一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地講是一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子采集及超低溫冷凍保存方法。將性腺發(fā)育飽滿的雄性太平洋牡蠣經(jīng)過(guò)光照刺激，解剖性腺，篩絹網(wǎng)過(guò)濾獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)太平洋牡蠣的精子。精液與抗凍液以適宜的比例混合分裝至2ml或5ml凍存管；經(jīng)過(guò)平衡孵育、程序降溫然后投入液氮中長(zhǎng)期保存；水浴解凍，自然海水激活，獲得凍精活力高于70%,受精率高于95%的受精率。本發(fā)明的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子采集及超低溫冷凍保存方法對(duì)于太平洋牡蠣人工繁育、種質(zhì)保存、遺傳多樣性及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
【專利說(shuō)明】一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集及冷凍保存的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]太平洋牡販(Crassostrea gigas)隸屬于牡販科，巨販屬,俗稱真牡販,是牡販類中個(gè)體較大的一種貝類。其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)45%?57%、脂肪7%?11%、肝糖19%?38%，碘的含量高于牛奶和雞蛋，此外，還含有多種維生素及微量元素，有海洋牛奶之美稱。20世紀(jì)80年代從日本、澳大利亞和臺(tái)灣地區(qū)引入中國(guó)。貝類精液的超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的意義。太平洋牡蠣多采用解剖法人工授精，對(duì)優(yōu)質(zhì)雄性牡蠣要求較高，雄性親貝精子的質(zhì)量嚴(yán)重制約了太平洋牡蠣的養(yǎng)殖繁育。除此之外，太平洋牡蠣精子的超低溫冷凍保存是太平洋牡蠣在家系的構(gòu)建過(guò)程雄性親本留種的一個(gè)最為重要和可靠的方法。采用超低溫冷凍保存的方法可以在雄性太平洋牡蠣性腺發(fā)育最佳時(shí)期，將優(yōu)質(zhì)的的親貝的精子進(jìn)行批量冷凍長(zhǎng)期保存，在需要的時(shí)候隨時(shí)解凍進(jìn)行人工授精。同時(shí)超低溫保存可以使精子的長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)靡詫?shí)現(xiàn)，有利于貝類的雜交、選育、優(yōu)良形狀的獲得以及基因多樣性的保護(hù)。因此，建立太平洋牡蠣精子大容量超低溫保存的可靠方法對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0005]一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集:
[0006]a)將性腺發(fā)育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進(jìn)行光照刺激，使雄性親本開(kāi)始排精,收集精子，待用；
[0007]b)將上述采集的精子經(jīng)篩絹網(wǎng)過(guò)濾，收集活力高于80%的精子。
[0008]所述步驟a)選擇殼長(zhǎng)8-lOcm性腺發(fā)育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進(jìn)行暫養(yǎng)，而后撈出置于陽(yáng)光下暴曬1-1.5小時(shí)，照射后翻轉(zhuǎn)到另一面再暴曬1-1.5小時(shí)后放入18-20°c自然海水中，待雄性牡蠣開(kāi)始排精后立即從水中將其取出。
[0009]所述步驟b)將采集的精子用100-120目篩絹網(wǎng)過(guò)濾，收集活力高于80%的精子。
[0010]一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，
[0011]a)將經(jīng)篩絹過(guò)濾的活力高于80%的精子中加入抗凍液，于0_4°C孵育；其中精液與抗凍液按1:4-1:6 (V/V)的比例混合；
[0012]b)精子于抗凍液中孵育后，分裝置2ml_5ml凍存管中，在程序降溫儀中經(jīng)孵育、兩步降溫、平衡，然后從程序降溫儀中取出，直接投入到_196°C的液氮，長(zhǎng)期保存。
[0013]所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為:NaCl:8g/L,KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗凍劑:10-12% (V/V) DMSO (二甲基亞砜)和3-4%PG (丙二醇)(以稀釋液作為基準(zhǔn)的體積比)；添加劑:葡萄糖:10g/L,海藻糖 170g/L。
