液；(b)對收集的全血懸液經行處理以除去血漿并濃縮RBCs，由此形成濃縮的RBCs ； (c)將濃縮的RBCs與一定量的含水組合物混合以形成具有約35%到約70%體積的RBC的懸液；(d)冷卻RBCs懸液至約1°C到6°C，以及(e)根據標準貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液。含水組合物主要由以下物質組成:腺嘌呤；右旋糖；至少一種非可代謝膜保護劑糖，和PH緩沖系統。該pH緩沖系統含有生理上可接受緩沖劑的組合，其包括至少一個能提供碳酸氫根陰離子的試劑，至少一個能提供磷酸根陰離子的試劑，和至少一個能提供鈉陽離子的試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的pH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。該溶液在制備時就被分開以便在加熱滅菌期間使右旋糖和磷酸鹽以及碳酸氫鹽分隔開。用在本發明中的RBCs是在制備組份的正常過程中已經從血漿中分離并在抗凝劑溶液中重懸的RBCs。簡言之，就是將包含RBCs和血漿的標準全血樣品(450.+/-.45ml)與抗凝劑溶液(約63ml)混合以形成全血懸液。也可以成比例地增加或降低溶液體積以反映出不同供體血液的體積，例如400.+/-.40ml-500.+/-.50ml。然后將全血懸液離心以便從血漿中分離RBCs，由此形成濃縮的RBCs。整個過程的進行能使用常規技術通過減少白血球來改進。適宜的抗凝劑 包括已知用于貯存RBCs的常規抗凝劑。優選的抗凝劑包括pH為
5.5到8.0的檸檬酸鹽抗凝劑，例如CPD，半濃度的CPD等。最優選的抗凝劑是CPD。然后通常使用標本袋或PVC轉運包裝將RBC懸液貯存在標準的聚氯乙烯(PVC)貯血袋中，其中轉運包裝的大小隨被貯存部分的體積而變化。根據輸血的臨床實踐記載的步驟，編者 Petz&Swisher, ChurchiI1-Livingston publishers, N.Y., 1981,將 RBC 懸液忙存在約1°C到6°C下。在此通過參考的方式將上下文中引用的所有文件引入本文。在本發明方法的一個具體實施方案中，RBCs的懸液適于直接輸注到需要這種輸注的患者體內。而PVC貯血袋是工業上認可的標準貯血袋；本發明預期能使用適于貯存RBC懸液的眾多不同的袋子，例如包括所需的適宜plastisizers。與袋子有關或與RBC貯存技術的容器組份有關的成分沒有在此進行討論，但本領域技術人員將能很容易地使用許多容器技術來實現本發明。本發明的添加溶液還能用于使凍干的RBC再水合，或將在熔化中的貯存冷凍血或血成分例如RBC再水合。在本發明保存RBCs方法的具體實施方案中，至少一種非可代謝膜保護劑糖是來自糖醇的單糖，在更具體的實施方案中，非可代謝膜保護劑糖是甘露糖醇。在另外的方法實施方案中，能提供鈉陽離子的至少一種試劑選自碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。在具體的實施方案中，能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑是碳酸氫鈉。進一步的實施方案是針對保護RBCs的本發明方法，其中能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及其組合，在更具體的實施方案中，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑是磷酸氫二鈉。在本發明方法的其它實施方案中，生理上可接受緩沖劑的組合含包含至少一個能提供生理上可接受陽離子的試劑，其中陽離子選自H\鉀、銨、鎂及其組合。進一步的實施方案針對的是本發明保存RBCs的方法，其中組合物的摩爾滲透壓濃度為約200到約310m0sm。在具體的實施方案中，摩爾滲透壓濃度為約221到約280m0sm，在非常具體的實施方案中，摩爾滲透壓濃度為約270m0sm。在另一個實施方案中提供了本發明的方法，其中組合物的pH為約8到約9。在具體的實施方案中，pH為約8.2到約8.8，在更具體的實施方案中，組合物的PH為約8.4到約8.6。在非常具體的實施方案中，組合物的PH為約8.5。本發明保存RBCs方法的另一個實施方案提供的是，緩沖系統在紅細胞(RBC)懸液中有這樣的緩沖能力，其中在加入組合物后在6周的貯存內提高到2mEq，且pH在6.5到7.2之間。本發明還提供了保存RBCs的本發明方法，其中，所述的組合物可操作地保持加入了所述組合物的紅細胞(RBC)懸液的pH為約6.4到約7.4。在具體的方法實施方案中，組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH，其中組合物在pH為約7.0到約小于7.2時被加入到懸液中，在更具體的方法實施方案中，組合物能保持紅細胞(RBC)懸液的pH，其中組合物在pH為大于約7.1且小于7.2時被加入到懸液中。還提供了針對組合物必須組份具體范圍的根據本發明的方法。在一個方法實施方案中，組合物包含約l_3mM的腺嘌呤，約20到約115mM的右旋糖，約15到約60mM的非可代謝膜保護劑糖，約20到約130mM的碳酸氫鈉和約4到約20mM的磷酸氫二鈉。