專利名稱：一種遠緣雜交和多倍體化選育構樹桑樹新雜種的方法
技術領域：
本發明涉及一種遠緣雜交和多倍體化選育構樹桑樹新雜種的方法，屬于現代農業的樹木育種技術領域。
背景技術：
構樹是桑科(Moraceae)構樹屬落葉喬灌木,根系發達,韌皮纖維極發達,其適應性極強，極耐干旱、瘠薄和濕熱，極少有病蟲害，而且葉含豐富蛋白質，被譽為“生態恢復先鋒”，并廣泛用于飼料工業，但其木質較差，主干性不明顯，局限了其在木材市場和行道園林上的應用。而桑樹作為我國重要的經濟林木之一，材質優良、主干性明顯，其最主要價值在于養蠶和高檔家具市場用材，但它在抗病蟲害方面表現較差，易被桑天牛等害蟲取食，其在生態適應性上也存在一定的局限。有必要對栽培桑樹和構樹進行生殖工程性的品種改良。本方法利用生殖工程技術，突破栽培桑樹與野生構樹雜交障礙，通過構樹和栽培桑樹的遠緣雜交和多倍體化，充分整合二者之間的優勢，將兩者的優異基因結合在遠緣雜交多倍體雜種中，培育出豐產速生、材質優良、適應性強的優良經濟型新樹種。既為桑樹和構樹育種開創新途徑，也為新雜種廣泛應用于木材加工、行道園林、飼料工業和生態恢復工程創造良好條件。

發明內容
本發明的目的是提出一種遠緣雜交和多倍體化選育構樹和桑樹新雜種的方法，是通過生殖工程性品種改良技術，對遠緣雜種進行胚胎工程、組織培養技術，建立獲得雜交果、誘導雜交果愈傷組織加倍形成遠緣雜交多倍體雜種系，以用于解決現有構樹的主干不明，材質較差和桑樹適應性不強的問題。
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本發明的技術方案為:a.遠緣雜種果實的獲得；b.雜交果的愈傷組織誘導；c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理；d.處理后愈傷組織的恢復培養；e.愈傷組織分化出芽苗；
f.芽苗分化出根；g.組培植株的移植；h.成活植株的比較觀察與選擇；1.選株的無性擴繁成穩定品種(系)。本發明的具體過程為:
a.遠緣雜種果實的獲得
遠緣雜種是以優良桑樹品種和野生構樹為親本，利用構樹桑樹雌雄異株的特性，選用雌構樹為母本進行套袋，父本桑樹的花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在底層有干燥劑的干燥器中儲存。在構樹品種始花至終花、柱頭上出現粘液時，分2次 3次授粉(用毛筆挑花粉散點于帶粘液的柱頭上)，授粉后每隔一天對雜交果噴施激素(50mg/L-100mg/lGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA) 2周后，獲得雜交果；
b.雜交果的愈傷組織誘導
取回雜交果經流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒8 IOmin，再用無菌水洗3次 4次。將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄。再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈傷組織誘導培養基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養。20天-25天果實發生膨大并在果實中心處或切面出現緊密的乳白色團狀愈傷組織；
所述雜交果的愈傷組織誘導培養基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ；
c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理
當雜交果愈傷組織生長到40天-45天時,將愈傷組織置于添加500mg/L 750mg/L秋水仙素，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養液中，放在溫室(26°C)搖床上，在100轉 120轉/分鐘的速度下旋轉培養處理48hr 60hr ；
所述加倍培養基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA+500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 鹿糖，ρΗ5.8 ；
d.處理后愈傷組織的恢復培養
雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經無菌水沖洗和吸干表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導培養基上，恢復培養7天；
e.愈傷組織分化出芽苗
經恢復培養的愈傷組織接種到分 化培養基中分化培養，15天-20天后愈傷組織出現綠芽，25天-35天后陸續分化出芽苗，并可見叢苗出現；
所述分化培養基配方為:MS + 2.0mg/L 3.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ；
f.芽苗分化出根
當芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm高時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養基中，25天-30天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養植株；
所述生根培養基配方為:1/2 MS +0.lmg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA +2% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8
g.組培植株的移植
當組培植株生長到8.0cm-12.0cm高、具有I條 3條根的時候，將進行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養瓶蓋打開，每瓶添加IOml 15ml無菌水，放到常溫的實驗室內緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細砂+15%園土的基質中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(50%遮光率);然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網和薄膜，使組培苗健壯生長；
h.成活植株的比較觀察與選擇
