一種中藥發酵生產靈芝的新方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征包括以下幾個方面：靈芝菌種的篩選、靈芝發酵培養基的制備、靈芝發酵條件的優化、靈芝中活性成分的分析研究。本發明以深層發酵為基礎，優化出一種使靈芝生長周期短、活性成分高的新方法，突破了現有常規發酵的途徑，豐富了藥用靈芝的活性成分及來源。本發明充分利用生物轉化技術，得到的靈芝既保留了原來的特性，又提高了靈芝的療效。
【專利說明】一種中藥發酵生產靈芝的新方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥生物轉化的應用研究領域。具體為一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法。

【背景技術】
[0002]靈芝是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是一種藥用價值極高的真菌類中藥，《神農本草經》將其分為赤芝、黑芝、青芝、白芝、黃芝和紫芝。明代著名醫學家李時珍在《本草剛目》中對靈芝有比較詳盡的闡述，但由于科學條件和靈芝數量的限制，只能通過臨床實踐對其藥用價值做個大致了解，但其中的活性成分、作用機理、藥理作用并不清楚。最近幾十年，由于人工栽培技術的廣泛應用和科學醫療水平的提高，人們對靈芝的成分及作用機理做了大量研究。研究表明，靈芝中主要的活性成分是靈芝多糖，它具有提高人體免疫力、抑制腫瘤、抗血栓、降血糖和抗衰老作用；另外靈芝中還含有甘露醇、麥角固醇、腺嘌呤、尿嘧啶等多種藥用有效成分，這些物質對治療和預防人類的常見疾病有著重大意義。
[0003]靈芝是中藥中的瑰寶，在實現人工栽培之前，人們對于靈芝的利用受地域的限制，并且產量很低，無法滿足人們日常的需要。隨著社會的不斷發展和科學技術的不斷進步，人們發明了段木栽培生產靈芝，但此方法需要大量的木材，經濟上考慮，成本太高；同時也不利于生態環境的保護，故此法很快被淘汰。之后人們又發明了代料栽培，其取材于農林副產品的下腳料，經濟成本和環境成本都得到明顯降低，但是生產周期比較長，也不利于工業化生產。
[0004]與以上栽培技術不同，利用發酵法生產靈芝菌絲可利用調節發酵培養基和發酵條件等在短時間內生產出大量的靈芝菌絲，所得菌絲與天然靈芝菌絲和人工栽培靈芝菌絲成分相差無幾，這種方法的最大優點是易于連續生產、周期短、產量高，切十分易于工業化。但常規的發酵方法所得靈芝菌絲活性成分與天然菌絲相差不大，且菌絲產量不高，本發明篩選出生長周期較短的菌種，之后優化發酵培養基及條件，并在發酵過程中添加一種或者集中中藥的混合成分，明顯提高的菌絲產量和菌絲中活性成分的含量，除此之外，還使靈芝中含有了所添加中藥中的活性成分，進一步提高了靈芝的藥用價值。


