一種固氮根瘤菌劑的生產方法
【專利摘要】一種固氮根瘤菌劑的生產方法，主要包括以下步驟：在好氧發酵器中布置軟性纖維；釆用含有低分子有機碳源的培養基，促進根瘤菌的附著生長；定期補充低分子有機碳源和氮源，定期洗脫軟性纖維上的根瘤菌；用低溶氧、低pH值、密封條件保存收集液；檢測后裝入包裝容皿。本發明活菌生長旺盛、連續收集量大，保存條件簡單，保存時間長，可以實現根瘤細菌（液體）的產品化、商業化。實際使用該產品時，只需將根瘤菌直接拌入種子中，使用十分方便。
【專利說明】一種固氮根瘤菌劑的生產方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明涉及一種固氮根瘤菌劑的生產方法，產品主要用于豆科作物種植方面的微生物制劑，屬于農業微生物【技術領域】。

【背景技術】
[0003]根瘤菌(root nodule bacteria)是與豆科植物共生,形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。這種共生體系具有很強的固氮能力。根瘤菌是通過豆科植物根毛、側根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入線，進到根的皮層，刺激宿主皮層細胞分裂，形成根瘤，根瘤菌從侵入線進到根瘤細胞，繼續繁殖，根瘤中含有根瘤菌的細胞群構成含菌組織。根瘤菌進入這些宿主細胞后被一層膜套包圍，有些菌在膜套內能繼續繁殖，大量增加根瘤內的根瘤菌數，以后停止增殖，成為成熟的類菌體；宿主細胞與根瘤菌共同合成豆血紅蛋白，分布在膜套內外，作為氧的載體，調節膜套內外的氧量。類菌體執行固氮功能，將分子氮還原成NH3，分泌至根瘤細胞內，并合成酰胺類或酰尿類化合物，輸出根瘤，由根的傳導組織運輸至宿主地上部分供利用。與宿主的共生關系是宿主為根瘤菌提供良好的居住環境、碳源和能源以及其他必需營養，而根瘤菌則為宿主提供氮素營養。 大豆、花生等屬于豆科植物。它們的根瘤中，有能固氮的根瘤菌與之共生。根瘤菌將空氣中的氮轉化為植物能吸收的含氮物質，如氨，而植物為根瘤菌提供有機物。豆科植物幼苗期間的分泌物吸引了分布在其根附近的根瘤菌，使其聚集在根毛周圍大量繁殖，隨后，根瘤菌產生的分泌物使根毛卷曲、膨脹，并使部分細胞壁溶解，根瘤菌由壁被溶解處侵入根毛，在根毛中滋生，聚集成帶，外被粘液和根細胞分泌的纖維素，形成侵入線。侵入線為管狀結構，根瘤菌沿其侵入根的皮層并迅速在該處繁殖，皮層細胞受刺激亦迅速分裂，致使根部形成局部突起，即成根瘤。根瘤菌居于根瘤中央的薄壁細胞內，逐漸破壞其核與細胞質，本身轉變為擬菌體；同時該區域周圍分化出與根維管束相連的輸導組織、外圍薄壁組織鞘和內皮層。擬菌體通過輸導組織從皮層細胞吸收碳水化合物、礦物鹽類和水進行繁殖，同時進行固氮作用。同時由于根瘤的脫落、殘留以及一部分分泌到土壤中的氮，可以增加土壤肥力。生產上用豆科植物與其他作物間作、輪作，就是利用根瘤菌的固氮作用。 根瘤菌可以將大氣中的無機氮轉化為有機氮，但是它從植物體內獲取營養，在生態系統中為消費者。
[0004]當豆科植物在幼苗期，土壤中的根瘤便被其根毛分泌的有機物吸引而聚集在根毛的周圍，并大量繁殖。同時產生一定的分泌物，這些分泌物刺激根毛，使其先端卷曲和膨脹，同時，在根菌瘤分泌的纖維素酶的作用下，根毛細胞壁發生內陷溶解，隨即根瘤菌由此侵入根毛。在根毛內，根瘤菌分裂滋生，聚集成帶，外面被一層粘液所包，形成為感染絲，并逐漸向根的中軸延伸。同時，在根瘤菌的刺繳下，根細胞相應地分泌出一種纖維素，包圍于感染絲之外，形成了具有纖維素鞘的內生管，又稱侵入線。根瘤菌順侵入線進入幼根的皮層中。
