專利名稱：一株芽孢桿菌及其在棒曲霉防治中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株芽孢桿菌及其應用，特別是涉及該芽孢桿菌及其在棒曲霉防治中 的應用。
背景技術：
棒曲霉(Aspergillus clavalus)是曲霉屬的一種絲狀真菌，棒曲霉產(chǎn)生的棒曲霉 素具有致畸性和致癌性，對動物的胚胎具有致死性，人誤食棒曲霉或棒曲霉素污染的食物 易發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如頭暈、頭痛、遲鈍、躁動或運動失調(diào)，甚至出現(xiàn)驚厥、昏迷、麻痹等癥 狀。棒曲霉素主要污染蘋果及其制品，嚴重影響我國蘋果制品的出口 ；此外，飼料也常受到 棒曲霉菌的污染。目前，棒曲霉的防治方法主要有以下幾種1、噴灑農(nóng)藥法主要用于蘋果的田間防護，但是大量農(nóng)藥的施用容易引起二次污 染，危害人體健康，同時對生態(tài)環(huán)境造成污染；2、紙包或塑料袋包裝法主要用于蘋果的田間防護，但是這種防護方法應用起來 比較麻煩，費時費力，并且也對生態(tài)環(huán)境造成污染；3、聚乙烯(PE)袋包裝配合氣調(diào)法主要用于蘋果貯藏過程的防護，將蘋果包裝在 聚乙烯(PE)袋中，同時用C02或者N2調(diào)節(jié)貯藏室的氣體，可以有效的抑制棒曲霉菌的生長， 但是這種方法需要修建特殊的貯藏室，花費比較大；4、冷藏法主要用于蘋果貯藏過程的防護，但是這種方法需要修建大型的冷庫，投 資比較大，并且單獨應用冷藏法不能完全抑制棒曲霉的生長；5、化學法可以用于蘋果的田間防護和蘋果收獲后貯藏過程的防護，但是化學試 劑的毒副作用使得該方法的廣泛應用受到一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新的芽孢桿菌，該菌株經(jīng)過發(fā)酵后能夠產(chǎn)生具有抑制棒 曲霉作用的活性代謝產(chǎn)物，該活性代謝產(chǎn)物可用于制備防治棒曲霉的生防制劑，用于棒曲 霉的生物防治。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌，是芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JKl,已于2009年 2月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北 京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No 2914。芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914，是從陜西省白水縣宏達果 庫的紅富士蘋果中分離得到的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種防治棒曲霉的生防制劑。本發(fā)明所提供的防治棒曲霉的生防制劑，是發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillus sp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 得到的代謝產(chǎn)物。所述代謝產(chǎn)物可從除去芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns2914菌體的發(fā)酵濾液中獲得。上述生防制劑中，所述發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余為水；所述百分含量 均為質(zhì)量百分含量；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. 0-7. 2。所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為36°C 38°C，140r/m 160r/m，旋轉(zhuǎn)半徑20mm 26mm，振蕩 培養(yǎng)20h 24h。本發(fā)明的第三個目的是提供上述防治棒曲霉的生防制劑的制備方法。本發(fā)明所提供的防治棒曲霉的生防制劑的制備方法，是發(fā)酵芽孢桿菌 (Bacillussp.)NA2008-JKl CGMCC No 2914，從其發(fā)酵液中分離得到的代謝產(chǎn)物即為防治棒 曲霉的生防制劑。上述制備方法中，所述發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余為水；所述百分含量 均為質(zhì)量百分含量；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. 0-7. 2。所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為36°C 38°C，140r/m 160r/m，旋轉(zhuǎn)半徑20mm 26mm，振蕩 培養(yǎng)20h 24h。實驗證明，本發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914對棒 曲霉具有很強的拮抗作用。平板菌落的抑菌活性試驗結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillussp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914能明顯抑制棒曲霉菌的生長，棒曲霉菌落的平均直徑為 13. 4mm，且棒曲霉隨時間的推移不再生長；而對照菌株則不能抑制棒曲霉菌的生長，棒曲霉 越過對照菌株繼續(xù)生長，3天后棒曲霉菌落的平均直徑為32. 3mm。抑菌圈實驗結(jié)果表明，芽 孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914發(fā)酵濾液在PDA平板上可對棒曲霉產(chǎn)生 明顯的抑菌圈，抑菌圈的平均直徑為15. 6mm。因此，芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914和用它制備的生防制 劑在棒曲霉的防治中具有良好的應用前景。