【發明內容】

[0005]本發明公開了一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征包括以下幾個方面:靈芝菌種的篩選、靈芝發酵培養基的制備、靈芝發酵條件的優化、靈芝中活性成分的分析研究。本發明以深層發酵為基礎，優化出一種使靈芝生長周期短、活性成分高的新方法，突破了現有常規發酵的途徑，豐富了藥用靈芝的活性成分及來源。本發明充分利用生物轉化技術，得到的靈芝既保留了原來的特性，又提高了靈芝的療效。發明以傳統的發酵工藝為基礎，利用生物轉化技術優化名貴中藥才，提高并增加其藥效成分，促進名貴中藥的合理使用和開發。
[0006]實施方式通過以下實施例對本發明做進一步闡述實施例1
利用8%麥麩粉，5%的黃豆餅粉，0.20%的磷酸二氫鉀和0.15 %的硫酸鎂做培養基，將菌株的斜面菌種接到液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調至pH為5.5，于28°C 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0007]供試菌株包括:靈芝G9、靈芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；
實施例2
利用I中篩選出的菌株對發酵培養基各成分的濃度進行優化麥麩粉做4%、6%、8%、10%、12%五個濃度；在做麥麩濃度的過程中，其余濃度均按I中培養基濃度。
[0008]黃豆餅粉做1%、3%、5%、7%、9%五個濃度；在做黃豆餅粉濃度時，將確定的8%的麥麩加入到培養基中，其余同I中培養基；
磷酸二氫鉀做0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%五個濃度，在做磷酸二氫鉀濃度時，將確定的8%的麥麩和5%的黃豆餅粉加入到培養基中，其余同I中培養基；
硫酸鎂0.05%,0.10%,0.15%、0.20%,0.25%五個濃度，在做硫酸鎂濃度時，將確定的8%的麥麩、5%的黃豆餅粉和0.2%的磷酸二氫鉀加入到培養基中。
[0009]在以上液體培養基中加入1%、2%、3%、4%、5%人參粉，看菌絲生長情況及菌絲中活性成分的含量。
[0010]將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL,滅菌前調至pH為5.5，于28V 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0011]實施例3
利用I中菌種和2中培養基對對培養條件進行優化
培養時間:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調至pH為5.5，于28°C 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下分別培養5d、5.5d、6d、6.5d、7d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0012]培養溫度:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調至pH為5.5，分別于26 °C、27 V、28 °C、29 V、30 V 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0013]初始pH:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL,滅菌前調至pH為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5，于28°C 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0014]攪拌轉速:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量 30mL,滅菌前調至 pH 為 5.5,于 28°C lOOrpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm轉速培養5d得液體菌種。按12%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0015]接種量:將菌株的斜面菌種接到以上配好的液體菌種培養基中，10mL三角瓶裝液量30mL，滅菌前調至pH為5.5，于28°C 200rpm轉速培養5d得液體菌種。按8%、10%、12%、14%、16%接種量接到深層發酵培養基中，于相同條件下培養6d。發酵液經兩層紗布過濾，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，取菌絲于70°C干燥至恒重，電子天平稱重菌絲體干重。每個菌株設三次重復，測定結果3次重復的平均值。
[0016]實施例4
使用均質機勻漿后，用苯酚硫酸法測定靈芝多糖的含量；用考馬斯亮藍法測定菌絲中總蛋白含量；通過顯微鑒別對靈芝菌質檢測；薄層色譜法檢測靈芝中的人參皂苷Rg3和Rh2 ;用高效液相色譜測定人參皂苷Rg3和Rh的含量。
【權利要求】
1.一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征包括以下幾個方面: (I)靈芝菌種的篩選:配制液體篩選培養基，將不同供試靈芝菌株斜面接種到篩選液體培養基中，反復篩選3-5次，選出子實體生長最濃密的菌株；所述的液體培養基主要成分為:麥麩粉、豆餅粉、鉀鹽和鎂鹽；供試菌株包括:靈芝G9、靈芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；(2)按照步驟I中所述的培養基配方，對各成分濃度進行優化，之后在發酵液中加入一種或幾種中藥，并對其濃度優化，按照最優方案配制培養基，滅菌、冷卻備用；(3)將步驟I篩選出的菌株接種到步驟2中配好的培養基中，之后對發酵的條件進行優化；優化的發酵條件包括:培養時間、初始pH、培養溫度、攪拌轉速、接種量；(4)按照步驟2中配置的培養基及3中優化的培養條件對活性成分進行分析。
2.根據權利要求1所述的一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征在于，在發酵培養基中加入一種或幾種中藥，進而促進靈芝活性成分的合成。
3.根據權利要求1所述的一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征在于，靈芝的發酵周期相對較短，其周期為6d。
4.根據權利要求1所述的一種利用中藥發酵生產靈芝的新方法，其特征在于，靈芝中活性成分含量較野生靈芝中的含量提高50%。
【文檔編號】A01G1/04GK104335817SQ201310341006
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】張海軍, 郭海宏, 趙彥偉 申請人:山東百多安醫療器械有限公司