蛋白酶的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白酶，具體地涉及與源自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的蛋白酶同源的熱穩(wěn)定的蛋白酶，和其由野生型在重組宿主細(xì)胞中的制備，所述重組宿主細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因植物和非人的轉(zhuǎn)基因動物。所述蛋白酶在動物飼料，尤其是魚飼料和洗滌劑中是有效的。所述蛋白酶能夠降解大豆Bowman-Birk抑制物，和其他抗?fàn)I養(yǎng)因子，諸如大豆凝集素和Kunitz胰蛋白酶抑制物，以及分離的大豆貯存蛋白大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。公開了與肽酶家族S2A或S1E的這些蛋白酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)的特征的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。【專利說明】蛋白酶[0001]本發(fā)明申請是基于申請日為2004年6月21日，申請?zhí)枮椤?0048001714L9”(國際申請?zhí)枮椤癙CT/DK2004/000432”)，名稱為“蛋白酶”的發(fā)明專利申請的分案申請。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0002]本發(fā)明涉及分離的多肽,其具有蛋白酶活性并與擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶同源，以及編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有這些核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因的植物和非-人動物，以及制備和具體在動物飼料，例如魚飼料方面應(yīng)用所述蛋白酶的方法。[0003]本發(fā)明的蛋白酶是熱穩(wěn)定性的，并公開了與肽酶家族S2A或SlE的蛋白酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)的特征的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。[0004]本發(fā)明的蛋白酶進(jìn)一步有效地降解大豆Bowman-Birk抑制物，以及其他抗?fàn)I養(yǎng)因子(ant1-nutritionalfactor)，諸如大豆凝集素(soybeanagglutinin)和Kunitz膜蛋白酶(trypsin)抑制物，以及分離的大豆忙存蛋白(soystorageprotein),如大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。【
背景技術(shù)：
】[0005]來自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsissp.)NRRL18262和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei)NRRL18133的蛋白酶在W088/03947中公開。源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶的DNA序列和氨基酸序列顯示在DKapplicationn0.199600013中。W001/58276公開了酸-穩(wěn)定性的蛋白酶在動物飼料中的用途，所述酸-穩(wěn)定性的蛋白酶與源自擬諾卡氏`菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，以及源自NocardiopsisalbaDSM14010的蛋白酶相關(guān)。然而,這些蛋白酶不是熱穩(wěn)定性的。[0006]JP2-255081-A公開了源自擬諾卡氏菌屬菌種菌株0PC-210(FERMP-10508)的蛋白酶，然而卻沒有序列信息。該菌株已不能得到，因為此保藏物已經(jīng)撤消。[0007]DD20043218公開了源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌菌株ZMET43647的蛋白水解的制劑，然而卻沒有序列信息。看來該菌株已不能得到。[0008]在本發(fā)明的首次申請日之后出版的JP2003284571-A公開了源自擬諾卡氏菌屬菌種T0A-1(FERMP-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列，該序列已經(jīng)以n0.ADF43564進(jìn)入GENESEQP。[0009]在已有技術(shù)中描述了熱穩(wěn)定性蛋白酶，例如Lao和Wilson在Appl.Environ.Microbiol.62:4256-4259(1996)中描述的來自ThermomonosporafuscaYX的蛋白酶，而且它的序列已經(jīng)作為sptrembl_086984提交到公共數(shù)據(jù)庫中。然而,此蛋白酶與擬諾卡氏菌屬蛋白酶不同源，因為其與本發(fā)明的蛋白酶的同一性百分?jǐn)?shù)低于60%。[0010]本發(fā)明的一個目的是提供熱穩(wěn)定性的蛋白酶，其與擬諾卡氏菌屬蛋白酶同源，尤其是有潛力應(yīng)用于動物飼料和/或洗滌劑。【
發(fā)明內(nèi)容】[0011]分離并鑒定了若干熱穩(wěn)定性的蛋白酶，即源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種(Nocardiopsisdassonvilleisubsp.dassonvillei)DSM43235的蛋白酶(見SEQIDNOs:1和2)、合成的Protease22(見SEQIDN0s:7和8)、源自擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424的蛋白酶(見SEQIDN0s:9和10)和源自NocardiopsisalbaDSM15647的Protease8(見SEQIDNOs:11和12)。[0012]在第一個方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解鏈溫度(Tm)，如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液中，pH7.0，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的1-188、SEQIDNO:8的1-196、SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一性程度；(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸雜交；和(c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDN0:7的577-1164,SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白酶的分離的核酸序列；核酸構(gòu)建體、載體和包含所述核酸序列的宿主細(xì)胞；以及制備和具體在動物飼料方面應(yīng)用所述蛋白酶的方法。[0013]在第二個方面,本發(fā)明涉及:[0014]A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族SlE的分離的多肽,其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、135N、147F、151S、165S、166V、171Y、179I和/或1861;優(yōu)選10Y、38T、82S、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S和/或171Y;更優(yōu)選與95P、100V和/或1141中的至少一個一起；和/或與(H35+D61+S143)—起；其中每個位點(diǎn)對應(yīng)于SEQIDNO:2的位點(diǎn)；[0015]B.B的多肽，其在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:38T、92S、120T、125Q、131L、135N、147F、151S、165S和/或171Y；[0016]C.A的多肽，其在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:10Y、24S、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、96A、99A、118N、122R、129Y、130S、166V、179I和/或1861；[0017]D.肽酶家族S2A和/或肽酶家族SlE的分離的多肽，其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:25S、38T、42P、44S、49Q、54R、62S、89S、91S、92S、95A、99Q、1001、114V、120T、125Q、129Q、131L、135N、147F、151S、165S、166F、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T；優(yōu)選25S、38T、42P、44S、54R、62S、125Q、131L、165S、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T;更優(yōu)選與24A、51V、53E、86A、87T、96I和/或186L中至少一個一起，和/或與(H35+D61+S143)—起；其中每個位點(diǎn)對應(yīng)于SEQIDNO:12的位點(diǎn)；[0018]E.D的多肽，其在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:38T、92S、120T、125Q,131L、135N、147F,151S、165S和/或171Y;[0019]F.D的多肽，其在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:25S、42P、44S、49Q、54R、62S、89S、91S、95A、99Q、1001、114V、129Q、166F、176N、179L、180S、184L和/或185T；[0020]G.A、B、C、D、E和F中任一個的多肽，其具有至少78°C的Tm，如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉，pH7.0中進(jìn)行測定，和/或在pH9和80°C至少0.40的相對活性；[0021]H.A、B、C、D、E、F和G中任一個的多肽，其與SEQIDNO:2的氨基酸-166至188，優(yōu)選1-188；SEQIDNO:8的氨基酸-192至196，優(yōu)選1-196；SEQIDNO:10的氨基酸-195至189，優(yōu)選1-189;SEQIDNO:12的氨基酸-167至-1，優(yōu)選1-188中的任一個具有至少60%的同一性百分?jǐn)?shù)。