專利名稱：野生茄子細胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及野生茄子細胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表達載體和應用，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
細胞色素P450 (Cytochrome P450,以下簡稱CYP450)是一類血紅素氧化酶系，從簡單的細菌到高等動植物普遍存在，形成的酶在生物細胞通過可逆性的變化而進行電子傳遞，參與生物界多種重要的代謝過程。研究表明，其三維結構非常保守，經典的CYP450在催化中心有高度保守的FXXGXRXCXC的結構域。P450應用于植物抗病工程有著巨大潛力，如:1)抑制基因活性:從煙草毛狀腺分離的具有羥化酶活性P450(CYP71D16)，在運用反義和共抑制技術鑒定其功能時，發現CYP71D16催化的底物(cembratrieneol)明顯增加，使得植株避免了蚜蟲的侵染。最近，已獲得CYP71D16的啟動子，可調控植株產生新的分泌物，提高植物的抗病能力。植株經傷口處理后，CYP74的過量表達則能引起茉莉酸過早過量的積累，說明AOS的過量表達可能是控制高等植物抗病動力學的I種途徑。2)引進外源代謝途徑:非豆科類的擬南芥植株，經轉入異黃酮合酶基因后，能在體內積累5，7，45-三羥基異黃酮(催化生氰糖苷合成的3個酶基因(CYP79A1、CYP71E1和UGT85B)轉入擬南芥中，獲得的轉基因植株在生理表型和適應性上沒有發生變，但是，植株能合成新的天然產物(生氰糖苷)，獲得對跳甲(Phyllotreta nemorum)的抗性。1994年,Toshihiro Toguri和Kazuhisa Tokugawa從爺子下胚軸組織中克隆得到2個序列相同為71%的CYP450家族基因，但這兩個基因的cDNA序列與其他任何CYP450家族基因的同源性均低于30%，因此將這兩個基因命名為CYP77A1和CYP77A2的，屬于一種新的P450家族。目前，對CYP77家族的研究還很有限，也僅限于少數的幾個物種中克隆得到部分全長cDNA或中間片段。CYP77A2目前僅在少數幾種植物上被克隆，如栽培種茄子和葡萄。黃萎病(VerticilliumWilt),是由大_輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb)侵染引起的爺子重要病害之一。該病原菌分布廣，寄主多，如陸地棉、爺子、番爺、馬鈴薯、甘藍、油菜、白菜、辣椒等，嚴重影響了這些作物的產量與品質，造成巨大的經濟損失。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種野生茄子細胞色素氧化酶基因 StCYP77A2。本發明的另一目的是提供含有該基因的表達載體。本發明的有益效果提供該基因及其表達載體的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現:StCYP77A2基因，核 苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
所述的StCYP77A2基因編碼的蛋白質StCYP77A2，氨基酸序列為SEQ ID N0.2所
/Jn ο含有所述的StCYP77A2基因的表達載體。所述的表達載體優選以PCB2008E為出發載體，將所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位點間所得。所述的StCYP77A2基因在構建抗黃萎病轉基因煙草中的應用。所述的StCYP77A2基因的表達載體在構建抗黃萎病轉基因煙草中的應用。有益效果:本發明以野生爺子托魯巴姆(Solanum torvum Swartz)為材料，采用同源克隆法擴增StCYP77A2基因。將StCYP77A2基因構建轉煙草表達載體，以煙草NC89為供體，進行農桿菌侵染，獲得的再生植株經PCR、southern驗證，檢測出轉基因植株。采用灌根法和傷根法進一步對經過驗證的轉基因植株的黃萎病的抗性進行分析，結果表明，在接種黃萎病菌后，過量表達StCYP77A2的轉基因煙草的發病率和病情指數明顯低于對照組，可以說明該基因對黃萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作為抗性基因資源被應用于茄子等作物的抗黃萎病育種中。


