一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)Z5菌株，已于2014年3月24日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2014102。本發明菌株Z5的發酵液對煙草普通花葉病毒(TMV)具有抑制作用，利用局部枯斑法測得其無菌發酵液對TMV體外抑制率達到96％以上；利用上述發酵液沉淀制得的粗蛋白液對煙草普通花葉病毒同樣具有抑制作用，抗病毒效果佳，田間防效較為顯著，能有效降低煙草普通花葉病毒的發生。
【專利說明】一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，同時涉及由該菌株發酵液得到的拮抗粗蛋白成分在煙草普通花葉病毒防治方面的應用。
【背景技術】
[0002]煙草普通花葉病毒(Tobacco mosaic virus,簡稱TMV),是目前為止在煙草生產上分布最廣且發生普遍的一大類病害。我國已發現的煙草病毒病有16種，其中TMV、CMV、PVY等3種病毒是引致煙草花葉病的主要病毒。它們能在植物細胞中寄生、復制，所需的物質、能量和場所也來源于寄主。煙草感染病毒后，葉綠素被破壞，光合作用減弱，葉片生長受抑制，防治較為困難，減產幅度為20% -80%，全球每年煙草花葉病毒造成的損失可達I億多美兀。
[0003]近年來，由于農作物布局的改變以及蔬菜等經濟作物的發展，導致病毒毒源作物和傳播介體的數量增加，增加了病毒的侵染和危害，使其危害呈逐年上升的趨勢，給煙葉生產造成巨大的損失，病毒病已成為目前煙草生產的主要限制因子。
[0004]長期以來，防治病毒病以化學防治和培育抗病毒品種為主，在化學藥劑防治方面，目前令人滿意的抗植物病毒劑實用化品種還不多，尤其特效的治療性藥劑更少，所報道的藥劑在田間實際應用防效大多在60%以下。而且化學防治也存在著許多的問題，大量施用化學農藥，造成農藥殘留、食品安全、有害生物再猖獗和嚴重的生態環境污染問題。選育抗病品種被認為是防治煙草花葉病毒病的經濟而有效的途徑。但目前尚無優質高抗的品種可以大面積推廣。
[0005]生物防治因其活性物質源于自然，使用成本低、不殺傷天敵、無殘留、病蟲害不易產生抗藥性，與環境的相容性高，對人畜較安全，符合綠色無公害煙葉生產的要求。
[0006]自1926年Mulvania發現被細菌污染的植物病毒會喪失侵染能力后，微生物及其代謝產物對TMV的抑制作用的研究迅速發展起來并取得了不少成果。因此本發明將從生物防治方面進行探索，篩選出對TMV具有拮抗作用的生防菌并進行室內盆栽試驗，對其拮抗活性物質、拮抗作用方式、大田拮抗效果進行較為深入的研究。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Z5菌株,為煙草普通花葉病毒的生物防治提供新的微生物資源。
[0008]本發明所述的解淀粉芽孢桿菌Z5 (Bacillus amyloliquefaciens) Z5菌株，已于2014年3月24日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址:中國武漢武漢大學，保藏編號為 CCTCC NO:M2014102o
[0009]本發明的菌株Z5具有如下特性:
[0010]本發明的菌株Z5于28 °C在NA培養基平板上生長，菌落呈白色不透明，無光澤，邊緣不規則，結合參見圖1，初期水潰狀、較粘，后期褶皺狀。革蘭氏染色陽性，內生芽孢(見圖2A)，具莢膜(見圖2B)和鞭毛(見圖2C)，為兩端鈍圓的短桿狀菌體。
[0011]提取本發明菌株的細菌基因組DNA，16S rDNA片段采用通用引物27F/1492R進行PCR擴增，擴增片段由上海生物工程有限公司測序，測得的序列于NCBI上進行同源性比較。結果顯示其16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌同源性最高，達到98%以上。經Biolog檢測，拮抗菌株Z5與Bacillus amyloliquefaciens B相似性為0.543,遠大于其他菌株相似度，符合鑒定條件。通過形態觀察和ITS序列分子鑒定，確定本發明菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一新種，命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Z5 菌株。
