專利名稱：一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，屬于植物繁殖技術。
背景技術：
在現(xiàn)有技術中，煙草iaAacw )是爺科煙草屬一年生草本植物。煙草除應用于卷煙工業(yè)，還可在開發(fā)食品和藥物資源方面有諸多潛在用途。煙葉富含蛋白質，利用鮮煙葉提取蛋白，其畝產(chǎn)量可超過大豆，其他作物更無法相比。煙葉提取的蛋白可制作多種食品，剩下的煙葉仍可用作卷煙的原料。從煙葉中提取煙堿制成醫(yī)藥可防治人們的病患，制成農(nóng)藥可防治農(nóng)作物害蟲，其前景也是可觀的。煙草是著名的模式作物，可當作生物反應器將其他作物的抗癌、抗艾滋病以及有益于人們健康的基因導入煙草，使其充分表達后利用生物技術提取，進一步加工成藥物。如美國科學家已成功培養(yǎng)出抗體煙草，從中提取抗癌和抗病毒干撓素，對肺癌有良好的治療作用。瑞典科學家將人體基因注入煙草植株，從收獲的煙葉中提出血液蛋白質活化劑，可醫(yī)治心臟病等。由此看出，煙草有益于健康的潛在用途并不比用作卷煙所起的經(jīng)濟效益少。目前，為適應卷煙工業(yè)的需要，在全國煙草種植區(qū)內(nèi)大力發(fā)展烤煙種植，但是國內(nèi)煙葉總體質量較低，與國外特別是美國的煙葉相比有一定差距。出口國外價格低，使用價值不高，只能用作填充料。除煙草種植區(qū)劃、施肥、成熟度、烤煙設施和工藝外，大多是煙草病毒病的存在，導致煙草產(chǎn)量和質量的降低。煙草病毒病主要有普通花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、馬鈴薯Y病毒病、蝕紋病毒病。我國各煙區(qū)都普遍發(fā)生，以云南、貴州、四川、黑龍江、吉林和遼寧等省受害較重。據(jù)調(diào)查，受害煙田達30% 70%。使煙葉內(nèi)在品質下降，失去烘烤價值。 以上病毒中，危害較大且普遍的病毒為花葉病毒Tobacco mosaic virus (TMV),該病毒病自苗床期至大田成株期均可發(fā)生。移栽后20天到現(xiàn)蕾期，為發(fā)病高峰期，打頂后田間病株仍旱上升趨勢，但主要在煙杈上顯癥，為害不大。幼苗被侵染后，新葉的葉脈組織變淺綠色，呈半透明的“明脈癥”，迎光透視可見病葉大小葉脈十分清晰，幾天后葉片形成黃綠相間的“花葉癥”。大田期，煙株受侵染后，首先在心葉上發(fā)現(xiàn)“明脈”現(xiàn)象，爾后呈現(xiàn)花葉、泡斑、畸形、壞死等典型癥狀。輕型花葉只在葉片上形成黃綠相間的斑駁，葉形不變。以往防治多采用高效、高毒、高殘留的化學藥物進行防治，這就導致煙草中含有農(nóng)藥殘留，使煙草質量和價格降低。我國應該堅持科技興煙，提高烤煙質量，以抗病強品種選育和無病毒煙苗研究為方向的發(fā)展模式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種方法簡單、操作方便、效果好的試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法。本發(fā)明的技術解決方案是:一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其步驟如下:
(I)將烤煙型煙草品種的種子播于苗盤中，待種子萌發(fā)且苗長至3 5 Cm時，得處理后莖尖作為外植體備用。(2)莖尖接種至附加吲哚乙酸0.02 0.05 mg.171和赤霉素1.50 1.70 mg. Λ食用白糖10 g.L—1，瓊脂條8.5 g.L—1的基本培養(yǎng)基中進行脫除煙草花葉病毒培養(yǎng)；基本培養(yǎng)基成份及使用用量:174 mg.I/1 (NH4)2SO4, 360 mg.T1KNO3,122.5 mg.T1MgSO4.7H20，218 mg.IZ1KH2PO4 ；18.4 mg.IZ1FeSO4.7H20, 24.9 mg.IZ1Na2.EDTA.2H20 ；12.4mg.L-1MnSO4.4H20, 7.2 mg.L-1ZnSO4.7H20，0.32 mg.L-1KI。優(yōu)選吲哚乙酸 0.02 mg.L-1和赤霉素1.50 mg.L'(3)培養(yǎng)溫度控制在52 54 °C，培養(yǎng)48 54 d后，實現(xiàn)煙草花葉病毒脫除。(4)當莖尖生長至1.0 cm時，即可切割0.05 cm的莖尖進一步開展無毒苗培養(yǎng)。步驟(I)中處理是指將2 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S,用飽和次氯酸鈉溶液浸泡5 min,無菌水沖洗8次,用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切取0.05 0.20 cm的莖尖。進行脫毒種苗高效快繁體系的建立；具體是待無毒莖尖生長至1.0 1.5 cm和基部生根后，在無菌條件下打開培養(yǎng)瓶，將植株留2葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述基本培養(yǎng)基中進行腋芽萌發(fā)生長及莖段基部生根培養(yǎng)。