圖1植物表達載體PCB2008E-CYP77A2的構建圖2StCYP77 A2轉基因煙草植株的PCR檢測+:質粒陽性對照；_:未轉基因煙草；I 11:轉基因煙草圖3轉CYP77A2基因煙草的southern分析Cl:質粒陽性對照；c2野生型對照；3，5，8，10，11，14:轉CYP77A2基因煙草株系圖4灌根法檢測轉CYP77A2基因煙草抗病性A:未處理野生型煙草；8:未處理轉0￥卩77八2基因煙草55-14;(::侵染3(1后野生型煙草；D:侵染3d后轉CYP77A2基因煙草55-14圖5傷根法檢測轉CYP77A2基因煙草抗病性a, c:未處理野生型煙草；b:未處理CYP77A2基因煙草55_8;d:野生型煙草水對
昭.>、、、je:侵染3d后野生型煙草；f:侵染3d后CYP77A2基因煙草55_8。
具體實施例方式實施例1野生茄子托魯巴姆StCYP77A2基因的克隆根據來GenBank中已有的栽培品種茄子CYP77A2基因的mRNA序列進行分析，設計包含完整開放閱讀框的引物 CYP77-S: (5，-ATGGATTTTTTCTCAACTTCCT-3，，SEQ ID N0.3)；CYP77-a:(5’-ATTCTTGGTTTAATTTTAGCTCT-3’，SEQ ID N0.4))。以野生茄子幼葉 cDNA 第一鏈為模板，進行RT-PCR，反應體系為25ul，PCR循環程序如下:94°C 5分鐘；94°C 50秒，620C 40秒，72°C 50秒(共35個循環)；72°C 10分鐘。測序得到長約1600bp的片段。PCR產物經1.0%的瓊脂糖電泳后用寶生物公司的膠回收試劑盒回收，連接到pMD18-T Vector,轉化大腸桿菌DH5ci，PCR檢測單克隆，進行測序。用DNAssist軟件對測序結果進行分析，StCYP77A2基因ORF為1536bp，起始密碼子ATG ;終止密碼子TAA，序列如SEQ ID N0.1所示；cDNA編碼一個由511個氨基酸殘基組成的蛋白，序列如SEQ ID N0.2所示；蛋白分子量為58.08kDa ;理論等電點為9.17。實施例2野生茄子托魯巴姆StPP5基因過表達載體的構建(圖2)將克隆出的基因StCYP77A2的cDNA全長去掉TAA終止密碼子，連接到過表達載體 PCB2008E (Zh1-Yong Lei, Ping Zhao et al.(2007)High-throughput BinaryVectors for Plant Gene Function Analysis,Journal of Integrative PlantBiology49 (4):556-567)上的35S啟動子后的多克隆位點上，與報告基因GFP蛋白進行融合。將重組載體轉化至大腸桿菌DH5ci中，PCR挑取陽性單克隆菌落進行搖菌并提質粒，測序。測序結果表明目的基因已成功插入PBC2008E載體，將重組質粒命名為PCB2008E-StCYP77A2。具體步驟如下: 在StCYP77A2基因(不含TAA)片段的cDNA正反向兩端分別加上Hind III和BamH I 酶切位點，正向引物為 77BAMH-S (5，-CCCAAGCTTCTTGGITTAAITTTAGCTCT-3’，SEQ IDN0.5)，反向引物為 77HIND-A (5，-CGCGGATCCATGGATTTTTTCTCAACTTCCT-3’，SEQ ID N0.6)。對加酶切位點的PCR產物電泳后，用膠回收試劑盒純化回收，回收產物與PMD18-TVector相連，然后轉入大腸桿菌DH5 α感受態中，挑取單克隆進行檢測，將得到的陽性菌落進行搖菌并提取質粒，用Hind III和BamH I酶于37°C進行雙酶切，雙酶切完全后電泳，用膠回收試劑盒純化回收帶有各自酶切位點粘性末端的目的基因，用于與載體的連接。將提取的過表達載體PBC2008E質粒用Hind III和BamH I兩種內切酶于37°C進行雙酶切，電泳，回收的大片段即為帶Hind III和BamH I酶切位點粘性末端的重組載體的質粒部分。 