[0005] 在皮層內，根瘤菌迅速分裂繁殖，皮層細胞受到根瘤菌侵入的刺繳，也迅速分裂，產生大量的新細胞。致使皮層出現局部的膨大。這種膨大的部分，包圍著聚生根瘤菌的薄壁組織，從而形成了外向突出生長的根瘤。
[0006]之后，含有根瘤菌的薄壁細胞的細胞核和細胞質逐漸被根瘤菌所破壞而消失，根瘤菌相應地轉為擬菌體(bacter1id)。
[0007]主根瘤菌剛剛進入豆科植物根部的時候，并不能固氮，只能發展到擬菌體階段，才能進行固氮作用。
[0008]在根瘤內，根瘤菌從豆科植物根的皮層細胞中吸取碳水化合物、礦質鹽類及水分。以進行生長和繁殖。同時它們又把空氣中游離的氮通過固氮作用固定下來，轉變為植物所能利用的含氮化合物，供植物生活所需。這樣，根瘤菌與根便構成了互相依賴的共生關系。
[0009]由于根菌瘤在生活過程中分泌一些有機氮到土壤中，加之，根瘤在植物的生長末期會自行脫落，從而大大提高了土壤的肥力。據估測，一畝苜蓿年均可積累40斤氮肥，相當于200斤硫銨。并可增加土壤中的腐殖質。
[0010]由于有些土壤中沒有與豆科植物共生的根瘤菌，同時不同豆科植物需要與不同類型的根瘤共生，因此在農業上采取在播種豆科植物時，將其與根瘤菌制劑攪抖，以便給豆科作物形成根瘤創造條件。據調查，采用該方法播種，可使大豆、花生增產10%以上。
[0011]自然界上，除豆科植物外，還有非豆科的幾十個屬100多種植物能形成根瘤，并能固氮。目前對非豆科植物的根瘤研究引起了很大的重視，潛力很大。
[0012]雖然空氣成分中約有80%的氮，但一般植物無法直接利用，花生、大豆、苜蓿等豆科植物，通過與根瘤菌的共生固氮作用，才可以把空氣中的分子態氮轉變為植物可以利用的氨態氮。在種子發芽生根后，根瘤菌從根毛入侵根部，在一定條件下，形成具有固氮能力的根瘤，在固氮酶的作用下，根瘤中的類菌體將分子態氮轉化為氨態氮，與此同時，每個根瘤就是一座微型氮肥廠，源源不斷地把氮輸送給植株利用。豆科作物周圍的土著根瘤菌數量很少，難以滿足作物生長的需要。根瘤菌劑給農作物生產的氮肥不會有環境污染，不需長途運輸，使用過程中沒有氮流失，而人工施用化學氮肥流失率往往大于50%。當豆科作物萌發并長出根毛后，根瘤菌受根毛分泌的凝集素的刺激和吸引，大量聚集在根際和根表上。根毛與根瘤菌接觸后，首先是細胞壁變軟，發生根毛卷曲，然后是細胞壁內陷，根瘤菌隨之侵入根毛，直至根的皮層，根瘤菌在皮層大量繁殖并轉變為類菌體，此時根部皮層大量增生，形成瘤狀組織，最后突出根部形成根瘤，當有效根瘤的剖面呈粉紅色時，說明根瘤進入成熟階段，開始固氮，并向植株提供氮素。
[0013]例如:人工接種根瘤的花生每年每平方米的固氮量為7.2-12.4g即每畝花生可以從固氮作用中獲得相當于10-17公斤尿素的氮，特別在貧瘠土壤中，人工接種根瘤菌所需的氮素養分有2/3來自于共生固氮。僅1/3是從土壤吸收來的。根瘤每天固定的氮素有94%供給植株，僅有6%留在根瘤中?；ㄉ仓瓴粩嗟貜母鲋械玫降毓?，終身受益。
[0014]中國地域遼闊豆科作物種類繁多，每年大面積種植花生、大豆、豌豆、蠶豆、綠豆及苜蓿、沙打旺等豆科牧草幾十種之多。這些豆科作物和地球上所有的生物一樣，在生長中離不開氮這一生命要素。根瘤菌劑能大量減少化肥的使用量，改善農產品品質，使農產品達到AA級綠色食品要求；有效提高農作物的產量；無任何不良副作用，不構成重金屬污染；施用成本只有化肥的十分之一，根瘤菌劑還具有培肥地力，改良土壤結構，肥地養地之功能，所以根瘤菌在豆科作物種植中的作用是其他任何肥料措施無法替代的，具有十分重要的地位。但是，根瘤菌的規模培養和保存技術一直沒有得到攻克，它的產品化、商業化過程一直進展很慢。