[0022]1.A、B、C、D、E、F、G和H中任一個的多肽，其為i)細(xì)菌蛋白酶；ii)放線菌門(phylumActinobacteria)的蛋白酶；iii)放線菌綱(classActinobacteria)；iv)放線菌目(orderActinomycetales);v)Nocardiopsaceae科；vi)Nocardiopsis屬；和/或蛋白酶，其源自vii)擬諾卡氏菌屬菌種，諸如Nocardiopsisalba>Nocardiopsisalkaliphila、Nocardiopsisantarctica、Nocardiopsisprasina、Nocardiopsiscomposta、Nocardiopsisexhalans、Nocardiopsishalophila、Nocardiopsishalotolerans、Nocardiopsiskunsanensis、Nocardiopsislister1、Nocardiopsislucentensis、Nocardiopsismetallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsistrehalos1、Nocardiopsistropica>NocardiopsisumidischoIae>Nocardiopsisxinjiangensis或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌，例如源自Nocardiopsisantartica或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌的蛋白酶，例如達(dá)松維爾擬諾卡氏菌DSM43235、擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424或NocardiopsisalbaDSM15647，如具有SEQIDN0s:2、8、10或12中任一個的成熟肽部分的氨基酸序列的多肽；[0023]J.分離的核酸序列，包括編碼A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一個的多肽的核酸序列；[0024]K.核酸構(gòu)建體,包括可操作地與一個或多個控制序列(controlsequence)連接的J的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生；[0025]L.重組表達(dá)載體，包括K的核酸構(gòu)建體；[0026]M.重組宿主細(xì)胞，包括K的核酸構(gòu)建體或L的載體；[0027]N.產(chǎn)生A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一個的多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)M的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽；[0028]0.轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一個的多肽；[0029]P.轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，能夠表達(dá)A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一個的多肽；[0030]Q.將至少一種在A、B、C、D、E、F、G、H或I中定義的多肽應(yīng)用于(i)動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食(diet)中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(V)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工處理蛋白質(zhì)；[0031]R.動物飼料添加劑，包括至少一種A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一個所定義的多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(C)至少一種痕量礦物(tracemineral)；[0032]S.動物飼料組合物，優(yōu)選魚飼料，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一個所定義的多肽，或至少一種R的飼料添加劑；[0033]T.一種組合物，包括至少一種A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一個所定義的多肽，連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4*EC3.2.1.6);以及[0034]U.至少一種A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一個所定義的多肽在洗滌劑中的用途。[0035]在第三個方面,本發(fā)明渉及:[0036]1.具有蛋白酶活性的分離的多肽，其在37°C和pH6.5溫育4小時之后，降解至少36%(優(yōu)選至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或至少81%)的大豆Bowman-Birk抑制物，所述的降解百分?jǐn)?shù)是用100%減去在溫育后染色的SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20%)凝膠上完整的Bowman-Birk抑制物條帶的百分比強(qiáng)度進(jìn)行測定的，相對所述溫育之前的同樣條帶的強(qiáng)度，所述條帶的強(qiáng)度通過掃描凝膠進(jìn)行測定；其中所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的1-188、SEQIDNO:8的1-196、SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一性程度；(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDN0:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個雜交；和(c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與SEQIDN0:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度；[0037]I1.1的多肽，其中所述溫育在溫育緩沖液中進(jìn)行，所述溫育緩沖液含有50mM二甲基戊二酸、150mMNaClUmMCaCl2、0.01%TritonX-100,ρΗ6.5；[0038]II1.1或II中任一個的多肽，其中，在溫育過程中，蛋白酶多肽和Bowman-Birk抑制物之間的比例為1:10，基于A28tl；[0039]IV.1、II或III中任一個的多肽，其中所述凝膠用考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)染色；[0040]V.1、I1、III或IV中任一個的多肽，其中所述Bowman-Birk抑制物是SigmaT-9777；[0041]V1.1、I1、II1、IV或V中任一個的多肽，進(jìn)一步能夠降解至少一種下列純化的大豆蛋白:大豆凝集素(Soybeanagglutinin)(SBA)、Kunitz胰蛋白酶抑制物、大豆球蛋白(glycinin)和/或β-伴大豆球蛋白，應(yīng)用如在1、I1、II1、IV或V中任一個所述的原理；[0042]VI1.VI的多肽，其將至少一種純化的大豆蛋白降解到至少10%的程度，優(yōu)選至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%或至少98%；[0043]VII1.分離的核酸序列，包括編碼1、I1、II1、IV、V、VI或VII中任一個的多肽的核酸序列；[0044]IX.分離的核酸序列，包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有蛋白酶活性，所述多肽在37°C和pH6.5溫育4小時后降解至少36%(優(yōu)選至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或至少81%)的大豆Bowman-Birk抑制物，所述的降解百分?jǐn)?shù)是用100%減去在溫育后染色的SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20%)凝膠上完整的Bowman-Birk抑制物條帶的百分比強(qiáng)度進(jìn)行測定的，相對所述溫育之前的同樣條帶的強(qiáng)度，所述條帶的強(qiáng)度通過掃描凝膠進(jìn)行測定；其中所述核酸序列(a)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDN0:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個雜交；(b)與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度；和/或(c)編碼一種多肽，所述多肽與SEQIDNO:2的1_188、SEQIDNO:8的1-196,SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一'I"生程度；[0045]X.核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的VIII或IX中任一個的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生；[0046]X1.重組表達(dá)載體，包括X的核酸構(gòu)建體；[0047]XI1.重組宿主細(xì)胞，包括X的核酸構(gòu)建體或XI的載體；[0048]XII1.產(chǎn)生I的多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)XII的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽；[0049]XII1.轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)I的多肽；[0050]XIV.轉(zhuǎn)基因的非-人動物或`產(chǎn)品或其成分，其能夠表達(dá)I的多肽；[0051]XV.產(chǎn)生I的多肽的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)如下菌株中的任一種:(i)達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，(ii)擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424，或(iii)NocardiopsisalbaDSM15647;和(b)回收所述的多月太；[0052]XV1.將至少一種I中定義的多肽應(yīng)用于⑴動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(V)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)；[0053]XVI1.動物飼料添加劑，包括至少一種I中定義的多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(C)至少一種痕量礦物；[0054]IIXX.動物飼料組合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種I中定義的多肽，或至少一種XVII的飼料添加劑；[0055]IXX.1IXX的飼料組合物，其為魚飼料；[0056]XX.一種組合物，包括至少一種I中所定義的多肽,連同至少一種其他的酶,所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.'