在更具體的實施方案中，組合物包含約2mM的腺嘌呤，約60到約IOOmM的右旋糖，約40到約60mM的非可代謝膜保護劑糖，約22到約40mM的碳酸氫鈉和約7到約15mM的磷酸氫二鈉，在非常具體的實施方案中，組合物包含約 2mM的腺嘌呤，約80mM的右旋糖，約55mM的非可代謝膜保護劑糖,約26mM的碳酸氫鈉和約12mM的磷酸氫二鈉，更進一步地，其中組合物的pH為約8.5。在根據本發明的方法中，將添加溶液加入到濃縮的RBC懸液中，其量為在細胞懸液中能足以提供治療有效量的可復原RBCs。優選的是，添加溶液的加入量為約60ml到約400mg，優選約100到約150ml，最優選約110ml。該溶液一般的用量是與收集全血的體積比為1: 4.5 (450mL收集全血對lOOmL，500mL收集全血對lllmL，或等量)。在保護RBCs的本發明方法的具體實施方案中，組合物與收集全血的體積比為約1: 4.5。在更具體的實施方案中，組合物的體積為約IlOmL,收集全血的體積為約500mL。細胞懸液中RBC的體積分數，即在加入添加溶液后，為總懸液的約27到70%。更優選的是，細胞懸液中RBC的體積分數為約35到約50%。最優選的是，細胞懸液中RBC的體積分數為總懸液的約43%。在貯存期間，本發明的發明人監測并收集了與紅細胞健康有關的數據。如
圖1和2所示，根據本發明進行的貯存使紅細胞在小容量下和較長的貯存期內有更好的質量。如上所述，血貯存“損傷”是凋亡事件，紅細胞膜經歷了生理和形態改變，這相當于程序性細胞死亡。在貯存期間，已知紅細胞膜的表面積在下降，由此其形狀就變為雙凹形，這能使每體積下的表面積最大，使氣體和營養素容易擴散，以致到更加呈球型的形狀，這是一種死亡特征。紅細胞膜最初是柔軟和可變形的，易于通過小毛細管。全部的形狀變化伴隨著擠壓微泡(microvesicles)的膜,在紅細胞外表面形成針突(spicules),由此,據觀察,細胞在這個過程的末期就類似于刺狀的刺猬(因此這個過程指的是棘狀紅細胞增多性變化，在細胞溶解前的最終形狀被稱為棘紅細胞)。隨之而來的脆弱最終導致細胞溶解和死亡。確定溶血速率能作為這個活動范圍和嚴重度的指標。除在貯存期間引起無法接受的溶血水平外， 這些形態變化都在再灌注了被貯存紅細胞的受體患者內觸發了清除機制，這降低了輸注后的復原并降低了輸注效率。使用根據本發明的組合物和使用了該組合物的保存紅細胞的方法，使得滲透脆性降低以及溶解速率降低。這相應地提高了細胞膜表面積的保持力和形態狀況,并因此提高了活性紅細胞的復原并降低了輸注后被再灌注的紅細胞從受體患者體內的清除。
本發明的一個實施方案提供了在貯存期間改善紅細胞(RBC)膜的保持力和抑制 RBC凋亡的方法。該方法包含在貯存期間于懸液中貯存RBCs，其中懸液內已經加入了本發明的組合物。在具體的實施方案中，微泡的濃度，與在含有AS-3的RBC懸液中貯存相同時間的紅細胞所觀察到的濃度相比，降低了約75%。
本發明的另一個實施方案提供了在貯存期間降低紅細胞(RBC)脆性并抑制RBC溶血的方法。該方法包含在貯存期間于懸液中貯存RBCs，其中懸液內已經加入了本發明的組合物。另一個實施方案針對的是在貯存后和輸注到需要這種輸注的患者體內后能提高紅細胞(RBCs)的成活力，并降低患者RBCs輸注后清除率的方法。該方法包含在貯存期間于懸液中貯存RBCs，其中懸液內已經加入了本發明的組合物。
本發明的添加溶液組合物與現有技術的添加溶液相比有幾個優點。貯存在其中的紅細胞可以貯存更長時間，至少為8周，與目前許可的溶液相比，在體內24小時復原中有更好的放射鉻-標記的RBC。使用本發明的組合物能明顯地減少貯存損傷的范圍和嚴重度。 在貯存期間，紅細胞出現了可接受的溶血范圍:在6周時為0.2%，在8周時為0.4%，在許可的貯存末期所有的都在FDA限制的1%以下。貯存在本發明添加溶液中的紅細胞在貯存期間表現出更少的膜損失，如膜微泡的濃度降低和滲透脆性降低所證明的那樣。貯存期間對膜的保護預期能有助于貯存在溶液中的RBC以使其與失去更多膜的細胞相比具有更好的流動性。保持正常膜的生理性也抑制了存在于受體患者體內的機制，這個機制觸發了循環中的選擇性清除和紅細胞的破壞。因此，受體患者中的再灌注紅細胞就能維持更長時間， 并提高了再灌注紅細胞的長期復原。此外，輸注紅細胞的存活時間提高應該會減少重復輸注的需要由此對患者來說降低了與之相關的危險。本發明的溶液還能允許在貯存晚期有較高的RBC ATP濃度，這預期能使RBC ATP更好地分泌并因此在細胞被輸注后改善其流動性和存活力。實際上，本發明的溶液能在與常規收集系統一起工作時被使用，其中該系統在 CPD或CP2D中收集全血以生成新鮮的冷凍血漿和隨機的供體血小板，或在緊急關頭收集新鮮的全血。
以下提供的實 施例僅用于說明目的，其不應該被解釋為是對本發明范圍的限制， 范圍如權利要求所確定。實施例
表I
受試的添加溶液組合物
權利要求
1.在約l°c到約6°C下貯存紅細胞的含水組合物，該組合物主要由以下物質組成 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一種非可代謝膜保護劑糖和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
