一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑，生物菌體為玫瑰黃鏈霉菌變種0116，所述的活菌數≥10億個/克。活菌包括鏈霉菌孢子和菌絲。制備方法是：將PDA上培養4-5天的鏈霉菌轉接于種子培養基，3天后，將種子培養基轉接于小試發酵培養基中進行液體發酵；3天后，轉接于中試發酵培養基中擴大液體發酵；6天后，將發酵液按1∶4（固∶液）比例轉接于粉碎后的玉米芯中，恒溫培養室內發酵7-10天，烘干或者自然晾干，既得該玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑。其制備工藝簡單，成本低，易保存，易生產。本發明具有防治棉花黃萎病等土傳病害，促進農作物生長和提高產量的功能。
【專利說明】一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以玉米芯為基質的，可防治棉花黃萎病等重要農作物病害的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑。

【背景技術】
[0002]目前，農作物病害的防治主要以化學農藥為主，其長期使用造成對病原菌的選擇壓力大，易產生抗藥性。而且化學農藥的高殘留、高污染對環境和人、畜的安全造成嚴重的影響。因此低毒、低殘留的生物農藥已成為農藥研制和生產需求的一大趨勢。本發明專利涉及一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑，該菌株已委托“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”進行保藏，保藏單位地址:北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所，菌株名稱:玫瑰黃鏈霉菌0116，保藏編號=CGMCC N0.1471，保藏日期:2005年9月30日。玫瑰黃鏈霉菌(Streptomyces roseoflavus)的誘變菌株0116菌株(以下簡稱菌株0116),是一株經玫瑰黃鏈霉菌(Streptomyces roseoflavus)誘變得到的菌株，其活菌和發酵液對多種重要植物病原菌有很強的抑制作用，例如棉花黃萎病病原菌、黃瓜白粉病病原菌、馬鈴薯瘡痂病病原菌、番茄灰霉病病原菌、小麥根腐病病原菌等。溫室及大田試驗表明，0116菌株及其發酵液對棉花黃萎病有較好的防治效果。近年來，河北農業大學的河北省農作物病蟲害生防工程技術研究中心又將該菌株及其發酵液應用到草莓重茬病、設施蔬菜(番茄、西葫蘆等)重茬病等的防治上，均表現出良好的防治效果。河北農業大學生防中心于2011年申請了一個該菌株生防制劑的專利，即“一種玫瑰黃鏈霉菌生物殺菌劑的可濕性粉劑”，專利申請號:201110375945.8，其組份及含量為:玫瑰黃鏈霉菌菌株繁殖體^ 18個；潤濕分散劑4%。所述的玫瑰黃鏈霉菌菌株繁殖體為菌株0116的菌絲和孢子。所述的載體為硅藻土。所述潤濕分散劑為木質素磺酸鈉。該專利存在的缺陷是硅藻土的吸附力很強，發酵過程中每翻一次盤都比較困難，且干燥完成后，出現大塊的板結，較難粉碎，且粉碎過程中，容易對活菌菌體本身造成損害，影響制劑的防治效果。所以有必要在此基礎上對制劑加以改進，尋找一種更簡單、易規模化生產的制劑劑型。