進行煉苗和移栽；具體是待無毒莖段基部發(fā)出3 5條根且長至1.0 cm以上，苗高達2 cm時，從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，在含有5 mg.L—1高錳酸鉀溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)300倍液多菌靈消毒過的腐爛松針、草炭土和細河砂=3:2:1混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在70%，溫度控制在22±2 °C，每天自然光照10 h，每天中午揭 開部分塑料薄膜進行通風換氣30 min, 10 d后揭去薄膜，每天早晨噴灑清水I次，無毒苗成活率達95.0%以上。本發(fā)明的優(yōu)點是:1、本發(fā)明開展了煙草脫毒技術研究，直接以無菌系煙草莖尖(小于1.0 Cm)為材料，采用莖尖和高溫聯(lián)合脫毒的集成方法對煙草進行了脫毒，并取得了顯著效果，解決了以往莖尖脫毒需要莖尖極小和高溫脫毒導致植株生長發(fā)育變態(tài)后植株活力差及死亡，操作難度大，脫毒不完全等缺點。2、利用脫毒后的植株莖節(jié)采用節(jié)增殖方式的一步成苗對脫毒苗進行了快速繁殖，此方法解決了以往方法的不足，并對為無公害栽培煙草提供優(yōu)質種苗，可直接應用于無花葉病毒煙草種苗的工廠化生產(chǎn)，對煙草行業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要意義。3、腋芽萌發(fā)生長及莖段基部生根培養(yǎng)，成苗率可達99.3%。無毒苗成活率達
95.0%以上。下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施例方式I材料與方法
1.1外植體材料來源與處理
煙草種子為烤煙型紅花煙草品種，將種子播于苗盤中，待種子萌發(fā)且苗長至3 5 Cm時，將2 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗8次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切取1.0 cm的莖尖作為外植體備用。1.2煙草花葉病毒完全脫除的莖尖長度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間篩選
基本培養(yǎng)基成份及使用用量:174 mg.Γ1 (NH4)2SO4, 360 mg.T1KNO3,122.5mg.L-1MgSO4.7Η20，218 mg.L-1KH2PO4 ；18.4 mg.L-1FeSO4.7Η20，24.9 mg.L-1Na2.EDTA.2Η20 ；12.4 mg.L-1MnSO4.4Η20, 7.2 mg.L-1ZnSO4.7Η20,0.32 mg.L-1KI。基本培養(yǎng)基中附加吲哚乙酸ΙΑΑ0.02 0.05 mg.L4和赤霉素GA3 1.50 1.70 mg.171,添加食用白糖10 g.L-1,瓊脂條8.5 g.L_\ pH 5.8。將外植體材料嫩莖尖分別切割成0.40 0.80 cm的大小接種到培養(yǎng)基中，待基部生根后，置于溫度為30 50 °C條件下，培養(yǎng)15 42 d過程中，每隔3天檢測脫毒率。為了提高煙草花葉病毒的脫除速度和脫毒率，采用均勻設計法設計實驗，每個處理數(shù)接種莖尖數(shù)為10個，重復3次取平均值，選用U10 (103)均勻表，篩選煙草花葉病毒全部脫除的最佳莖尖長度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。病毒檢測方法采用試紙條法進行煙草花葉病毒的快速檢測，將試紙條的膠體金復合物端插入300 400 μ 離心后的檢測樣品中，10 min后可根據(jù)檢測線和質控線顏色變化來判斷是否脫除病毒的簡易方法，當檢測線和質控線都出現(xiàn)紅色時，證明病毒未脫除；只有質控線變紅時，說明病毒已脫除。脫毒率計算方法:脫毒率(%) = (無病毒莖尖數(shù)/接入莖尖總數(shù))X 100%ο1.3煙草脫毒苗的高效快繁體系建立和煉苗移栽
以全部脫毒的莖尖為材料，將無毒莖尖接種至附加吲哚乙酸ΙΑΑ0.02 0.05 mg.Γ1和赤霉素GA3 1.50 1.70 mg.ΙΛ食用白糖10 g. Λ瓊脂條8.5 g.Γ1的基本培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，在溫度(24±2)°C，光照強度1200 lx，光照周期12 h.cf1條件下培養(yǎng)。待莖尖生長至需要高度和莖尖基部生根時，在無菌條件下打開培養(yǎng)瓶，將植株留2葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述培養(yǎng)基中進行腋芽萌發(fā)生長及莖段基部生根培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，待莖段生根和苗生長到一定高度時，統(tǒng)計計算出增殖周期和倍數(shù)。待無毒莖段基部發(fā)出一定數(shù)量根且長至需要高度時，從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，在含有高錳酸鉀溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)多菌靈消毒過的腐爛松針、草炭土和細河砂(3:2:1)混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，每天注意自然光照，通風換氣，待苗成活并開始生長后揭去薄膜，每天適當噴灑清水。2結果與分析 2.1煙草莖尖長度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對煙草花葉病毒脫除的影響 表I影響煙草花葉病毒脫除主要因素的Ultl (103)試驗設計與結果