將目的基因的雙酶切產物與載體PCB2008E雙酶切產物按照摩爾比為(3 10):1混合，在T4連接酶的作用下于16°C下過夜連接，連接產物直接用于轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克隆，PCR檢測，選取PCR陽性的單克隆進行大量搖菌，提取質粒，經酶切以及測序驗證后命名為重組質粒PCB2008E-StCYP77A2，_70°C凍存備用。實施例3利用農桿菌介導的轉化法獲得轉StCYP77A2基因煙草采用農桿菌介導的基因轉化方法，取煙草子葉先進行預培養2d，然后用農桿菌懸浮液侵染5min，在共培養培養基上共培養2d。將煙草葉片外植體用農桿菌侵染后，轉到愈傷分化培養基上，15d左右產生愈傷組織，20d左右出現不定芽，隨后將所有形成的不定芽轉入含20mg/L Hyg B的MS培養基中進行二次篩選，非轉化芽因為沒有抗生素抗性，最終白化死亡。隨后將得到的陽性植株轉入MS培養基中擴繁，經PCR及southern驗證，最終獲得轉基因煙草植株。具體步驟如下:I煙草無菌苗的獲得挑選少許飽滿的煙草種子于1.5mL離心管中，先用無菌水洗3次。取lml70%的酒精浸泡30s，棄上清，用無菌水洗I次。取lmll%的HgCl2，將種子放入其中搖動消毒3min，棄上清。無菌水沖洗3 4次。用濾紙吸干。將種子播種于1/2MS固體培養基上。一周后種子萌發，三周左右煙草長出兩片子葉。2煙草葉片在轉化前的預培養選取長勢良好的5-6葉期煙草植株，切去葉片的邊緣及葉脈部分，用剪刀剪成約0.5cm2的小塊。放于MS培養基上在培養箱內進行2天預培養。3農桿菌菌液的制備將重組載體成功轉化到農桿菌H1105的菌液涂布平板，挑取單菌落，接種到ImL加有抗生素的LB液體培養基(含50mg/L Kan+50mg/L Rif)中進行活化，于28°C、200rpm條件下避光振蕩培養24h。隨后取200 μ L搖出的菌液加入到50mL的液體LB液體培養基(含50mg/LKan+50mg/L Rif)中，于28°C、200rpm條件下振蕩培養。在菌液到對數生長期(OD600=0.5 0.6)時，4，OOOg離心lOmin，收集的菌體用MS液體培養基重懸，再離心收集菌體，最后用MS液體培養基稀釋成0D_=0.5 0.7的工程菌液。4煙草組織與農桿菌共培養將預培養的煙草子葉放入農桿菌菌液懸浮液中侵染，于28°C，200rpm條件下震蕩5min。棄菌液,用無菌濾紙吸干葉片上的液體, 置于共培養培養基(MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA)中。28°C黑暗條件下共培養2d。5煙草植株的再生培養篩選長勢良好的幼嫩葉片，用含250mg/L Cef的MS液體培養沖洗4 5次，除去多余的菌體。取出子葉，放在無菌濾紙上面晾干液體，轉入愈傷培養基(MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg)中。待愈傷長出后轉入芽分化培養基(MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L HYg)中，4 5周可以看到愈傷分化出小芽，期間更換I 2次培養基。待芽長至1.5 2.0cm時，將芽切下插入生根培養基(MS+2mg/LNAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg)中。一般情況2周后可長出I 4條根，并有4 6片葉子。6再生植株的抗性篩選待植株長高到2 3cm后，把每棵苗的主莖從葉片的腋芽之間切開，插入生根培養基(MS+2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg)中培養進行轉基因植株的篩選。7轉基因植株的擴繁待轉基因植株長高后，剪取帶有腋芽的莖段，插入固體MS培養基中進行擴大繁殖，準備足夠的材料進行下一步的檢測。8轉基因煙草的PCR檢測依據GFP 序列弓I物來進行 DNA 煙草的 PCR檢測，GFPl:5’-ATCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’(SEQ ID N0.7);GFP2:5’-ATCGCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGC_3’(SEQ ID N0.8)，以轉化植株的基因組DNA為模板，未轉化植株總DNA作為陰性對照，PCB2008E載體質粒作為陽性對照進行擴增，對得到的11株抗生素陽性的StCYP77A2轉化煙草植株進行PCR鑒定，結果如圖2所示，8株為陽性，分別將其命名為77-1，77-2，77-5，77-7, 77-8, 77-9, 77-10，77