[0014]所述冷凍保存步驟a)將經(jīng)篩絹過(guò)濾收集的活力高于80%的精子中加入抗凍液，用力顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2-3min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過(guò)100-120目篩絹網(wǎng)過(guò)濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來(lái)，然后用抗凍液沖洗篩絹網(wǎng)及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補(bǔ)充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:4-1:6，而后于0-4°C孵育20-30min。
[0015]所述冷凍保存步驟b)精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在0-4°C下孵育20-30min，而后以-10—15°C /min 的速率降溫至-60—80°C，然后再以-20—25 °C /min的速率降溫至-150--180°C，平衡2-5分鐘，從程序降溫儀腔體中取出，直接投入到液氮(_196°C)，分裝保存。
[0016]所述冷凍保存的精子解凍是將凍存管直接放入30-40°C水浴，置于室溫，震蕩20-30s，然后置于0-4°C冰箱中保存，待用。
[0017]所述冷凍保存的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣凍精解凍時(shí)，直接放入30_40°C水浴100-120S，期間不斷搖動(dòng)凍存管，然后放置于振蕩器室溫震蕩30s至完全融化，自然海水激活。
[0018]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0019]1.本發(fā)明采集精子是采用暴曬刺激，等待牡蠣排精的時(shí)刻，解剖性腺，可獲得大量的聞活力的優(yōu)質(zhì)精子；
[0020]2.本發(fā)明采集精子后用100目篩絹網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，并將大塊的性腺組織通過(guò)篩絹網(wǎng)的擠壓可最大程度的獲得性腺內(nèi)的精子；
[0021]3.本發(fā)明在精子收集的過(guò)程中加入抗凍液，可減少精子在空氣的暴露時(shí)間，減少精子在冷凍前遭受的損傷，同時(shí)減少精子的浪費(fèi)，有利于精子的收集；并且抗凍液中采用DMSO和PG作為抗凍劑，保持較好滲透性，和較低的毒性；另外抗凍液中加入了 10g/L葡萄糖，170g/L海藻糖，其可對(duì)精子的質(zhì)膜起到很好的保護(hù)作用；
[0022]4.本發(fā)明采用2_5ml凍存管容積較大，保存精液量大；
[0023]5.本發(fā)明在處理時(shí)冷凍前鮮精與抗凍液充分震蕩混勻，0_4°C平衡10_20min，使抗凍液充分滲入精子內(nèi)部，減小了降溫時(shí)對(duì)精子細(xì)胞的損害；
[0024]6.本發(fā)明冷凍處理時(shí)以分段方式降溫，采用以-10—15 V /min速度降溫，使冷凍精子安全度過(guò)“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，然后采用-20°C /min的降溫速率快速進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)-150-18(TC，然后投入液氮，降溫程序精密且快速；
[0025]7.本發(fā)明冷凍精子從液氮中取出后，采用二步解凍法，30°C-40°C和20°C兩步解凍，可使精子快速度過(guò)重結(jié)晶區(qū)，同時(shí)又避免了局部溫度過(guò)高導(dǎo)致的損傷；
[0026]8.采用本發(fā)明精密的降溫程序，重復(fù)性穩(wěn)定性好，凍精解凍后復(fù)蘇率高，激活后運(yùn)動(dòng)率高于70%，受精率高于90%與鮮精活性基本相同。

【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028]1.6月中旬，在正值太平洋牡蠣生殖生殖期，于膠南養(yǎng)殖基地取得近海籠養(yǎng)牡蠣5只，于貝類養(yǎng)殖室暫養(yǎng)，冷凍保存前將雄性太平洋牡蠣從暫養(yǎng)池中撈出，于陽(yáng)光下暴曬I小時(shí)，而后翻轉(zhuǎn)到另一面再暴曬I小時(shí)后放入室溫海水中，觀察到雄牡蠣排精后立即取出，通過(guò)解剖法取出精液，篩絹過(guò)濾去除組織雜塊，收集活力高于80%的精子。
[0029]2.將上述收集的收集活力高于80%的精子中加入事先配制好的抗凍液充分混勻，用力在碎冰中((TC)輕輕顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過(guò)100篩絹網(wǎng)過(guò)濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來(lái)，然后用抗凍液沖洗篩絹網(wǎng)及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補(bǔ)充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:5，而后混裝于2!111凍存管中，分裝12個(gè)凍存管，0-4°C平衡20min。其中，抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為:NaCl:8g/L, KCl: 0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗凍劑為10% (以稀釋液作為基準(zhǔn)的體積比v/v) DMSO (二甲基亞砜)和3%PG (丙二醇)；添加劑:葡萄糖:10g/L，海藻糖170g/L;