-)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)；以及[0057]XXI.至少一種I中定義的多肽在洗滌劑中的用途。[0058]在第四個方面，本發(fā)明涉及:[0059]a.具有蛋白酶活性的分離的多肽，所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列⑴與SEQIDN0:2的氨基酸1-188具有至少85%的同一性程度，(ii)與SEQIDNO:8的氨基酸1-196具有至少85%的同一性程度，(iii)與SEQIDNO:10的氨基酸1-189具有至少85%的同一性程度，和/或與SEQIDNO:12的氨基酸1-188具有至少89%的同一性程度；(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與(i)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，(ii)SEQIDNO:7的核苷酸577-1164，(iii)SEQIDNO:9的核苷酸586-1152，(iv)SEQIDNO:11的核苷酸502-1065，(V)至少100個核苷酸的(i)-(iv)中任一個的子序列(subsequence);和/或(vi)(i)-(v)中任一個的互補(bǔ)鏈雜交；(c)所述多肽的變體，其具有(i)SEQIDNO:2的氨基酸1-188，(ii)SEQIDNO:8的氨基酸1-196，(iii)SEQIDNO:10的氨基酸1-189，或SEQIDNO:12的氨基酸1-188的氨基酸序列，其包含取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的片段；[0060]b.分離的核酸序列，包括核酸序列其(a)編碼a的多肽；(b)編碼具有蛋白酶活性的多肽，其在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，(ii)SEQIDNO:7的核苷酸577-1164，(iii)SEQIDN0:9的核苷酸586-1152，(iv)SEQIDN0:11的核苷酸502-1065,(V)至少100個核苷酸的(i)-(iv)中任一個的子序列(subsequence);和/或(vi)(i)-(V)中任一個的互補(bǔ)鏈雜交；和/或(C)編碼具有蛋白酶活性的多肽，其⑴與SEQIDNO:1的核苷酸499-1062具有至少86%的同一性程度，(ii)與SEQIDN0:7的核苷酸577-1164具有至少86%的同一性程度，(iii)與SEQIDN0:9的核苷酸586-1152具有至少85%的同一性程度，(iv)與SEQIDNO:11的核苷酸502-1065具有至少89%的同一性程度；[0061]c.分離的核酸序列，其通過(a)在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將DNA與(i)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，(ii)SEQIDNO:7的核苷酸577-1164，(iii)SEQIDN0:9的核苷酸586-1152，(iv)SEQIDNO:11的核苷酸502-1065，(V)至少100個核苷酸的(i)-(iv)中任一個的子序列；和/或(vi)(i)-(v)中任一個的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離所述核酸序列來制備;[0062]d.核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的b或c中任一個的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。[0063]e.重組表達(dá)載體，包括d的核酸構(gòu)建體。[0064]f.重組宿主細(xì)胞，包括d的核酸構(gòu)建體或e的載體。[0065]g.產(chǎn)生a的多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)f的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。[0066]h.轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)a的多肽。[0067]1.轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，其能夠表達(dá)a的多肽。[0068]j.產(chǎn)生a的多肽的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)如下菌株中的任一種:⑴達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，(ii)擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424，或(iii)NocardiopsisalbaDSM15647;和(b)回收所述的多妝。[0069]k.將至少一種a中定義的多肽應(yīng)用于⑴動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(V)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)。[0070]1.動物飼料添加劑，包括至少一種a中定義的多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(c)至少一種痕量礦物。[0071]m.動物飼料組合物,其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種a中定義的多肽，或至少一種I的飼料添加劑。[0072]n.m的飼料組合物，其為魚飼料。[0073]ο.一種組合物，包括至少一種a中所定義的多肽，連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.'-)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)；以及[0074]p.至少一種a中定義的多肽在洗滌劑中的用途。[0075]在第五個方面，本發(fā)明涉及:具有蛋白酶活性的分離的多肽，所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的1-188，SEQIDNO:8的1-188，SEQIDNO:8的1-196的氨基酸具有至少84%的同一性程度；(b)具有氨基酸序列的多肽，其與SEQIDN0:2的-166至188，和/或SEQIDNO:8的-192至196的氨基酸具有至少75%的同一性程度；(c)由核酸序列編碼的多肽，其在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)編碼可從基因組DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因組DNA來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，通過應(yīng)用引物SEQIDNOs:3和4;(ii)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164;(iii)SEQIDNO:1的核苷酸1-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸1-1164；(iv)至少10`0個核`苷酸的⑴或(ii)或(iii)的子序列；和/或(V)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補(bǔ)鏈雜交；(d)所述多肽的變體，其具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188或-166至188，或SEQIDNO:8的氨基酸I至196或-192至196的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸；(e)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段；[0076]具有蛋白酶活性的分離的多肽，并具有至少78°C的解鏈溫度(Tm)如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉、pH7.0中，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1-188，與SEQIDNO:8的氨基酸1-188和/或SEQIDNO:8的氨基酸1-196具有至少50%的同一性程度；(b)具有氨基酸序列的多肽，其與SEQIDNO:2的氨基酸-166至188，和/或SEQIDN0:8的氨基酸-192至196具有至少50%的同一性程度；(c)由核酸序列編碼的多肽，其在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼可從基因組DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因組DNA來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，通過應(yīng)用引物SEQIDNOs:3和4；SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164;(iii)SEQIDNO:1的核苷酸1-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸1-1164;(iv)至少100個核苷酸的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(V)⑴、(ii)、(iii)或(iv)的互補(bǔ)鏈雜交；(d)所述多肽的變體，其具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188或-166至188，或SEQIDNO:8的氨基酸I至196或-192至196的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸;(e)(a)、(b)或(C)的等位基因變體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段；[0077]分離的核酸序列，其包括(a)編碼權(quán)利要求1的核酸序列；(b)編碼多肽，所述多肽具有蛋白酶活性，并在中-高嚴(yán)緊性條件下與(i)編碼可從基因組DNA得到的蛋白酶的DNA,所述基因組DNA來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，通過應(yīng)用引物SEQIDN0s:3和4;(ii)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164或1-1164；(iii)至少100個核苷酸的⑴或(ii)或(iii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(c)編碼多肽，其具有蛋白酶活性并與SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164具有至少85%的同一性程度；和/或(d)編碼多肽，其具有蛋白酶活性并與SEQIDNO:1的核苷酸1-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸1-1164具有至少81%的同一性程度的核酸序列；[0078]分離的核酸序列，其包括核酸序列，所述核酸序列編碼多肽，所述多肽具