_llo9轉基因煙草的Southern blot檢測9.1基因組DNA酶切及轉膜固定(I)提取高質量的基因組DNA，濃度大于I μ g、EcoR I酶切，37°C保溫過夜(16 20h)。(2)電泳:分別在轉基因和對照的DNA酶切混合液中加入1/10體積的LoadingBuffer，混勻，然后點樣于0.8%的瓊脂糖凝膠，最后點上Maker，先用100V電壓電泳5min，將所有樣品從點樣孔壓入凝膠，然后將電壓調節到30V電泳6h。(3)電泳結束后，凝膠于EB溶液中染色20min，紫外燈下拍照。(4)修去凝膠多余部分，切一角作為標記；并于ddH20中漂洗片刻。(5)室溫下凝膠在0.25M HCl中浸泡15min，使DNA脫嘌呤，搖床上緩慢搖動。(6)凝膠轉移到10倍于凝膠體積的變性液(1.5M NaCl, 0.5M NaOH)中輕輕振蕩20min，換液一次；繼續漂洗20min。(7)超純水漂洗凝膠片刻，然后置于10倍凝膠體積的中和液中輕輕振20min，換中
和液重復一次。(8)用濾紙和玻璃板做一個平臺，置于白瓷盤上，倒入20XSSC溶液，待平臺的濾紙濕透后，用玻棒趕走氣泡。(9)將尼龍膜漂浮于超純水中至完全浸潤，轉移至20XSSC轉移緩沖液中浸泡15min。(10)組裝轉移裝置:玻璃板+濾紙橋(邊緣完全充分浸入20 X SSC轉移緩沖液)+1張濾紙+凝膠(背面朝上)+尼龍膜(做好標記)+濾紙(3層)+吸水紙+玻璃板+500g重物，毛細管法轉膜24h，及時更換吸水紙。(11)轉膜結束后，凝膠拍照檢測DNA殘留情況。(12)小心取出尼 龍膜，平鋪到預先用20XSSC溶液中平衡的濾紙上，紫外交聯(1.5J/cm2) 3min。(13)雙蒸水漂洗尼龍膜后，空氣中干燥，用保鮮膜包好，存于4°C備用。9.2Southern 雜交I)探針的制備與標記(I)以質粒為模板，PCR擴增序列特異性片段，回收片段，并測定濃度。(2)將Iyg的DNA探針(質粒回收產物)用蒸餾水稀釋至16 μ I。(3)沸水浴處理IOmin后迅速于冰上冷卻使DNA變性。(4)搖勻DIG-High Prime (viall)，取4μ I加入變性液中，混合后稍離心，37°C保溫20h，65°C處理IOmin終止反應。(5)取I μ I檢測，標記好的DNA探針一20°C備用。2)雜交與洗膜(I)配制地高辛雜交液一64ml的無菌超純水分兩次加入DIG Easy Hyb Granules(vial7)中，迅速于37°C振蕩5min至溶解。(2)將事先加入雜交液(DIG Easy Hyb, vial7,10ml/100cm2)的雜交瓶預熱至42°C，固定好的尼龍膜輕輕卷成圓柱狀放入雜交瓶中42°C預雜交30min，以封閉非特異性位點。(3)倒掉預雜交液。標記好的探針(25ng/ml)沸水浴5min迅速冰上冷卻后加入預熱至42°C的雜交液中(3.5ml/100cm2尼龍膜，混合均勻避免產生氣泡。加液順序:沿壁加5ml雜交液一探針一 5ml雜交液，防止產生氣泡。(4)將尼龍膜完全接觸雜交液，42°C雜交16 20h，雜交過程避免有氣泡。(5)雜交結束后，用2XSSC，0.1%SDS洗脫液(現配用時25°C預熱)15 25°C振蕩洗漆2次，每次5min。
(6)用預熱的0.5XSSC,0.1%SDS洗脫液(現配)65°C振蕩洗滌2次，每次15min (在雜交爐中進行)。(7)再用100 150ml Washing buffer洗膜5min,濾干洗液進行顯色處理。3)免疫檢測(所有操作均在室溫進行)(I)將雜交膜置于盛有IOOml封閉液(Blocking solution)的培養皿中，室溫緩慢搖動30min。(2)轉到盛有20ml抗體溶液(Antibody solution)的培養皿中，室溫緩慢搖動30mino(3)在 IOOml 的 Washing buffer 中洗膜 2X 15min,緩慢振蕩。(4)在20ml檢測緩沖液(Detection buffer)中平衡2 5min,緩慢搖動。(5)用新配制的IOml顯色液溫浴膜，黑暗靜置(37°C培養箱)至出現明顯條帶(3h - 20h)。(6)用50ml TE buffer洗膜5min停止顯色，白光拍照記錄。