[0030]抗凍液的配置過(guò)程:首先用蒸餾水配置稀釋液，稱取NaCl 8g，KCl 0.8g,Na2HPO4.2Η20:0.lg/L,KH2P04:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L，然后定容至 IL 備用；采用已配置的稀釋液作為基礎(chǔ)液配置抗凍劑，其中含10%DMS0(V:V)和3%PG(V:V)(即10mL含1mLDMSO，3mL PG);然后將已配置好的抗凍劑作為基礎(chǔ)液,加入葡萄糖Ig,海藻糖17g,定容至100mL。抗凍液預(yù)先配置并置于4°C冰箱預(yù)冷；
[0031]3.程序降溫儀開(kāi)啟，預(yù)冷至0°C，而后將精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在(TC下孵育20min，而后以-10°C /min的速率降溫至_60°C，然后再以_20°C /min的速率降溫至_150°C，平衡2分鐘，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長(zhǎng)期貯存(_196°C);
[0032]4.冷凍保存2h后解凍，任意選取3個(gè)凍存管解凍，解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速?gòu)暮兄腥〕龇湃?7°C水浴鍋中，輕輕搖動(dòng)100s，然后置于室溫20°C放置于振蕩器震蕩30s至完全融解；
[0033]5.自然海水激活，顯微鏡檢測(cè)凍精活力高于70% ;進(jìn)行人工授精，獲得受精達(dá)95%以上。
[0034]實(shí)施例2
[0035]1.7月初，在正值太平洋牡蠣生殖生殖期，在膠南養(yǎng)殖基地采集雄性太平洋牡蠣I(yíng)只，性腺發(fā)育非常飽滿，于陽(yáng)光暴曬I小時(shí)，而后翻轉(zhuǎn)到另一面再暴曬I小時(shí)后放入室溫海水中，觀察到雄牡蠣排精后立即取出，通過(guò)解剖法取出精液；篩絹過(guò)濾去除組織雜塊，收集活力聞?dòng)?0%的精子。
[0036]2.將上述收集的收集活力高于80%的精子中加入事先配制好的抗凍液充分混勻，用力在碎冰中((TC)輕輕顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過(guò)100篩絹網(wǎng)過(guò)濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來(lái)，然后用抗凍液沖洗篩絹網(wǎng)及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補(bǔ)充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:4，而后混裝于2!111凍存管中，分裝25個(gè)凍存管，0-4°C平衡20min;其中，抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為:NaCl:8g/L,KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ；抗凍劑為10%DMS0 (二甲基亞砜)和3%PG (丙二醇)；添加劑:葡萄糖:10g/L，海藻糖170g/L;
[0037]抗凍液的配置過(guò)程:首先用蒸餾水配置稀釋液，稱取NaCl 8g，KCl 0.8g,Na2HPO4.2Η20:0.lg/L,KH2P04:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L，然后定容至 IL 備用；采用已配置的稀釋液作為基礎(chǔ)液配置抗凍劑，其中含10%DMS0(V:V)和3%PG(V:V)(即10mL含1mLDMSO，3mL PG);然后將已配置好的抗凍劑作為基礎(chǔ)液,加入葡萄糖Ig,海藻糖17g,定容至100mL。抗凍液預(yù)先配置并置于4°C冰箱預(yù)冷；
[0038]3.程序降溫儀開(kāi)啟，預(yù)冷至0°C，而后將精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在(TC下孵育20min，而后以-15°C /min的速率降溫至_80°C，然后再以_20°C /min的速率降溫至_150°C，平衡5分鐘，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長(zhǎng)期貯存(_196°C);
[0039]4.冷凍保存2h后解凍，任意選取3個(gè)凍存管解凍，解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速?gòu)暮兄腥〕龇湃?7°C水浴鍋中，輕輕搖動(dòng)100s，然后置于室溫20°C放置于振蕩器震蕩30s至完全融解；
[0040]5.自然海水激活，顯微鏡檢測(cè)凍精活力高于70% ;人工授精，獲得受精達(dá)95%以上；