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解鏈溫度(Tm)如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉、PH7.0中，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述核酸序列(a)編碼上述的多肽；(b)在低嚴(yán)緊性條件下與:編碼可從基因組DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因組DNA來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，通過應(yīng)用引物SEQIDN0s:3和4；SEQIDNO:1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164或1-1164;至少100個核苷酸的⑴或(ii)的子序列；和/或⑴、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(c)與SEQIDNO:1的核苷酸499-1062和/或SEQIDNO:7的核苷酸577-1164具有至少50%的同一性程度；和/或(d)與SEQIDNO:1的核苷酸1-1062和/或SEQIDNO:7的核苷酸1-1164具有至少50%的`同一'丨生程度；[0079]通過(a)將DNA在中-高嚴(yán)緊性條件下與編碼蛋白酶的DNA雜交，所述的蛋白酶可從來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235的基因組DNA通過應(yīng)用引物SEQIDN0S.3和4得到；SEQIDNO:1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQIDN0:7的577-1164或1-1164;至少100個核苷酸的⑴或(ii)的子序列；或⑴、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈；和(b)分離所述的核酸序列；產(chǎn)生分離的核酸序列[0080]核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的上述核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。[0081]重組表達(dá)載體，包括所述的核酸構(gòu)建體。[0082]重組宿主細(xì)胞,包括所述的核酸構(gòu)建體或所述的載體。[0083]產(chǎn)生上述的多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求8的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。[0084]轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)上述的多肽。[0085]轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，其能夠表達(dá)上述的多肽。[0086]將至少一種上述的多肽應(yīng)用于(i)動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)。[0087]動物飼料添加劑，包括至少一種上述定義的多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(C)至少一種痕量礦物。[0088]動物飼料組合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種上述定義的多肽，或至少一種飼料添加劑。[0089]一種組合物，包括至少一種上述定義的多肽，連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89),α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.'-)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷月旨酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)；[0090]至少一種上述定義的多肽在洗滌劑中的用途；[0091]肽酶家族S2A和/或肽酶家族SlE的分離的多肽，其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列在指定的位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、135N、147F、151S、165S、166V、171Y、179I和/或1861;優(yōu)選10Y、38T、82S、95P、99A、100V、1141、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S和/或171Y;更優(yōu)選連同95P、100V和/或1141的至少一個；和/或連同(H35+D61+S143);其中每個位點(diǎn)對應(yīng)于SEQIDNO:2的位點(diǎn)；[0092]上述家族S2A或SlE多肽，其在指定的位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:38T、92S、120T、125Q、131L、135N、147F、151S、165S和/或171Y；[0093]上述家族S2A或SlE多肽，其在指定的位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:10Y、24S、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、96A、99A、118N、122R、129Y、130S、166V、179I和/或1861；[0094]上述家族S2A或SlE多肽，其具有至少78°C的Tni,如通過DSC在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉、pH7.0中進(jìn)行測定；和/或在pH9和80°C至少0.40的相對活性；[0095]上述家族S2A或SlE多肽，其與SEQIDNO:2的氨基酸1-188或-166至188和/或SEQIDNO:8的氨基酸1-196或-192至196具有至少50%的同一性百分?jǐn)?shù)；[0096]上述家族S2A或SlE多肽,其為i)細(xì)菌的蛋白酶；ii)Actinobacteria門的蛋白酶；iii)Actinobacteria綱的；iv)Actinomycetales目的v)Nocardiopsaceae科的；vi)Nocardiopsis屬的;和/或蛋白酶，其源自vii)Nocardiopsis菌種，諸如Nocardiopsisalba、Nocardiopsisantarctica、Nocardiopsisprasina、Nocardiopsiscomposta、Nocardiopsisexhalans、Nocardiopsishalophila、Nocardiopsishalotolerans、Nocardiopsiskunsanensis、Nocardiopsislister1、Nocardiopsislucentensis、Nocardiopsismetallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsistrehalos1、Nocardiopsistropica>NocardiopsisumidischoIae>Nocardiopsisxinjiangensis或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌，例如源自Nocardiopsisantarcticaor或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌的蛋白酶，例如達(dá)松維爾擬諾卡氏菌DSM43235，如具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188或-166至188的氨基酸序列的多肽；[0097]分離的核酸序列，包含編碼上述家族S2A或SlE多肽的氨基酸序列；[0098]核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的所述核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。[0099]重組表達(dá)載體,包括所述的核酸構(gòu)建體。[0100]重組宿主細(xì)胞,包括所述的核酸構(gòu)建體或所述的載體。[0101]產(chǎn)生上述家族S2A或SlE多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求8的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。[0102]轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)上述家族S2A或SlE多肽。[0103]轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，其能夠表達(dá)上述家族S2A或SlE多肽。[0104]將至少一種上述家族S2A或SlE多肽應(yīng)用于(i)動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)。[0105]動物飼料添加劑，包括至少一種上述家族S2A或SlE多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(C)至少一種痕量礦物。[0106]動物飼料組合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種上述家族S2A或SlE多肽，或至少一種飼料添加劑。[0107]—種組合物，包括至少一種上述家族S2A或SlE多肽,連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.'-)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4*EC3.2.1.6)；以及[0108]至少一種上述家族S2A或SlE多肽在洗滌劑中的用途；[0109]上述第二、第三、第四和第五方面是互相獨(dú)立的，也是本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選的子方面，以及相互的優(yōu)選的子方面。[0110]具體地，本發(fā)明涉及如下各項:[0111]1.分離的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解鏈溫度CU，如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液中，pH7.0，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述多肽選自:[0112](a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的1_188、SEQIDNO:8的1-196、SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一'丨生程度；[0113](b)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDN0:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸雜交；和[0114](c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度。