[0015]發明目的
本發明的目的在于提供一種可大量生產根瘤菌菌劑，且保存條件簡單，保存時間長，并可實現根瘤菌的產品化、商業化。


【發明內容】

[0016]一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于主要包括以下步驟:
a、準備好氧發酵器。好氧發酵器底部均勻布置氣管，由氣泵供氣，保證培養液中溶氧不低于5mg/l,裝入五分之三體積的蒸懼水,把無紡布均勻布置于好氧發酵器的水體中，直接潑灑根瘤菌種于水體。
[0017]b、采用含有低分子有機碳源的培養基，促進根瘤菌的附著生長；
C、定期補充低分子有機碳源和氮源，定期洗脫無紡布上面的根瘤細菌；
d、用低溶氧、低pH值、密封條件保存收集液；
e、檢測后裝入包裝容器。
[0018]本發明的目的還可以通過以下措施來達到:無紡布為一種柔軟、多孔、致密的薄層化工纖維，可采用PVC纖維棉。低分子有機碳源培養基的成分為醋酸納0.5 lkg/m3、碳酸氫鈉0.5kg/m3、硫酸銨2kg/m3、憐酸二氧lkg/m3、硫酸鎂0.5kg/m3、氣化鉀0.5kg/m3、氯化鈉0.lkg/m3、硫酸亞鐵0.5kg/m3，維生素、礦物元素、氨基酸預混料10g/m3，培養液的pH值為7.5。第一次收集時間為10天后，洗脫軟性纖維上的根瘤細菌，連續培養、收集，每三天補充一次碳源和氮源，每三天從軟性纖維上洗脫一次根瘤細菌。培養液的PH值低于7.0時，加入碳酸氫鈉0.5kg/m3，使培養液的pH值達到7.8，堿度高于4mmol/l，培養液水溫盡量高于25°C。根瘤細菌的穩定處理是用0.01M鹽酸降低洗脫液的pH值至6.5，然后密封存儲，至洗脫液中溶氧在lmg/1。
[0019]本發明相比現有技術具有如下優點:活菌生長旺盛、連續收集量大，保存條件簡單，保存時間長，可以實現根瘤細菌(液體)的產品化、商業化。實際使用該產品時，只需要將根瘤菌拌入肥料中，直接給豆科作物施肥，，一定時間后，根瘤菌開始在豆科作物的根部繁殖生長，并從土壤有機物中吸取營養。

【具體實施方式】
[0020]本發明下面將結合實施例作進一步詳述:
具體操作工藝如下:
(I)準備好氧發酵器。選用深度大約I米的大規格塑料池，底部均勻布置氣管，由氣泵供氣。氣體經過空氣過濾系統，盡量減少空氣中的細菌和雜質。保證培養液中溶氧不低于6mg/1。裝入4/5體積的蒸懼水。
[0021](2)準備無紡布。材料為一種柔軟、多孔、致密的薄層化工纖維(PVC纖維棉)，規格為30X10X3cm(長X寬X厚)，均勻布置于發酵器的水體中。每個載體的基本參數經測量為:幾何表面積840cm2,比重0.8±0.Ikgnf3，比表面積≥93.3m2m_3，孔隙率69.8%0
(3)準備有機碳源培養基。培養液的pH要求在7.5左右。培養基成分為:醋酸鈉0.5lkg/m3，碳酸氫鈉0.5kg/m3，硫酸銨2kg/m3，磷酸二氫鈣lkg/m3 ,硫酸鎂0.5kg/m3，氯化鉀0.5kg/m3，氯化鈉0.lkg/m3 ,硫酸亞鐵0.5kg/m3，維生素、礦物元素、氨基酸預混料1g/m3 ο
[0022](4)第一次收集時間。大約10天后，洗脫軟性纖維上的根瘤細菌。