根據雜種植株和親本植株外部形態的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來，采用SSR分子標記對其進行序列比對，即使用同一 SSR引物對雜種和親本基因組體外擴增，將擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，比較雜種和親本基因組標記序列相似度，結果被測植株顯示兩個親本植物的標記而確定為構桑雜種；經根尖染色體檢查區分二倍體雜種和多倍體雜種；
1.選株經無性擴繁成穩定品種(系)將已確定為構樹桑樹雜種(2X，4X)的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內插植于苗床上進行無性擴繁，而成為穩定的雜合體構樹桑樹品種(系)。經上述步驟選育的多倍體構樹桑樹雜種品種(系)具有幾種優良效果:
1.利用雜交果誘導愈傷組織，誘導頻率高，而且能夠在培養基中生長，吸收營養快，生長速度快。2.用雜交果愈傷組織進行染色體加倍，誘導效果比整體小苗處理效果好，而且再分化出苗后產生嵌合體的頻率低。3.通過生殖工程技術培育的遠緣雜種具有主干明顯，材質優良，適應性極強，極耐干旱、瘠薄和濕熱，少有病蟲害的顯著優勢，因此在木材加工和高檔家具市場極具潛力，擁有的廣闊的市場前景；
4.遠緣新雜種多倍體化后韌皮纖維發達，枝干粗壯，枝葉繁茂既具有抗折斷、蔭蔽面積大的優勢，又是非常優良的行道樹種，在行道園林上有很大的推廣價值；
5.遠緣雜交多倍體品種蛋白質含量高，是十分理想的飼料工業原料，雜種可能出現不育現象而無果不會被鳥類所取食，具有很好的經濟價值和環境保護效果。


圖1為本發明雜交果圖片；
圖2為本發明雜交果培養產生的乳白色團狀愈傷組織圖片；
圖3為本發明雜交果愈傷組織 分化出芽圖片；
圖4為本發明雜交果愈傷組織分化出叢芽圖片；
圖5為本發明芽分化出根成完整構樹桑樹雜交苗圖片。
具體實施例方式下面以實施例對本發明進一步說明:
a.遠緣雜種果實的獲得
選擇湖北省農科院桑樹種質資源庫中優良桑樹品種鄂桑2號、湖桑32號和在中國農科院油料所中的野生構樹GSf-Ol為親本，利用構樹桑樹雌雄異株的特性，以構樹為母本進行套袋處理；父本桑樹花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在有生石灰的干燥器中儲存。在構樹GSf-Ol始花至終花、柱頭上出現粘液時，分3次授粉(用毛筆挑花粉散點于帶粘液的柱頭上)，授粉后每隔一天對雜交果噴施激素液2周，獲得雜交果(附圖片I)；
b.雜交果的愈傷組織誘導
取回雜交果經流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒IOmin，再用無菌水洗4次。將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄。再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈傷組織誘導培養基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養。20天-25天果實發生膨大并在果實中心處或切面出現緊密的乳白色愈傷組織(附圖片2);所述雜交果的愈傷組織誘導培養基配方為=MS +2.0mg/L 6-BA + 0.lmg/L NAA + 4%蔗糖+ 0.75%瓊脂，ρΗ5.8 ；
c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理
當雜交果愈傷組織生長到40天 45天時，將愈傷組織置于MS+2.0mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+750mg/L秋水仙素+4%蔗糖，pH5.8，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養液中，放在溫室(26 °C)搖床上，在100轉/分鐘的速度下旋轉培養48hr ；
d.處理后愈傷組織的恢復培養
雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經無菌水沖洗和表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導培養基上，恢復培養7天；
e.愈傷組織分化出芽苗
經恢復培養的愈傷組織接種到MS+3.0mg/L6-BA+0.lmg/LNAA +3%蔗糖+0.75%瓊脂，pH5.8的分化培養基中分化培養。15天-20天后愈傷組織出現綠芽附圖片3，25天-35天后陸續分化出芽苗，并可見叢苗出現(附圖片4);
f.芽苗分化出根
當芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm時，將芽苗 靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養基(1/2MS+0.3mg/LNAA+lmg/L IBA+2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8)中，25 天-30 天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養植株(附圖片5)；
g.組培植株的移植
當組培植株生長到8.0cml 2.0cm高，具有I條 3條的時候，將進行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養瓶蓋打開，每瓶添加15ml無菌水，放到常溫的實驗室內緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細砂+15%園土的基質中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(50%遮光率)。然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網和薄膜，使組培苗健壯生長；
h.成活植株的比較觀察與選擇
根據雜種植株和親本植株外部形態的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來采用SSR分子標記對其進行序列比對，將擴增產物經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，所得結果顯示被測植株表現出父母本特有譜帶的確定為構桑雜種；經根尖染色體檢查區分二倍體雜種和多倍體雜種；
1.選株經無性擴繁成穩定品種(系)