[0115]2.分離的核酸序列，包括編碼項I的多肽的核酸序列。[0116]3.分離的核酸序列，包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解鏈溫度(Tm)，如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液中，pH7.0，應(yīng)用1.50C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述核酸序列[0117](a)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNO:1的499_1062、SEQIDNO:7的577_1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個雜交；[0118](b)與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度；和/或[0119](c)編碼多肽，所述多肽與SEQIDNO:2的1-188、SEQIDNO:8的1-196、SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一性程度。[0120]4.核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的項2或3的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。[0121]5.重組表達(dá)載體,包括項4的核酸構(gòu)建體。[0122]6.重組宿主細(xì)胞，包括項4的核酸構(gòu)建體或項5的載體。[0123]7.產(chǎn)生項I的多肽的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)項6的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。[0124]8.轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)項I的多肽。[0125]9.轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，能夠表達(dá)項I的多肽。[0126]10.產(chǎn)生項I的多肽的方法，所述方法包括[0127](a)培養(yǎng)如下菌株中的任一種:`[0128](i)達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，[0129](ii)擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424，或[0130](iii)NocardiopsisalbaDSM15647;和[0131](b)回收所述的多肽。[0132]11.將至少一種項I中定義的多肽應(yīng)用于⑴動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；(iv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(V)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)。[0133]12.動物飼料添加劑，包括至少一種項I中定義的多肽；和[0134](a)至少一種脂溶性的維生素，和/或[0135](b)至少一種水溶性的維生素，和/或[0136](c)至少一種痕量礦物。[0137]13.動物飼料組合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種項I中定義的多肽，或至少一種項12的飼料添加劑。[0138]14.項13的飼料組合物，其為魚飼料。[0139]15.一種組合物，包括至少一種項I中定義的多肽，連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶和/或葡聚糖酶。[0140]16.至少一種項I中定義的多肽在洗滌劑中的用途。[0141]17.擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424。[0142]18.NocardiopsisalbaDSM15647。[0143]發(fā)明詳述[0144]具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶，有時也稱為肽酶(peptidases)、蛋白質(zhì)酶(proteinases)、妝水解酶(peptidehydrolases)或蛋白水解酶(proteolyticenzymes)。蛋白酶可為外-類型的，其從肽的任一個末端開始水解肽；或為內(nèi)-類型的，其在多肽鏈的內(nèi)部起作用(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶在N和C-末端封閉的(blocked)肽底物上顯示活性，所述的肽底物與所述的蛋白酶的特異性相關(guān)。[0145]術(shù)語“蛋白酶”此處定義為水解肽鍵的酶。它包括屬于EC3.4酶組的任何酶(包括其第13小類的每一種)。所述EC編號指來自NC-1UBMB，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress),圣地亞哥，加利福尼亞的酶命名法1992(EnzymeNomenclature1992)，包括補(bǔ)充1-5，其分別發(fā)表于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.1997,250,1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650中。該命名法被定期地補(bǔ)充和更新；參見例如環(huán)球網(wǎng)(WorldWideWeb)(WWW),在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index,html。[0146]蛋白酶根據(jù)它們的催化機(jī)理分為如下組:絲氨酸蛋白酶(Serineproteases)(S)、半胱氨酸蛋白酶(Cysteineproteases)(C)、天冬氨酸蛋白酶(Asparticproteases)(A)、金屬蛋白酶(Metalloproteases)(M)和未知的或作為尚未分類的蛋白酶(U)，參見蛋白水解酶手冊(HandbookofProteolyticEnzymes),A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(編)，AcademicPress(1998),尤其是概括介紹部分。[0147]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶和根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的蛋白酶選自:[0148](a)屬于EC3.4.-.-酶組的蛋白酶；[0149](b)屬于上述手冊的S組的絲氨酸蛋白酶；[0150](c)肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；和/或[0151](d)肽酶家族SlE的絲氨酸蛋白酶，如在Biochem.J.290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫，版本6.20,March24,2003,(www.merops.ac.uk)中描述的。該數(shù)據(jù)庫在Rawlings,N.D.，O'Brien,E.A.&Barrett,A.J.(2002)MEROPS:theproteasedatabase.NucleicAcidsRes.30，343-346中描述。[0152]為檢測一種給定的蛋白酶是否是絲氨酸蛋白酶及家族S2A蛋白酶，參考了上述手冊和其中提及的原理。所有類型的蛋白酶都可以進(jìn)行上述檢測，無論是天然存在的或野生的蛋白酶，或是基因工程的或合成的蛋白酶。[0153]蛋白酶活性可以應(yīng)用任何測定方法進(jìn)行測定，其中應(yīng)用一種底物，它包含與所述蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。實(shí)驗-PH和實(shí)驗-溫度同樣地適合于所述的蛋白酶。實(shí)驗-pH-值的實(shí)例為pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12。實(shí)驗-溫度的實(shí)例為30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95°C。[0154]蛋白酶底物的實(shí)例為酪蛋白(casein)，如天青蛋白-交聯(lián)的酪蛋白(Azurine-CrosslinkedCasein)(AZCL_casein)。兩種蛋白酶實(shí)驗在本文的實(shí)施例2中描述，它們的任一種可以用于檢測蛋白酶活性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所謂的PNA實(shí)驗是優(yōu)選的測試方法。[0155]本發(fā)明的蛋白酶和根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的蛋白酶的來源沒有限制。因此，該術(shù)語蛋白酶不僅包括由任何屬的微生物得到的天然的或野生型的蛋白酶，而且也包括其顯示蛋白酶活性的任何突變體(mutant)、變體(variant)、片段(fragment)等，以及合成的蛋白酶,如改組的(shuffled)蛋白酶和共有的(consensus)蛋白酶。上述基因工程的蛋白酶可如本【
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】所公知的進(jìn)行制備，例如通過定點(diǎn)突變(Site-directedMutagenesis)、通過PCR(應(yīng)用包含所需突變的PCR片段作為PCR反應(yīng)中的一個引物)，或通過隨機(jī)突變(RandomMutagenesis)。共有的蛋白質(zhì)的制備描述于，例如EP897985。基因改組一般地描述于，例如W095/22625和W096/00343。蛋白酶基因的重組可以由親代的具體序列通過如Ness,J.E.等在NatureBiotechnology,Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中描述的合成的改組獨(dú)立地完成。合成的寡核苷酸在它們的DNA序列中簡并(degenerate)以提供設(shè)計親代蛋白酶組中發(fā)現(xiàn)的所有氨基酸的可能性和根據(jù)所述參考文獻(xiàn)組合的基因。可以對序列的全長進(jìn)行所述的改組或者只對序列的一部分進(jìn)行改組，然后再與該基因剩余的部分連接以得到全長的序列。SEQIDN0s:2、8、10和12的成熟肽部分的蛋白酶，如蛋白酶22(SEQIDNO:8)和源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235的蛋白酶(SEQIDNO:2)，是這些可以用于如上所述的改組的親代蛋白酶的具體實(shí)例，如果需要，連同源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，以提供本發(fā)明的附加的蛋白酶。本文應(yīng)用的術(shù)語“從…獲得”與一個給出的來源連接，它指由核酸序列編碼的多肽是通過所述來源或通過細(xì)胞產(chǎn)生的，在所述細(xì)胞中存在來自所述來源的核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多肽是分泌到細(xì)胞外的。[0156]在具體的實(shí)施方案中，所述蛋白酶是低-變應(yīng)原的(low-allergenic)變體，設(shè)計成當(dāng)其暴露于動物，包括人時，產(chǎn)生還原的(reduced)免疫反應(yīng)(immunologicalresponse)。術(shù)語免疫反應(yīng)被理解為暴露于所述蛋白酶的動物的免疫系統(tǒng)的任何反應(yīng)。免疫反應(yīng)的一種類型是過敏反應(yīng)(allergicresponse),其導(dǎo)致暴露的動物中的IgE水平上升。低-變應(yīng)原的變體可以應(yīng)用本【