[0012]將本發明的菌株Z5以4-5%接種重量接入NB培養基中發酵培養可制得發酵液，發酵培養條件為:溫度28-37°C、pH6.5-7.5、時間48_72h及轉速150_220r/min，最佳發酵培養條件為--溫度32°C、pH7.0、時間64h及轉速180r/min。該發酵液對煙草普通花葉病毒(TMV)具有抑制作用，利用局部枯斑法測得其無菌發酵液對TMV體外抑制率達到96 %以上；涂抹菌液6h和24h后預防效果仍有71.43%和42.86%，但治療作用微小。
[0013]利用上述發酵液沉淀可制得粗蛋白液，該粗蛋白液對煙草普通花葉病毒具有抑制作用，粗蛋白液抗病毒效果為87.21% ;田間防效較為顯著，能有效降低煙草普通花葉病毒的發生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發明的菌株Z5的單菌落圖。
[0015]圖2是本發明 的菌株Z5的芽孢、莢膜和鞭毛圖。
[0016]其中，A:芽孢；B:莢膜；C:鞭毛。
[0017]圖3為本發明菌株Z5無菌發酵液對TMV的拮抗效果圖。
[0018]其中，A:對照組；B:處理組。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明進行進一步地詳細說明。
[0020]實施例1
[0021]從湖南省長沙市湖南農業大學煙草基地取表土以下5cm處發病煙草根基土壤500g，稱取供試土壤5g放入盛有45ml無菌水的三角瓶中，震蕩Ih后，28°C恒溫培養箱孵育靜置過夜。抽濾除去沉淀，即為10—1菌懸液。用無菌水將菌懸液按ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6進行梯度稀釋后，分別涂布于NA培養基中，在28°C恒溫培養箱倒置培養ld，觀察菌落生長情況，及時挑取不同單菌落劃線純化2-3次，即得本發明菌株，_80°C保存。
[0022]實施例2本發明菌株Z5對煙草普通花葉病毒的抑制作用
[0023]挑取本發明菌株Z5以4%接種重量接種到25ml NB培養基中，32°C，180r/min培養64h,所得發酵液于10500r/min離心15min除去菌體,細菌過濾器(0.45um)過濾得無菌發酵液。
[0024]取TMV感病干葉片0.1g研磨成勻漿，按1:200 (W/V)加入PBS緩沖液配制成20倍
病毒接種液。選取健康、長勢一致4-6葉期心葉煙進行摩擦接種，左半葉接種NB培養基與病毒等體積混合液為對照組，右半葉接種無菌發酵液與病毒液等體積混合為處理組(混合時間均為IOmin)，接種5min后用水噴灑葉面。每株接種3_5個葉片，重復3次，每天噴水2-3次。3d后統計枯斑個數，計算抑制率，結果見下表1，并結合參見圖3。
[0025]與TMV作用方式:采用局部枯斑法，設鈍化作用(IOmin);預防和治療作用(6h、24h)三個處理。
[0026]抑制率=(對照枯斑數-處理枯斑數)/對照枯斑數X 100 %。
[0027]表1本發明菌株Z5發酵液對煙草普通花葉病毒的抑制作用
[0028]
【權利要求】
1.一種抗煙草普通花葉病毒的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z5菌株，于2014年3月24日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2014102。
2.如權利要求1所述的菌株在抑制煙草普通花葉病毒中的應用。
3.如權利要求1所述的菌株在防治煙草普通花葉病毒中的應用。
4.一種制備抗煙草普通花葉病毒發酵液的方法，其特征在于，該方法是將權利要求1所述的菌株以4-5%接種量接入NB培養基中發酵培養。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵培養條件為:溫度28-37°C、pH6.5-7.5、時間 48-72h 及轉速 150_220r/min。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵培養條件為:溫度32°C、pH7.0、時間64h及轉速180r/min。
7.利用權利要求4-6中任一項所述的發酵液制得粗蛋白液。
8.如權利要求4-6中任一項所述的發酵液在抑制煙草普通花葉病毒中的應用。
9.如權利要求7所述的粗蛋白液在防治煙草普通花葉病毒中的應用。
【文檔編號】A01N63/00GK103937727SQ201410187542
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】唐前君, 周鵬, 劉雙清, 肖啟明, 李魏, 周志成, 李迅 申請人:湖南農業大學