將已確定為構樹桑樹雜種(2X，4X)的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內插植于苗床上進行無性擴繁，而成為穩定的構樹桑樹雜種品種(系)。
權利要求
1.一種遠緣雜交和多倍體化選育構樹桑樹新雜種的方法，其特征在于選育過程為: a.遠緣雜種果實的獲得 遠緣雜種是以生長旺盛，無病蟲害的優良桑樹品種和野生構樹為親本，利用構樹桑樹雌雄異株的特性，選用雌構樹為母本進行套袋，父本桑樹的花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在底層有干燥劑的干燥器中儲存；在構樹品種始花至終花、柱頭上出現粘液時，分2次 3次授粉，授粉后每隔一天對雜交果噴施50mg/L-100mg/LGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA的激素，2周后，獲得雜交果； b.雜交果的愈傷組織誘導 取回雜交果經流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒8 IOmin，再用無菌水洗3次 4次，將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄，再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈 傷組織誘導培養基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養，20天-25天果實發生膨大并在果實中心處或切面出現緊密的乳白色團狀愈傷組織； 所述雜交果的愈傷組織誘導培養基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理 當雜交果愈傷組織生長到40天-45天時,將愈傷組織置于添加500mg/L 750mg/L秋水仙素，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養液中，放在溫室(26°C)搖床上，在100轉 120轉/分鐘的速度下旋轉培養處理48hr 60hr ； 所述加倍培養基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA +500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 鹿糖，ρΗ5.8 ； d.處理后愈傷組織的恢復培養 雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經無菌水沖洗和吸干表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導培養基上，恢復培養7天； e.愈傷組織分化出芽苗 經恢復培養的愈傷組織接種到分化培養基中分化培養，15天-20天后愈傷組織出現綠芽，25天-35天后陸續分化出芽苗，并可見叢苗出現； 所述分化培養基配方為:MS + 2.0mg/L 3.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； f.芽苗分化出根 當芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm高時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養基中，25天-30天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養植株； 所述生根培養基配方為:1/2 MS +0.lmg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA +2% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； g.組培植株的移植 當組培植株生長到8.0cm-12.0cm高、具有I條 3條根的時候，將進行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養瓶蓋打開，每瓶添加IOml 15ml無菌水，放到常溫的實驗室內緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細砂+15%園土的基質中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(50%遮光率);然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網和薄膜，使組培苗健壯生長； h.成活植株的比較觀察與選擇 根據雜種植株和親本植株外部形態的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來，采用SSR分子標記對其進行序列比對，即使用同一 SSR引物對雜種和親本基因組體外擴增，將擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，比較雜種和親本基因組標記序列相似度，結果被測植株顯示兩個親本植物的標記而確定為雜合體，經根尖染色體檢查區分二倍體雜種和多倍體雜種；. 1.選株經無性擴繁成穩定品種 將已確定為構樹桑樹雜合體的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內插植于苗床上進行無性擴繁，而成為穩定的雜合體構樹桑樹品 種。
全文摘要
本發明提出了一種遠緣雜交和多倍體化選育構樹桑樹新雜種的方法，它是通過生殖工程性品種改良技術，對遠緣雜種進行胚胎工程、組織培養技術，建立了誘導雜交果愈傷組織加倍形成遠緣雜交多倍體雜種系，步驟為a.遠緣雜種果實的獲得；b.雜交果的愈傷組織誘導；c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理；d.處理后愈傷組織的恢復培養；e.愈傷組織分化出芽苗；f.芽苗分化出根；g.組培植株的移植；h.成活植株的比較觀察與選擇；i.選株的無性擴繁成穩定品種(系)。本發明解決了現有桑樹生長緩慢，適應性不強和構樹主干不明，材質較差的問題，而培育出主干明顯、適應性強、材質較好的多倍體構樹桑樹新雜種。
文檔編號A01H4/00GK103168676SQ20131007329
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者王東鵬, 陳小芳, 潘超虎, 屈海波, 王維, 杜明芳, 宋兆建, 何玉池, 蔡得田 申請人:湖北大學