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】已知的技術(shù)制備。例如，所述的蛋白酶可與聚合物部分防護(hù)部分或涉及免疫反應(yīng)的蛋白酶的抗原決定部位(epitope)結(jié)合。與聚合物的結(jié)合包括聚合物與所述蛋白酶的體外化學(xué)耦合，例如在WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489中所描述的。結(jié)合可另外或可選擇地包括聚合物與所述蛋白酶的體內(nèi)耦合。這樣的結(jié)合可以通過編碼所述蛋白酶的核苷酸序列的基因工程、插入蛋白酶中編碼附加的糖基化位點(diǎn)的共`有序列、和在能使蛋白酶糖基化的宿主中表達(dá)所述的蛋白酶實(shí)現(xiàn)，參見例如WO00/26354。提供低-變應(yīng)原的變體的另一種方法是編碼所述蛋白酶的核苷酸序列的基因工程，以使蛋白酶產(chǎn)生自寡聚化(self-oligomerize),結(jié)果蛋白酶單體可防護(hù)其他蛋白酶單體的抗原決定部位，并由此降低了所述寡聚體的抗原性。上述產(chǎn)物和它們的制劑例如在WO96/16177中描述。涉及免疫反應(yīng)的抗原決定部位可以通過多種方法進(jìn)行鑒定，如在WO00/26230和WO01/83559中描述的噬菌體顯示方法(phagedisplaymethod)或在EP561907中描述的隨機(jī)方法(randomapproach)。一旦鑒定了抗原決定部位，可以改變其氨基酸序列以通過已知的基因操作方法，如定點(diǎn)突變(參見例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)，使所述蛋白酶產(chǎn)生改變的免疫性質(zhì)，和/或充分接近所述抗原決定部位可進(jìn)行聚合物的結(jié)合以使聚合物防護(hù)該抗原決定部位。[0157]本發(fā)明的任何一個方面的多肽可以包括氨基酸序列，其與SEQIDN0s:2、8、10或12中的任一個的成熟肽部分，例如SEQIDNO:2的氨基酸I至188和/或SEQIDNO:8的氨基酸I至196(所述的成熟肽部分)具有例如至少大約60%的同一性程度，并且其具有蛋白酶活性(在下文稱為“同源多肽”)。在具體的實(shí)施方案中，與SEQIDN0s:2、8、10或12中任一個的任一成熟肽部分的同一性程度為至少大約62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在替換的實(shí)施方案中，所述同一性程度為至少大約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%或至少大約59%。[0158]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽i)具有氨基酸序列；或ii)由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列具有如上所述的任何的同一性程度。[0159]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，兩個氨基酸序列之間的同一性程度，以及兩個核苷酸序列之間的同一性程度，通過程序“比對”(align)進(jìn)行確定，所述的程序“比對”為Needleman-Wunsch排列(即全局排列)。該程序用于多肽以及核苷酸序列的排列，默認(rèn)的評分矩陣BL0SUM50用于多肽排列，而默認(rèn)的同一性矩陣用于核苷酸排列。缺口(gap)的第一個殘基的罰分對于多肽為-12，對于核苷酸為-16。缺口的更多的殘基的罰分對于多肽為-2,對于核苷酸為_4。[0160]“比對”是FASTA程序包版本v20u6的一部分(參見W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis"，PNAS85:2444-2448和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA,"MethodsinEnzymologyl83:63-98)。FASTA蛋白質(zhì)排列采用缺口大小上沒有限制的Smith-Waterman算法(參見"Smith-Watermanalgorithm",T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。[0161]在具體的實(shí)施方案中，兩個氨基酸序列的成熟肽部分，或預(yù)測的或預(yù)期的成熟肽部分用于排列。在替換的方案中，選擇序列的一部分，其與SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:8的成熟肽部分的同一性已進(jìn)行過檢驗，所述序列的一部分根據(jù)如下描述進(jìn)行的多重比對，與SEQIDN0:2和/或8的成熟肽部分最相似，即相對應(yīng)的氨基酸殘基，如通過多重比對排列所鑒定的。[0162]在本上下文中，氨基酸殘基編號或分配位點(diǎn)序號的的基礎(chǔ)，參照本發(fā)明的第二方面，為以Al開始以T188結(jié)束的SEQIDN0:2。在替換的方案中，所述基礎(chǔ)是源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶的氨基酸1-188(如在WO01/58276中公開的SEQIDNO:1,優(yōu)選如在WO01/58276中公開的SEQIDNO:1，其中A87用T87取代)。蛋白酶可包括延伸(extension),如與這些參比序列相比,例如SEQIDNO:2,即在其N-末端和/或C-末端。這些延伸的氨基酸，如果有的話，如本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】中通常的進(jìn)行編號，即對于C-末端延伸:189、190、191等，而對于N-末端延伸-1、-2、-3等。[0163]對于與參比序列，例如SEQIDN0:2進(jìn)行比對排列的每種蛋白酶中的氨基酸殘基，如上述解釋的(用于確定同一性程度的目的)，可能直接且明確地在參比序列，例如SEQIDNO:2中將氨基酸殘基分配給其所對應(yīng)的。相對應(yīng)的殘基通過參照例如SEQIDNO:2，被分配相同的位點(diǎn)或編號。[0164]對于另一種蛋白酶中的每個氨基酸殘基，可以發(fā)現(xiàn)參比序列，例如SEQIDN0:2的對應(yīng)位點(diǎn)，如下:[0165]其他蛋白酶的氨基酸序列記為SEQX。發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于SEQIDNO:2的位點(diǎn)N的位點(diǎn)如下:SEQX如上所述與SEQIDNO:2排列，從排列中，對應(yīng)于SEQIDN0:2的位點(diǎn)N的序列SEQX中的位點(diǎn)可以應(yīng)用下面描述的原理，清楚而明確地導(dǎo)出。[0166]SEQX可為所述蛋白酶的成熟部分，或者它也可以包括信號肽部分，或它可為具有蛋白酶活性的成熟蛋白酶的片段，例如與SEQIDN0:2長度相同的片段和/或它可為當(dāng)與本文所述的SEQIDNO:2排列時從Al延伸到T188的片段。[0167]下面插入三種排列比對，如表1、II和III。所述排列如上所述進(jìn)行制備，將又一種蛋白酶的成熟部分(分別為SEQXUSEQX2和SEQX3)與SEQIDNO:2排列。顯示了每種蛋白酶的大約50個氨基酸殘基。[0168]首先看表1的排列，很清楚，例如SEQIDNO:2的G42對應(yīng)于SEQXl的P42，如這些殘基在排列中互為彼此之上。它們都被分配編號42，即SEQIDN0:2中對應(yīng)的殘基的編號。此排列中顯然，例如，SEQXl不包括10Y，但的確包括38T。[0169]表Ⅰ[0170]ADlICGLAYYMCiGRCSVGFAATNSAGQPGFVTAGHCCTVGTGVTIGNGTCSEQIDNO:2ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNASCQPCFVTAGHCCTVGTPVSIGNCQGSEQIl1020304050[0171]表1I和表1II是在兩個序列的任一個中產(chǎn)生缺口的排列的實(shí)例。[0172]在表1I的排列中，在SEQX2中產(chǎn)生缺口。SEQX2的突出顯示的氨基酸殘基P為了本發(fā)明的目的指定為P28，盡管在SEQX中，同樣的它為P25。[0173]表1I[0174]ADIICGLAYYMGGRCSVGFAATNSAGQPGFVTAGHCCTVGTGVTIGNGTCSEQIDNO;2ADlIGGLAYTMGGRCSVGFAATNA—-PCFVTAGHCCTVGTPVSICNCQCSEQX2[0175]1020304050[0176]在表1II的排列中，在SEQX3中產(chǎn)生缺口。當(dāng)在具有SEQIDNO:2的位點(diǎn)編號nn和(nn+1)的氨基酸之間產(chǎn)生缺口時，缺口的每個位點(diǎn)分配一個小寫字體或下標(biāo)字母:a、b、c等給先前的位點(diǎn)編號，即nn。因此，缺口的每個位點(diǎn)編號為nna、nnb等。SEQX3的突出顯示的氨基酸殘基R，為了本發(fā)明的目的指定為R33a，盡管在SEQX3中，同樣的它為R34。[0177]表1II[0178]ADIIGGLAYYMGGRCSVGFAATNSAGQPGFWA—GHCGTVGTGVTIGNGTGSEQIDNO;2ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNASGQPGFVTA1SGHCGTVGTPVSIGNGQGSEQ131020304050[0179]在本發(fā)明的任一個方面的又一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有至少75°C、76°C、77°C、78°C、79°C、80°C、81°C、82°C、83°C、84°C、85°C、86°C、87°C、88°C、89°C、90°C、91°〇、921:、931:、941:或至少951:的解鏈溫度(Tm)，如通過差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行測定。[0180]DSC在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液，pH7.0中進(jìn)行測定。[0181]掃描速率是恒定的，例如1.50C/分鐘。[0182]掃描間隔可為20_100°C。[0183]!^沒有上限，然而，目前預(yù)期的Tm可低于150°C、145°C、140°C、135°C、13(TC、125°C、12(TC、115t:、ll(rC、105t:或低于100。。。[0184]在替換的實(shí)施方案中，選擇另一種緩沖液用于掃描，例如pH5.0,5.5,6.0或pH6.5的緩沖液。