圖 1 為芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC No 2914 的具體形態(tài)圖2為芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914與棒曲霉的平板對峙
培養(yǎng)試驗結(jié)果圖3為芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914對棒曲霉產(chǎn)生的抑菌 圈的照片
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實現(xiàn)本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基具體如下所述1、細菌(NA)培養(yǎng)基蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%，其余為水；pH7.0-7.2。所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。在NA液體培養(yǎng)基中加入1.5%質(zhì)量百分含量 的瓊脂即得到NA固體培養(yǎng)基。2、馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫 鉀0.1%，其余為水；pH 6.8-6.2。所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。在PDA液體培養(yǎng)基中 加入2%質(zhì)量百分含量的瓊脂即得到PDA固體培養(yǎng)基。實施例1、芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008JK1 CGMCC Ns 2914的分離、純化及鑒
定將取自陜西省白水縣宏達果庫的紅富士蘋果放在pH6. 8的0. 07mol/L的PBS洗液 中振蕩5min，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，洗去蘋果表面黏附的微生物；然后將上述清洗過的蘋果 加入到pH6. 8的0. 07mol/L的PBS洗液中振蕩15min，搖床轉(zhuǎn)速240r/min ；取出蘋果，將洗 液用無菌水倍比稀釋后涂布在NA培養(yǎng)基平板上，28°C條件下培養(yǎng)。不到24h，菌落便布滿整 個平板，菌落呈白色、不透明。挑取上述NA培養(yǎng)基平板上的單菌落將其命名為NA2008-JK1，對NA2008-JK1進行 染色觀察，具體過程如下在一塊干凈的載玻片上滴一滴無菌水，用接種環(huán)挑取單菌落，輕 輕在無菌水中涂布均勻，待水分干燥后，載玻片于火焰上停留l_2s，以固定菌體；在菌體上 滴加結(jié)晶紫染色液lmin后，用清水沖洗，干燥后顯微鏡下觀察。按照“伯杰細菌鑒定手冊”(第八版)和“常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊”(東秀珠，蔡妙 英等編著，北京科學出版社，2001. 2)中描述的方法，對菌株NA2008-JK1進行形態(tài)特征、培 養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下(1)菌體的形態(tài)特征該菌株細胞呈直桿狀，細胞中部有明顯芽孢，每個細胞產(chǎn)一個芽孢，生孢不被氧所 抑制，芽孢橢圓形，側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性。菌株的具體形態(tài)如圖1所示。(2)培養(yǎng)特性菌落白色，不透明，好氧，在NA培養(yǎng)基平板上生長迅速，當培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量百 分含量大于10%時不能生長。(3)生理生化特性在堿性培養(yǎng)基上不能分解木質(zhì)素、不能分解硫胺素、不含脂環(huán)酸、接觸酶陽 性、產(chǎn)乳酸、V-P測定陽性、能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、能水解酪朊、能水解淀粉。基于以上特征，將菌株NA2008-JK1鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，并于2009年 2月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北 京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No 2914。實施例2、芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914及其代謝產(chǎn)物的 抑菌活性試驗1、平板菌落的抑菌活性試驗采用平板對峙法，將培養(yǎng)48h后的棒曲霉(Aspergillus clavalus)(購于中國農(nóng) 業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號ACCC30579)用直徑0. 5cm的打孔器打制菌餅，然后 將菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，在不同培養(yǎng)皿中，距離棒曲霉菌餅1cm處分別點接芽孢桿 菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914或無拮抗作用的對照菌株，將培養(yǎng)皿用封口 膜密封，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后觀察試驗結(jié)果。每處理三個重復。
