一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治桃流膠病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治桃流膠病中的應(yīng)用。一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）H47，保藏編號為CCTCC?NO:M2013283；用該菌株進行液體發(fā)酵制備抗流膠病生物制劑，可施用于桃樹，所述液體發(fā)酵工藝包括斜面菌種活化、種子培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明菌株及經(jīng)過液體發(fā)酵制備得到的無菌體、無芽孢發(fā)酵液，均可對桃流膠病病原葡萄座腔菌產(chǎn)生較強的拮抗作用；本發(fā)明生物制劑可對桃樹流膠病起到顯著的防治效果，與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑相比，其具綠色安全，環(huán)境友好等優(yōu)勢，在流膠病生物防治方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治桃流膠病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物和發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一株解淀粉芽孢桿菌及該菌株在防治桃流膠病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桃流膠病(peach tree gummosis)又稱瘤皮病或皮病，是在全球范圍內(nèi)危害桃樹的一種疾病。我國桃園桃流膠病普遍發(fā)生且危害嚴重，該病能引起桃主干、主枝樹皮上產(chǎn)生膠狀溢出物，溢出物初期為無色透明，后變成黃褐色至深褐色，大量膠體溢出造成桃樹樹勢衰弱，進而導(dǎo)致果實產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重時引起枝干枯死斷裂，甚至整樹死亡。20世紀70年代以前，桃流膠病一直被認為是桃的一種生理性病害，直到1974年Weaver首次發(fā)現(xiàn)并報道了桃流膠病的病原菌為 Botryosphaeria dothidea(Moug.ex Fr.)Ces.&de Not.(Weaver, D.(1974).A gummosis disease of peach trees caused by Botryosphaeriadothidea.Phytopathology, 64 (12)，1429-1432.)，確定桃流膠病為一種侵染性植物病害，其病原微生物為葡萄座腔菌屬真菌。
[0003]目前，防治桃流膠病常用“多菌靈”、“百菌清”或石硫合劑等藥劑。為達到較佳的病害防治效果，必須長期大量施用上述藥劑，不僅易使病原菌獲得耐藥性，還致使水果和土壤中的農(nóng)藥殘留嚴重超標，影響水果品質(zhì)，而殘留農(nóng)藥又可隨雨水不斷滲入地下水，造成更深層次的污染問題。
[0004]鑒于化學(xué)農(nóng)藥的大范圍`使用對農(nóng)作物、空氣、水源和土壤造成嚴重污染的現(xiàn)狀，利用微生物或微生物制品對植物病害進行生物防治成為替代化學(xué)農(nóng)藥最具潛力的一種方法之一。目前已有為防治植物病害開發(fā)的微生物或生物制劑，并取得了一定的防治效果，但專門針對桃流膠病防治的微生物或生物制劑至今尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種對葡萄座腔菌具有極強拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)H47,保藏編號為CCTCCN0:M2013283o
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在防治桃流膠病中的應(yīng)用，SP用該菌株進行液體發(fā)酵制備抗流膠病生物制劑，施用于桃樹。
[0007]所述液體發(fā)酵工藝如下:
[0008](I)斜面菌種活化:將所述解淀粉芽孢桿菌劃線接種于斜面培養(yǎng)基，于28-30°C培養(yǎng)24-36h ;所述斜面培養(yǎng)基成分按克/升計為:蛋白胨9-10，酵母膏4-5，NaC19-10，瓊脂19-21，其余成分為水，調(diào)整pH值至6.5-7.0;
[0009](2)種子培養(yǎng):將步驟(I)所述斜面培養(yǎng)基上生長的菌種轉(zhuǎn)移接種至種子培養(yǎng)基，于28-30°C，150-250r/min振蕩培養(yǎng)12-24h ;所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計為:蛋白胨9-10，酵母膏4-5，NaC19-10，其余成分為水，調(diào)整pH值至6.0-7.0 ;[0010](3)液體深層發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)所得活化種子液按體積百分比2-8%的接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28-30°C，200-350r/min振蕩培養(yǎng)48-72h，通氣量2L/min，得到發(fā)酵液，稀釋該發(fā)酵液至孢子濃度為IO5-IO8個/ml，優(yōu)選為IO5個/ml，即得抗流膠病生物制劑成品；所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計為:葡萄糖15-25，L-谷氨酸鈉3 -7，KH2PO4I -2，MgS04.7Η200.3 -0.8，F(xiàn)eSO4.7Η200.001 -0.002，MnSO4.H2O0.001 -
0.002，CuSO4.5Η200.001 -0.002，調(diào)整 pH 值至 6.0 -7.0。
[0011]本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) H47,已于2013年6月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號:CCTCC N0:M2013283，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)。該菌株以下簡稱:解淀粉芽孢桿菌H47CCTCCM2013283。
[0012]本發(fā)明的有益效果如下:
[0013].本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌H47CCTCCM2013283，試驗證明，無論是該菌株本身或是通過本發(fā)明液體發(fā)酵工藝制備得到的無菌體、無芽孢發(fā)酵液，均可對桃流膠病病原葡萄座腔菌產(chǎn)生較強的拮抗作用，抑制活性高；將上述發(fā)酵液進一步加工(稀釋至孢子濃度IO5-IO8個/ml)得到抗流膠病生物制劑并噴施于受流膠病侵害的桃樹，證明該制劑對桃樹流膠病起到了顯著的防治效果，發(fā)病率可降低20%，病情指數(shù)可降低55%。綜上，本發(fā)明成功研制出首款專門針對桃流膠病防治的高效生物制劑，與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑相比，其具綠色安全，環(huán)境友好等優(yōu)勢，在流膠病生物防治方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為解淀粉芽孢桿菌各測試菌株對葡萄座腔菌的體外拮抗實驗結(jié)果圖，其中，H43、H44、H45、H47、H48 為菌株編號。
【具體實施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖，并通過實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做進一步的描述，以下實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明實施例所涉及試驗材料如下:
[0017]菌株
[0018]葡萄座腔菌購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，保藏編號:ATCCN0.38026，以下簡稱葡萄座腔菌，于4°C PDA斜面培養(yǎng)基保存。
[0019]培養(yǎng)基
[0020]LB平板/斜面培養(yǎng)基配方(以g/L計):酵母膏5，蛋白胨10，似(:110，瓊脂1.5，蒸餾水補齊 IOOOmL, ρΗ7.0 ；
[0021]PDA平板/斜面培養(yǎng)基配方(以g/L計):土豆200，葡萄糖20，瓊脂18-20，pH自然。
[0022]其它原料和試劑為市售國產(chǎn)或進口分析純商品。
[0023]所使用儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域常規(guī)儀器設(shè)備。
[0024]實施例1解淀粉芽孢桿菌H47CCTCCM2013283的分離、篩選和鑒定
[0025]1.1解淀粉芽孢桿菌H47CCTCCM2013283的分離篩選
[0026](I)于2012年3月自中國廣西扶緩縣采集未經(jīng)加工的桉樹原蜜樣本；[0027](2)將上述原蜜樣本用滅菌生理鹽水稀釋至75% (w/w)，取200 μ L涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)72h，挑取長出的單菌落至新鮮的LB平板培養(yǎng)基進行劃線分離純化，30°C培養(yǎng)48h，再挑取單菌落至LB斜面培養(yǎng)基，4°C保存。
[0028](3)接種桃流膠病病原菌葡萄座腔菌至PDA培養(yǎng)基上，于25-30°C培養(yǎng)4-6d ;切取葡萄座腔菌菌落邊緣5-10_菌餅，接種至新配制的PDA平板培養(yǎng)基中央；
[0029](4)將步驟(2)中保存的各個單菌落點接到步驟(3)中接種葡萄座腔菌菌餅的PDA平板培養(yǎng)基中，并距離菌餅2-3cm，25-30°C培養(yǎng)2-5d，挑取對葡萄座腔菌具有最強拮抗能力的菌株(產(chǎn)生抑菌圈最大)，如圖1所示，取編號H47菌株，4°C保存。
[0030]1.2解淀粉芽孢桿菌H47CCTCCM2013283的鑒定
[0031](I)形態(tài)學(xué)特征
[0032]H47菌株在LB平板培養(yǎng)基上生長24h，形成白色較大菌落，不透明，直徑4-8mm，表面褶皺，中央凸起，邊緣不整齊，可擴散生長；油鏡觀察呈短桿狀。
[0033](2)生理生化特征
[0034]依據(jù)《伯杰氏手冊》(R.E.布坎南，N.E.基本斯等編，科學(xué)出版社，1984)所述鑒定方法，對H47菌株進行生理生化鑒定，其主要生理生化特征參見表I。
[0035]表1H47菌株主要生理生化特征
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) H47,保藏編號為CCTCCN0:M2013283o
2.權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌在防治桃流膠病中的應(yīng)用，其特征在于:用該菌株進行液體發(fā)酵制備抗流膠病生物制劑，施用于桃樹。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述解淀粉芽孢桿菌在防治桃流膠病中的應(yīng)用，其特征在于所述液體發(fā)酵工藝如下: (1)斜面菌種活化:將所述解淀粉芽孢桿菌劃線接種于斜面培養(yǎng)基，于28-31°C培養(yǎng)24-36h ;所述斜面培養(yǎng)基成分按克/升計為:蛋白胨9-10，酵母膏4-5，NaC19-10，瓊脂19-21，其余成分為水，pH6.5-7.0; (2)種子培養(yǎng):將步驟(I)所述斜面培養(yǎng)基上生長的菌種轉(zhuǎn)移接種至種子培養(yǎng)基，于28-31°C，150-250r/min振蕩培養(yǎng)12-24h ;所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計為:蛋白胨9-10，酵母膏4-5，NaC19-10，其余成分為水，pH6.0-7.0 ; (3)液體深層發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)所得活化種子液按體積百分比2-8%的接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28-31 °C ,200-350r/min振蕩培養(yǎng)48-72h，通氣量I-4L/min，得到發(fā)酵液， 稀釋該發(fā)酵液至孢子濃度為IO5-IO8個/ml，即得抗流膠病生物制劑成品；所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計為:葡萄糖15-25，L-谷氨酸鈉3-7，KH2PO4I -2，MgS04.7Η200.3 -0.8，F(xiàn)eSO4.7Η200.001 -0.002，MnSO4.H2O0.001 -0.002，CuSO4.5H200.001 -0.002，ρΗ6.0 -7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述解淀粉芽孢桿菌在防治桃流膠病中的應(yīng)用，其特征在于:所述抗流膠病生物制劑成品中的孢子濃度為IO5個/ml。
【文檔編號】A01P3/00GK103451128SQ201310294764
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】黎循航, 廖祥儒, 趙曉聯(lián), 蔡宇杰, 管政兵 申請人:江南大學(xué)