2.在約I到約6°C下貯存紅細胞的含水組合物，該組合物包含 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一種非可代謝膜保護劑糖和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益，其中，所述的組合物基本上不含外源的氯離子。
3.在貯存期間改善紅細胞(RBC)膜的保持力和抑制RBC凋亡的方法，該方法包含在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權利要求I所述的組合物的懸液中。
4.在貯存期間降低紅細胞(RBC)脆性并抑制RBC溶血的方法，該方法包含在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權利要求I所述的組合物的懸液中。
5.提高貯存后和輸注到需要這種輸注的患者體內后紅細胞(RBCs)的成活力，降低患者RBCs輸注后清除率的方法，該方法包含在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權利要求I所述的組合物的懸液中。
6.保存紅細胞(RBCs)經過一段貯存時間的方法，其包含 (a)將包含有待貯存的RBCs和血漿的經收集的全血樣品與抗凝劑溶液混合形成所收集的全血的懸液； (b)對收集的全血懸液經行處理以除去血漿并濃縮RBCs，由此形成濃縮的RBCs； (c)將濃縮的RBCs與一定量的含水組合物混合，其中該量足以使RBCs懸液有約27%到約70%體積的RBCs ； (d)冷卻RBCs懸液至約1°C到6°C，以及 (e)根據標準貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液 其中含水組合物主要由以下物質組成腺嘌呤； 右旋糖； 至少一種非可代謝膜保護劑糖和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
7.保存紅細胞(RBCs)經過一段貯存期間的方法，其包含 (a)將包含有待貯存的RBCs和血漿的經收集的全血樣品與抗凝劑溶液混合，由此形成所收集的全血的懸液； (b)對收集的全血懸液經行處理以除去血漿并濃縮RBCs，由此形成濃縮的RBCs； (c)將濃縮的RBCs與一定量的含水組合物混合，其中該量足以使RBCs懸液具有標準血庫操作規定范圍內的RBCs體積百分比； (d)冷卻RBCs懸液至約1°C到6°C，以及 (e)根據標準貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液 其中含水組合物主要由以下物質組成 腺嘌呤； 右旋糖； 至少一種非可代謝膜保護劑糖和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
8.保存紅細胞(RBCs)經過一段貯存時間的方法，其包含 (a)將包含有待貯存的RBCs和血漿的經收集的全血樣品與抗凝劑溶液混合，由此形成所收集的全血的懸液； (b)對收集的全血懸液進行處理以除去血漿并濃縮RBCs，由此形成濃縮的RBCs； (c)將濃縮的RBCs與約60mL到約400mL的含水組合物混合； (d)冷卻RBCs懸液至約1°C到6°C，以及 (e)根據標準貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液 其中含水組合物主要由以下物質組成 腺嘌呤； 右旋糖；至少一種非可代謝膜保護劑糖和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
9.含有位于貯血袋中的權利要求I組合物的組合，其中該貯血袋有足夠的容積以便能包含約60ml到約400ml體積的添加溶液和約270ml到約2250ml體積的全血。
10.摩爾滲透壓濃度為270m0sm的含水組合物，其用于在約I到約6°C下貯存紅細胞約8周，其中組合物主要由以下物質組成 2mM腺嘌呤； 80mM右旋糖； 55mM至少一種非可代謝膜保護劑糖例如甘露糖醇；和 pH緩沖系統， 其中PH緩沖系統含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的PH緩沖系統以足以使有待加入上述組合物的紅細胞(RBC)懸液的PH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3_ 二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應平衡，由此在貯存期間的所述反應平衡中產生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
全文摘要
本發明提供了用于貯存紅細胞的方法，其基本上由以下物質組成腺嘌呤；右旋糖；至少一種非可代謝膜保護劑糖和具體定義的pH緩沖系統。還提供了保存紅細胞的改進方法和增加貯存紅細胞存活力，膜保存力和復原性并抑制凋亡、溶血和再輸注后清除率的方法，其中使用了新穎的組合物。
文檔編號A01N1/02GK103250694SQ20131006911
公開日2013年8月21日 申請日期2005年2月17日 優先權日2005年2月17日
發明者J.R.赫斯, T.G.格林沃爾特 申請人:辛辛那提大學