對峙培養(yǎng)的結(jié)果如圖2所示。其中左側(cè)圖為無拮抗作用的對照菌株，右側(cè)圖為芽 孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914。結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914能明顯抑制棒曲 霉菌的生長，棒曲霉菌落的平均直徑為13. 4mm，且棒曲霉隨時間的推移不再生長；而對照 菌株則不能抑制棒曲霉菌的生長，棒曲霉越過對照菌株繼續(xù)生長，3天后棒曲霉菌落的平均 直徑為32. 3mmo2、抑菌圈測定采用平板打孔法。將芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914接種于 NA液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，將發(fā)酵液過濾，所得濾液置于90°C水浴中加熱15min，備 用。將培養(yǎng)3天的棒曲霉(Aspergillus clavalus)(購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心，保藏編號ACCC30579)用無菌生理鹽水洗脫其孢子，制備成1 X 105CFU/mL的孢子懸浮 液，取0. lmL孢子懸浮液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，靜置30min后，取牛津杯置于平板 中央，將0. 25mL上述90°C水浴加熱處理后的芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC M 2914的發(fā)酵濾液注入牛津杯中，對照組注入同樣體積的NA液體培養(yǎng)基，封口膜密封， 25°C培養(yǎng)3天后觀察試驗結(jié)果，十字交叉法測量抑菌圈直徑。每處理三個重復。抑菌試驗結(jié)果如圖3所示。其中左側(cè)圖為NA液體培養(yǎng)基，右側(cè)圖為芽孢桿菌 (Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 的發(fā)酵液。實驗結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914發(fā)酵濾液在 PDA平板上可對棒曲霉產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其三次重復的抑菌圈平均直徑為15. 6mm。
權(quán)利要求
芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1，其保藏登記號為CGMCC №2914。
2.芽孢桿菌(Bacillussp.)NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914在制備防治棒曲霉的生防制 劑中的應用。
3.一種防治棒曲霉的生防制劑，是發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1CGMCC Na 2914得到的代謝產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生防制劑，其特征在于所述代謝產(chǎn)物從除去芽孢桿菌 (Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914 菌體的發(fā)酵濾液中獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生防制劑，其特征在于所述發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillus sp. )NA2008-JK1 CGMCC Na 2914的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7. 0-7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生防制劑，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為36°C 38°C， 140r/m 160r/m，旋轉(zhuǎn)半徑20mm 26mm，振蕩培養(yǎng)20h 24h。
7.一種制備權(quán)利要求3-6中任一所述的防治棒曲霉的生防制劑的方法，是發(fā)酵芽孢桿 菌(Bacillus sp.)NA2008-JKl CGMCC N2 2914，從其發(fā)酵液中分離得到的代謝產(chǎn)物即為防 治棒曲霉的生防制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵芽孢桿菌(Bacillussp.) NA2008-JK1 CGMCC Ns 2914的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蛋白胨1 %、牛肉膏0. 3%、NaC10. 5%， 其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7. 0-7. 2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為36°C 38°C，140r/ m 160r/m，旋轉(zhuǎn)半徑20mm 26mm，振蕩培養(yǎng)20h 24h。
10.權(quán)利要求3-6中任一所述的生防制劑在防治棒曲霉中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株芽孢桿菌及其在棒曲霉防治中的應用。該菌株是芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914。該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生對棒曲霉具有拮抗作用的代謝產(chǎn)物。平板菌落的抑菌活性試驗結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914能明顯抑制棒曲霉菌的生長，棒曲霉菌落的平均直徑為13.4mm，且棒曲霉隨時間的推移不再生長；而對照菌株則不能抑制棒曲霉菌的生長，棒曲霉越過對照菌株繼續(xù)生長，3天后棒曲霉菌落的平均直徑為32.3mm。抑菌圈實驗結(jié)果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp.)NA2008-JK1 CGMCC №2914發(fā)酵濾液在PDA平板上可對棒曲霉產(chǎn)生明顯的抑菌圈，抑菌圈的平均直徑為15.6mm。
文檔編號C12N1/20GK101824389SQ20091007870
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者劉陽, 張亞健, 邢福國 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所