[0023](5)連續培養、收集。每3天補充I次碳源和氮源(醋酸鈉0.5 lkg/m3，硫酸銨2kg/m3,亞硝酸鈉2kg/m3)。每3天從無紡布上洗脫一次根瘤細菌。
[0024](6)培養過程技術管理。如果培養液出現pH低于7.0時,加入碳酸氫鈉0.5kg/m3使培養液的pH達到7.8左右、堿度高于4mmol/l。依據根瘤細菌產量情況，不定期補充其它培養基成分。培養液水溫盡量高于25°C，低于此溫度細菌產量將降低。
[0025](7)根瘤細菌的穩定處理。用0.01M鹽酸降低洗脫液的pH至6.5左右。然后密封存儲，至洗脫液中溶氧在lmg/1左右。這時根瘤細菌已經處于自我抑制狀態，可以較長時間存活。
[0026](8)根瘤細菌(液體)的產品化。穩定處理后的洗脫液經檢測后裝入塑料包裝桶(5
I)，檢測指標主要為根瘤單胞菌數量、溶氧和pH。使用前不要開啟蓋子，開啟后盡快用完。
[0027](9)根瘤菌在使用時，直接與種子拌在一起，按1:100的比例，即一公斤菌種拌一百公斤種子，直接點種即可。
[0028]根瘤菌菌種可以市購，各農科院，農業院校微生物室都有菌種。
[0029] 根據實驗測算，根瘤細菌與有機肥料一起包裝保存(1:500)的比例，室溫下，60天后測定菌數1010個/克。存放90天有效活菌數超過2011個/克，200天仍然有965個/克，證明細菌有很強的活性。
【權利要求】
1.一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于主要包括以下步驟: a、準備好氧發酵器，好氧發酵器底部均勻布置氣管，由氣泵供氣，保證培養液中溶氧不低于5mg/l，裝入五分之三體積的蒸餾水，把無紡布均勻布置于好氧發酵器的水體中，直接潑灑根瘤菌菌種于水體； b、采用含有低分子有機碳源的培養基，促進根瘤菌的附著生長； C、定期補充低分子有機碳源和氮源，定期洗脫無紡布上面的根瘤菌； d、用低溶氧、低pH值、密封條件保存收集液； e、檢測后裝入包裝容器。
2.根據權利要求1所述的一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于:無紡布為一種柔軟、多孔、致密的薄層化工纖維，可采用PVC纖維棉。
3.根據權利要求1所述的一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于:低分子有機碳源培養基的成分為醋酸納0.5 lkg/m3、碳酸氫鈉0.5kg/m3、硫酸銨2kg/m3、磷酸二氫鈣lkg/m3、硫酸鎂0.5kg/m3、氯化鉀0.5kg/m3、氯化鈉0.lkg/m3、硫酸亞鐵0.5kg/m3,維生素、礦物元素、氨基酸預混料10g/m3，培養液的pH值為7.5。
4.根據權利要求1所述的一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于:第一次收集時間為10天后，洗脫軟性纖維上的根瘤菌，連續培養、收集，每三天補充一次碳源和氮源，每三天從無紡布上洗脫一次根瘤細菌。
5.根據權利要求1所述的一種固氮根瘤菌劑的生產方法，其特征在于:根瘤細菌的穩定處理是用0.01M鹽酸降低洗脫液的pH值至6.5，然后密封存儲，至洗脫液中溶氧在Img/L.
【文檔編號】C05G3/00GK104045382SQ201310079766
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2013年3月13日
【發明者】李朝均 申請人:都江堰惠農生物技術有限責任公司