權利要求
1.一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步驟如下: (1)將烤煙型煙草品種的種子播于苗盤中，待種子萌發(fā)且苗長至3 5Cm時，得處理后莖尖作為外植體備用； (2)莖尖接種至附加吲哚乙酸0.02 0.05 mg.L-1和赤霉素1.50 1.70 mg.L-1，食用白糖10 g.L—1，瓊脂條8.5 g.L—1的基本培養(yǎng)基中進行脫除煙草花葉病毒培養(yǎng)；基本培養(yǎng)基成份及使用用量:174 mg.I/1 (NH4)2SO4, 360 mg.T1KNO3,122.5 mg.T1MgSO4.7H20，218 mg.IZ1KH2PO4 ；18.4 mg.IZ1FeSO4.7H20, 24.9 mg.IZ1Na2.EDTA.2H20 ；12.4mg.L-1MnSO4.4H20, 7.2 mg.L-1ZnSO4.7H20，0.32 mg.L-1KI ； (3)培養(yǎng)溫度控制在52 54°C，培養(yǎng)48 54 d后，實現(xiàn)煙草花葉病毒脫除； (4)當莖尖生長至1.0 cm時，即可切割0.05 cm的莖尖進一步開展無毒苗培養(yǎng)。
2.按照權利要求1所述的一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步驟(I)中處理是指將2 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S,用飽和次氯酸鈉溶液浸泡5 min,無菌水沖洗8次,用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切取0.05 0.20 cm的莖尖。
3.按照權利要求1或2所述的一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其特征在于進行脫毒種苗高效快繁體系的建立；具體是待無毒莖尖生長至1.0 1.5cm和基部生根后，在無菌條件下打開培養(yǎng)瓶，將植株留2葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述基本培養(yǎng)基中進行腋芽萌發(fā)生長及莖段基部生根培養(yǎng)。
4.按照權利要求3所述的一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其特征在于進行煉苗和移栽；具體是待無毒莖段基部發(fā)出3 5條根且長至1.0 cm以上，苗高達2 cm時，從培養(yǎng)瓶中 取出試管苗，在含有5 mg.L—1高錳酸鉀溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)300倍液多菌靈消毒過的腐爛松針、草炭土和細河砂=3:2:1混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在70%，溫度控制在22±2 °C，每天自然光照10 h，每天中午揭開部分塑料薄膜進行通風換氣30 min, 10 d后揭去薄膜，每天早晨噴灑清水I次，無毒苗成活率達95.0%以上。
5.按照權利要求1所述的一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中吲哚乙酸0.02 mg.Γ1和赤霉素1.50 mg.L'
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試管內(nèi)脫除煙草花葉病毒和無毒苗的快速繁殖方法。其步驟如下(1)將烤煙型煙草品種的種子播于苗盤中，待種子萌發(fā)得處理后莖尖作為外植體備用。(2)莖尖接種至附加吲哚乙酸0.02～0.05mg·L-1和赤霉素1.50～1.70mg·L-1，食用白糖10g·L-1，瓊脂條8.5g·L-1的基本培養(yǎng)基中進行脫除煙草花葉病毒培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)溫度控制在52～54℃，培養(yǎng)48～54d后，實現(xiàn)煙草花葉病毒脫除。(4)當莖尖生長至1.0cm時，即可切割0.05cm的莖尖進一步開展無毒苗培養(yǎng)，可直接應用于無花葉病毒煙草種苗的工廠化生產(chǎn)。腋芽萌發(fā)生長及莖段基部生根培養(yǎng)，成苗率可達99.3%。無毒苗成活率達95.0%以上。
文檔編號A01H4/00GK103109745SQ201310074450
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月10日 優(yōu)先權日2013年3月10日
發(fā)明者顧地周, 顧川岳, 陸爽, 姜云天, 朱俊義, 程廣有, 禚玲玲, 張學士, 王秋爽, 付航, 潘雨 申請人:通化師范學院