【發明內容】

[0003]I本發明提供一種生產成本低、工藝簡單、能夠進行規模化生產、施藥方式簡便，包裝和運輸成本較小的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑。
[0004]2本發明是以如下技術方案實現的:
步驟一，取純化后的玫瑰黃鏈霉菌0116，將0116菌株接種于PDA培養基上，28 °C培養4-5天后，以1%的比例接種到種子培養基中，放在搖床上，28°C /200r，繼續培養3天，得到種子菌發酵液；
步驟二，將得到的種子菌發酵在無菌條件下，以1%的比例接種到50L的小試發酵罐培養基中，進一步進行小試發酵。得到足量的種子菌發酵液； 50L發酵罐培養所用的參數:培養溫度:28°C 罐壓:0.5Kg/cm2 轉速:200r/m 培養時間:3天
步驟三，將得到的足量的種子菌發酵在無菌條件下，以1%的比例接種到500L的液體發酵罐培養基中，進一步進行中試，擴大發酵。得到玫瑰黃鏈霉菌0116液體發酵液；
500L發酵罐培養所用的參數:
培養溫度:28°C 罐壓:0.5Kg/cm2 轉速:200r/m 培養時間:6天
所用的種子培養基為:3%花生餅粉，4.5%淀粉，1.5%葡萄糖，0.75%氯化鈉，0.3%醇母膏，0.9%硫酸銨，0.03%磷酸二氫鉀，0.375%碳酸鈣，0.105%硫酸亞鐵，0.105%硫酸鋅，3%鹿糖,0.3%果糖，pH自然。
[0005]發酵罐培養基為四號發酵培養基:2 %花生餅粉，3%淀粉，I %葡萄糖，0.5 %氯化鈉，0.2%醇母膏，0.6%硫酸銨，0.02%磷酸二氫鉀，0.25%碳酸鈣，0.07%硫酸亞鐵，0.07%硫酸鋅，2%蔗糖，0.2%果糖，pH自然。
[0006]步驟四，將玉米芯用裝有5號篩的粉碎機粉碎，然后收集粗顆粒再用10號篩繼續粉碎，收集這些顆粒用以下步接種發酵。最后將未能過10號篩的顆粒棄掉； 步驟五，將粉碎后且過10號篩的玉米芯在121 °C滅菌鍋內滅菌3個小時后與玫瑰黃鏈霉菌0116發酵液按照質量比為1:4的比例在無菌條件下進行均勻混合，并轉移到恒溫培養室內進一步進行固體發酵。28-30 ± I °C，培養5-7天，每24小時攪拌一次。培養完成后，取出，置于35± 1°C鼓風干燥箱或自然條件下干燥。干燥7-10天后即可得到該玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑，濕度< 4-6%。
[0007]3檢測:玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑需進行下例項目的質量檢測。
[0008](I)鏡檢:鏈霉菌活體孢子和菌絲體數多、整齊，無雜菌。
[0009](2)平板計數:每克顆粒劑中含有鏈霉菌活體孢子和菌絲體總數> 10-20億。
[0010](3)水分測定:(4-6%。
[0011](4)細度:98%的顆粒≤10目篩。10篩目的孔徑為1700微米(標準為300-1700微米)。
[0012]研究工作表明，玫瑰黃鏈霉菌菌株0116的活體對植物病原物的抑制作用十分明顯，而且菌株對環境的抗逆能力較強，生長繁殖所需的營養條件較低。活菌制劑開發的關鍵在于活菌的儲存周期要達到I至2年。
[0013]田間藥效
研究了玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑對棉花黃萎病的大田防治效果。
[0014]I試驗方法:
將制得的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑分別按照200kg/畝、10kg/畝、50kg/畝的用量進行撒施，并利用10億活芽孢/g枯草芽孢可濕性粉劑(河北省農林科學院植物保護研究所研制)作為對照藥劑，每個處理重復3次，并設置清水對照。
[0015]2調查及統計方法:
每小區整體取樣，全株調查。分別在現蕾期、結鈴盛期和棉花采摘期對各株的黃萎病病級進行調查。并計算病情指數，防效以及顯著方差分析(SPSS)。分級標準為O級:植株無病；I級:少數成葉上產生個別病斑或表現嵌色狀；3級:植株30%~50%成葉嵌色狀；5級:植株50%~100%成葉嵌色狀，或葉片凋落，但有
棉鈴；7級:植株成葉脫落，無棉鈴；9級:植株死亡。
[0016]

【權利要求】
1.一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑，其特征在于，生物菌體為玫瑰黃鏈霉菌變種0116，所述的活菌數為≥10億個/克。
2.如權利要求書I所述的一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑，其特征在于，所述的鏈霉菌活體菌包括鏈霉菌的孢子和菌絲體。
3.一種玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，將玫瑰黃鏈霉菌0116菌株接種于PDA培養基上，28 °C培養4_5天后，以1%的比例接種到種子培養基中。
4.培養條件為:28°C/200r，培養3天。
5.步驟二，將步驟一中的種子液以1%比例接入到50L小試液體發酵罐培養基中，進一步發酵，培養條件為:28°C /200r，培養3天，得到足量的種子發酵液； 步驟三，將步驟二中的種子液以1%比例接入到500L中試發酵罐培養基中，進一步擴大中試發酵，培養條件為:28°C /200r，培養6天，得到玫瑰黃鏈霉菌發酵液； 步驟四，將玉米芯用裝有5號篩的粉碎機粉碎，然后收集粗顆粒再用10號篩繼續粉碎，收集這些顆粒用以下步接種發酵。
6.最后將未能過10號篩的顆粒棄掉； 步驟五，將玉米芯和玫瑰黃鏈霉菌發酵液按照質量比1: 4比例接種于粉碎滅菌后的玉米芯中，充分混勻后置于容積為120L的塑料桶中，在恒溫培養室內進一步固體發酵5-7天，每24h攪拌一次；培養完成后，烘干或者自然條件干燥7-10天，濕度< 4-6%，即可得到該玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑。
7.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑制備方法，其特征在于，步驟一、二的培養條件為28°C /200r，培養3天。
8.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，步驟三的培養條件為28°C /200r,培養6天。
9.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，步驟四的發酵時間為7-10天，每24h攪拌一次。
10.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，步驟五中所述干燥是烘干或者在自然條件下通風干燥處干燥7-10天，濕度≤4-6%。
11.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的顆粒大小為98% < 10目篩。
12.根據權利要求書3所述的玫瑰黃鏈霉菌微生物殺菌劑顆粒劑的制備方法，其特征在于，步驟二、三中所述的發酵罐培養基為:2%花生餅粉，3%淀粉，I %葡萄糖，0.5%氯化鈉，0.2%醇母膏，0.6%硫酸銨，0.02%磷酸二氫鉀，0.25%碳酸鈣，0.07%硫酸亞鐵，0.07%硫酸鋅，2%蔗糖，0.2%果糖，pH自然。
【文檔編號】A01N63/00GK104041519SQ201310078132
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2013年3月13日
【發明者】李亞寧, 李愛霞, 赤國彤, 劉大群, 陳英化, 張汀 申請人:河北農業大學