結果見圖3,在檢測的8株PCR陽性StCYP77A2植株中，有兩個株系出現雜交信號，且皆為雙拷貝，對照植株沒有顯示條帶，證明目的基因已經整合到煙草NC89的基因組中。實施例4轉StCYP77A2基因煙草抗病性分析取黃萎病病原菌(V.dahliae)，進行固體培養:在察氏固體培養基上28°C恒溫培養，2周后菌落基本覆蓋整個平板，挑去Icm2大小帶培養基菌塊3 5塊放入察氏液體培養基中28°C恒溫下振蕩(150rpm)培養IOd后，用8層紗布過濾，以考馬斯亮藍法測定并調整粗毒素濃度至8mg/mL。侵染過程分為兩種方法，第一種灌根法:將制備好的菌液粗毒素倒入野生型和轉基因材料的小杯中，直至飽和流出，以無菌水處理為對照，處理時間為下午5點，接種后置于單獨的溫室大棚內繼續生長，生長條件為25土1°C，正常光照。第二種傷根法:將野生型和轉基因材料從土壤中取出，放入含有毒素的試管中培養，以無菌水處理做對照。本實驗各選取RT-PCR中mRNA表達量最多的兩個株系進行抗病性分析。接種后2d-10d內進行發病調查，以無新增發病植株時的最后一次調查結果計算病情指數和發病率。分級標準計算方法:0級:葉片上無病斑；1級:1 2枚葉片出現萎凋；2級:3 5枚葉片出現萎凋；3級:大部分葉片出現萎凋；4級:植株萎凋枯死或即將萎凋枯死(葉鵬盛，2006)。發病率的計算公式為發病率=發病株數X 100%/調查總株數。病情指數=[Σ (病級株數X代表數值)/株數總和X發病最高級的代表數值]X 100。轉StCYP77A2基因煙草株系77_9和77-11及其野生型NC89的黃萎病菌接種試驗結果如圖4 5和表I所示，在接種后3天，對照植株整株萎焉，而轉基因煙草株系77-11則仍然健康；表I中結果表明，轉基因煙草株系77-9和77-11的發病率為33.33%和55.56%，低于對照的100% ;轉基因煙草株系77-9和77-11的病情指數均為33.33，低于對照的77.78。抗病性鑒定發現，StCYP77A2轉基因植株的其發病率為對照的1/3到1/2，病情指數為對照的一半。這些結果提示，StCYP77A2基因具有抗黃萎病能力，表明在茄科作物抗病育種中StCYP77A2具有應用潛力。 表I轉StCYP77A2基因煙草抗病性鑒定
權利要求
1.StCYP77A2基因，其特征在于核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述的StCYP77A2基因編碼的蛋白質StCYP77A2，其特征在于氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
3.含有權利要求1所述的StCYP77A2基因的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的表達載體是以PCB2008E為出發載體，將權利要求1所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位點間所得。
5.權利要求1所述的StCYP77A2基因在構建抗黃萎病轉基因煙草中的應用。
6.權利要求3或4所述的StCYP77A2基因的表達載體在構建抗黃萎病轉基因煙草中的應用。
全文摘要
本發明涉及涉及野生茄子細胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表達載體和應用。首次從茄子中克隆出CYP77A2基因，命名為StCYP77A2。構建植物表達載體，利用農桿菌介導法將其轉入栽培種煙草中，獲得轉基因煙草植株。采用灌根法，進一步對經過驗證的轉基因植株的黃萎病的抗性進行分析，結果表明，在接種黃萎病菌后，過量表達StCYP77A2的轉基因煙草的發病率和病情指數分別為88.89%和52.78，低于對照的100%和77.78，可以說明該基因對黃萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作為抗性基因資源被應用于茄子等作物的抗黃萎病育種中。
文檔編號A01H5/00GK103215285SQ201310147109
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月23日 優先權日2013年4月23日
發明者楊清, 史策, 陳敏, 決登偉 申請人:南京農業大學