[0041]6.剩余的樣品整到液氮容器中長(zhǎng)期保存，并成功用于太平洋牡蠣家系的構(gòu)建。
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于: a)將性腺發(fā)育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進(jìn)行光照刺激，使雄性親本開(kāi)始排精，收集精子，待用; b)將上述采集的精子經(jīng)篩絹網(wǎng)過(guò)濾，收集活力高于80%的精子。
2.按權(quán)利要求1所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于:所述步驟a)選擇殼長(zhǎng)8-lOcm性腺發(fā)育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進(jìn)行暫養(yǎng)，而后撈出置于陽(yáng)光下暴曬1-1.5小時(shí)，照射后翻轉(zhuǎn)到另一面再暴曬1-1.5小時(shí)后放入18-20°C自然海水中，待雄性牡蠣開(kāi)始排精后立即從水中將其取出。
3.按權(quán)利要求1所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于:所述步驟b)將采集的精子用100-120目篩絹網(wǎng)過(guò)濾，收集活力高于80%的精子。
4.一種優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于: a)將經(jīng)篩絹過(guò)濾的活力高于80%的精子中加入抗凍液，于0-4°C孵育；其中精液與抗凍液按1:4-1:6 (V/V)的比例混合； b)精子于抗凍液中孵育后，分裝置2ml-5ml凍存管中，在程序降溫儀中經(jīng)孵育、兩步降溫、平衡，然后從程序降溫儀中取出，直接投入到_196°C的液氮，長(zhǎng)期保存。
5.按權(quán)利要求4所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于:所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為=NaCl:8g/L, KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗凍劑:10-12% (V/V) DMSO (二甲基亞砜)和3-4%PG (丙二醇)；添加劑:葡萄糖:10g/L，海藻糖170g/L。
6.按權(quán)利要求4所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于: 所述步驟a)將經(jīng)篩絹過(guò)濾收集的活力高于80%的精子中加入抗凍液，用力顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2-3min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過(guò)100-120目篩絹網(wǎng)過(guò)濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來(lái)，然后用抗凍液沖洗篩絹網(wǎng)及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補(bǔ)充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:4-1:6，而后于0-4°C孵育20-30min。
7.按權(quán)利要求4所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于: 所述步驟b)精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在0-4°C下孵育20-30min，而后以-10—15°C /min的速率降溫至-60—80°C，然后再以-20—25 °C /min的速率降溫至-150--180°C，平衡2-5分鐘，從程序降溫儀腔體中取出，直接投入到液氮(_196°C )，分裝保存。
8.按權(quán)利要求4所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于: 所述冷凍保存的精子解凍是將凍存管直接放入30-40°C水浴，置于室溫，震蕩20-30S，然后置于0-4°C冰箱中保存，待用。
9.按權(quán)利要求8所述的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于: 所述冷凍保存的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣凍精解凍時(shí)，直接放入30-40°C水浴100-120S，期間不斷搖動(dòng)凍存管，然后放置于振蕩器室溫震蕩30s至完全融化，自然海水激活。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK104336004SQ201310314722
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月24日
【發(fā)明者】劉建國(guó), 李軍, 許飛, 張國(guó)范, 李莉, 韓龍江 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所