[0185]在又一個替換的實(shí)施方案中，可以采用更快或更慢的掃描速率，例如更慢的掃描速率1.4°C/min、1.3°C/min、1.2°C/min、1.1°C/min、1.0°C/min或0.9°C/min。[0186]有關(guān)掃描步驟的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參照實(shí)施例2。[0187]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶相比，顯示出修正的溫度活性曲線(amendedtemperatureactivityprofile)。例如，本發(fā)明的蛋白酶可在pH9和80°C顯示至少0.40，優(yōu)選至少0.45,0.50,0.55,0.60,0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90或至少0.95的相對活性，術(shù)語“相對”指所述蛋白酶測定的最高活性。對于蛋白酶22、L2a蛋白酶以及對于源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235的蛋白酶，所述的活性是相對于被設(shè)為1.000(100%)的80°C的活性，而對于蛋白酶8和源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，70°C的活性被設(shè)為1.000(100%)，參見實(shí)施例2、7、8和9。作為另外的實(shí)施例，本發(fā)明的蛋白酶在pH9和90°C顯示至少0.10，優(yōu)選至少0.15,0.20,0.25,0.30或至少0.35的相對活性。在具體的實(shí)施方案中，所述的蛋白酶活性采用實(shí)施例2的ProtazymeAKassay進(jìn)行測定。[0188]篩選有關(guān)本發(fā)明的SEQIDN0s:2、8、10或12的熱穩(wěn)定性的蛋白酶可如下進(jìn)行:用引物例如SEQIDNOs:3或4的任一個，或優(yōu)選地用SEQIDNOs:1、7、9或11中任一個的成熟肽編碼部分篩選DNA文庫；在合適的菌株，例如芽孢桿菌(Bacillus)或大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)雜交的克隆。在下一步中，優(yōu)選`在微-純化過程中(參見例如W003/037914)，純化與SEQIDN0s:2、8、10和/或12的任一個相關(guān)的表達(dá)的蛋白酶，并通過應(yīng)用以所述酶的強(qiáng)抑制物的活性位點(diǎn)滴定(AST)的熟知的原理，確定每個選擇物的活性蛋白酶的量。在后續(xù)步驟中，然后將已知量的所述酶在所需的高溫，例如85°C溫育所需的時間，例如2小時；并確定殘余的蛋白酶活性，例如通過應(yīng)用本文中描述的任一種蛋白酶實(shí)驗，例如實(shí)施例2的ProtazymeAKassay。所述步驟的主要部分可為自動化的，并如果需要在機(jī)器人(robot)的幫助下進(jìn)行。確認(rèn)熱穩(wěn)定性例如通過純化蛋白酶，和通過如在本文的實(shí)驗部分描述的DSC確定^來完成。[0189]本發(fā)明也涉及本發(fā)明的多肽用作動物飼料。[0190]兩個氨基酸序列之間的同一性程度，也可通過Clustal方法(Higgins，1989，CAB10S5:151-153)應(yīng)用LASERGENE?MEGALIGN?軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下的多重排列參數(shù)進(jìn)行確定:缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對排列參數(shù)為Ktuple=I,缺口罰分=3,窗口(window)=5和對角線(diagnal)=5。兩個核苷酸序列之間的同一性程度可應(yīng)用同樣的算法和上述的軟件包，以如下的設(shè)置進(jìn)行確定:缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對排列參數(shù)為Ktuple=3，缺口罰分=3，窗口=20。[0191]在具體的實(shí)施方案中，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸I至188或SEQIDNO:2的氨基酸-166至188，或者SEQIDNO:8的氨基酸I至196或SEQIDNO:8的氨基酸-192至196的差異[0192](i)不超過75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、62、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或不超過20個氨基酸；[0193](ii)不超過20、19、18、17、16、15、14、13、12或不超過11個氨基酸；[0194](iii)不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過I個氨基酸；[0195](iv)10或為9個,或為8個,或為7個,或為6個,或為5個氨基酸；或[0196](V)4，或為3個，或為2個氨基酸，或為I個氨基酸。[0197]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括SEQIDNOs:2、8、10或12中任一個成熟肽部分的氨基酸序列，或其等位基因的變體；或其具有蛋白酶活性的片段。[0198]在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNOs:2、8、10或12中任一個的成熟肽部分，或其等位基因的變體；或其具有蛋白酶活性的片段組成。[0199]SEQIDN0s:2、8、10或12的任一個的成熟肽部分的片段，是具有一個或多個氨基酸的多肽，所述氨基酸是從這些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除的。在一個實(shí)施方案中，片段含有至少75個氨基酸殘基，或至少100個氨基酸殘基，或至少125個氨基酸殘基，或至少150個氨基酸殘基，或至少160個氨基酸殘基，或至少165個氨基酸殘基，或至少170個氨基酸殘基，或至少175個氨基酸殘基。[0200]等位基因變體表示占據(jù)相同染色體位點(diǎn)(chromosomallocus)的基因的任何兩種或多種替換形式。等位基因變`異通過突變自然地出現(xiàn)，并可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽中沒有變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是通過基因的等位基因變體編碼的多肽。[0201]本發(fā)明也涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，其由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低，或低，或中，或中-高，或高，或非常高的嚴(yán)緊性條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針在同樣條件下與(a)SEQIDNO:1的核苷酸499-1062、SEQIDN0:7的核苷酸577-1164、SEQIDN0:9的核苷酸586-1152和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065；(b)(a)的子序列，或(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbor,NewYork)。在一個具體的實(shí)施方案中,所述的核酸探針選自上述(a)、(b)或(C)的核酸序列。(a)的核苷酸對應(yīng)于成熟肽編碼部分。[0202](a)中提及的核苷酸的子序列可為至少100個核苷酸，或在另一個實(shí)施方案中至少200個核苷酸。而且，所述的子序列可編碼具有蛋白酶活性的多肽片段。[0203]上述(a)或(b)的核酸序列，以及相對應(yīng)的SEQIDN0s:2、8、10或12的成熟的氨基酸序列或其部分，可用于根據(jù)本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】中熟知的方法，設(shè)計核酸探針以鑒定和克隆DNA，所述DNA編碼來自不同屬或種的菌株的具有蛋白酶活性的多肽。具體地，上述探針可用于與目標(biāo)屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟，以在其中鑒定并分離對應(yīng)的基因。上述探針可顯著地短于全長，但其長度應(yīng)該至少為15個，優(yōu)選至少25個并更優(yōu)選至少35個核苷酸。較長的探針也可以應(yīng)用。DNA探針和RNA探針都可以采用。所述探針通常被標(biāo)記用于檢測對應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。上述探針包含在本發(fā)明之內(nèi)。[0204]因此，由上述其他生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫可用于篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并編碼具有蛋白酶活性的多肽。來自上述其他生物體的基因組DNA或其他DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離方法進(jìn)行分離。來自所述文庫的DNA或所述分離的DNA可被轉(zhuǎn)移到并固定在硝化纖維素(nitrocellulose)或其他合適的載體(carrier)材料上。為了鑒定與SEQIDNOs:1、7、9或11或其子序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用于Southern印跡。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，雜交顯示出，所述的核酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊性條件下，與標(biāo)記的對應(yīng)于(a)、(b)或(C)的序列的上述核酸探針雜交。在這些條件下所述核酸探針雜交的分子應(yīng)用X-光膠片(X-rayfilm)檢測。[0205]在具體的實(shí)施方案中，所述的核酸探針是核酸序列，其編碼SEQIDN0:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸I至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188，或其子序列。在另一個實(shí)施方案中，所述的核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸499-1062，SEQIDNO:7的核苷酸577-1164，SEQIDN0:9的核苷酸586-1152和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065(成熟多肽編碼區(qū))。[0206]對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴(yán)緊性條件定義為在42°C，在5XSSPE，0.3%SDS，200μg/ml剪切的(sheared)和變性的(denatured)鮭精DNA中，及對于非常低和低嚴(yán)緊性25%的甲酰胺，對于中和中-高嚴(yán)緊性35%的甲酰胺，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性50%的甲酰胺,進(jìn)行預(yù)雜交(prehybridization)和雜交,然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟。[0207]對于長度至少100個核苷酸的長探針，所述的載體材料最終用0.2XSSC，0.2%SDS，20%甲酰胺，優(yōu)選至少在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在650C(高嚴(yán)緊性)，并最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴(yán)緊性)洗滌三次，每次15分鐘。[0208]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴(yán)緊性條件定義為在比用Bolton和McCarthy計算(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的T111低5°C至10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClρΗ7.6，6mMEDTA,0.5%NP-40,1X登哈特溶液(Denhardt'ssolution),ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM憐酸二氫鉀(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗漆,然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟。[0209]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在低于計算的Tm5°C至10°C洗滌兩次，每次15分鐘。[0210]本發(fā)明也涉及多肽的變體，所述多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸I至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188的氨基酸序列，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸。[0211]變體多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸I至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188的差異，為一個或多個氨基酸殘基的插入或缺失和/或用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基。在具體的實(shí)施方案中，氨基酸改變較少是天然的，其為保守的氨基酸取代，所述氨基酸取代不顯著地影響蛋白的折疊和/或蛋白的活性；小缺失，通常為I個至大約30個氨基酸；小氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸(methionine)殘基；多至大約20-25個殘基的小肽；或小延伸，其通過改變凈電荷或其他功能，如聚-組氨酸域(poly-histidinetract)、抗原的抗原決定部位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)來促進(jìn)純化。[0212]保守取代的實(shí)例在堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳香氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)之內(nèi)。因此，例如，本發(fā)明涉及多肽，其具有或包括如在SEQIDN0s:2、8、10或12中任一個的成熟肽部分中所列出的序列，其中保守的氨基酸取代包括，在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)中，在酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)中，在極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)中、在疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)中，在芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中，和在小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)中，或其任何組合或其活性片段中用一個替換為另一個。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本【
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】內(nèi)所公知的，并例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979在TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最通常出現(xiàn)的變化是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及將它們反過來。[0213]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和本發(fā)明應(yīng)用的多肽是酸-穩(wěn)定性的。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，術(shù)語酸-穩(wěn)定性的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0和37°C溫育2小時之后的殘余活性為至少50%，與在pH9.0和5°C溫育2小時的對應(yīng)的樣品的殘余活性相比。在具體的實(shí)施方案中，所述的殘余活性至少為60%、70%、80%或至少90%。確定酸-穩(wěn)定性的合適的實(shí)驗方法是實(shí)施例2的pH-穩(wěn)定性實(shí)驗方法。[0214]在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和本發(fā)明應(yīng)用的多肽在pH7.0具有至少0.10,0.15,0.20,0.25,0.30或至少0.35的相對活性。實(shí)施例2的pH-曲線實(shí)驗用于上述測定。`[0215]在又一種具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和本發(fā)明應(yīng)用的多肽I)在60°C和pH9具有至少0.05,0.10,0.15或至少0.19的相對活性；和/或ii)在70°C具有至少0.40,0.50或至少0.60的相對活性。實(shí)施例2的溫度-曲線實(shí)驗用于這些測定。[0216]本發(fā)明的多肽和本發(fā)明應(yīng)用的多肽可為細(xì)菌的和真菌的多肽。所述真菌的多肽可源自絲狀真菌或來自酵母。[0217]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽為i)細(xì)菌的蛋白酶；ii)放線菌門(phylumActinobacteria)的蛋白酶；iii)放線菌綱的(classActinobacteria)；iv)放線菌目的(orderActinomycetales);v)Nocardiopsaceae科的；vi)Nocardiopsis;和/或蛋白酶，其源自vii)擬諾卡氏菌屬菌種，諸如Nocardiopsisalba>Nocardiopsisalkaliphila、Nocardiopsisantarctica、Nocardiopsisprasina、Nocardiopsiscomposta、Nocardiopsisexhalans、Nocardiopsishalophila、Nocardiopsishalotolerans、Nocardiopsiskunsanensis、Nocardiopsislister1、Nocardiopsislucentensis、Nocardiopsismetallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsistrehalos1、Nocardiopsistropica、Nocardiopsisumidischolae、Nocardiopsisxinjiangensis或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌，例如達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235、擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424,或NocardiopsisalbaDSM15647;如SEQIDNOs:2、8、10和12中任一個成熟氨基酸序列的多肽。在具體的實(shí)施方案中，所述的蛋白酶源自Nocardiopsisalba、Nocardiopsisantartica或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌。[0218]上述分類法的根據(jù)是在Bergey'sManualofSystematicBacteriology,2001,secondedition,volumel,DavidR.Bone,RichardW.Castenholz中的章節(jié)，G.M.Garrity和J.G.Holt的手冊路線圖(TheroadmaptotheManual)。[0219]當(dāng)然，對應(yīng)上述提到的菌種，本發(fā)明包括了完全狀態(tài)(perfectstate)和不完全狀態(tài)(imperfectstate),和其他分類學(xué)的相等物,例如無性型(anamorphs),而不考慮它們公知的種名。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地辨別適當(dāng)?shù)南嗟任锏耐恍浴0220]這些菌種的菌株在若干菌種保藏中心容易地被公眾獲得，所述菌種保藏中心如美國菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM),CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)和AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)0[0221]此外，上述多肽可由其他來源鑒定和獲得，所述其他來源包括從自然(例如土壤、堆肥(compost)、水等)中應(yīng)用上述的探針分離到的微生物。從天然生境(naturalhabitat)分離微生物的方法是本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】熟知的。然后所述的核酸序列可類似地通過篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA獲得。一旦用所述的探針檢測到編碼多肽的核酸序列，所述的序列可通過應(yīng)用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見前文)。[0222]如本文定義的，“分離的”多肽是基本不含有其他多肽的多肽，例如，至少大約20%純度，優(yōu)選至少大約40%純度，更優(yōu)選大約60%純度，還更優(yōu)選大約80%純度，最優(yōu)選大約90%純度，和還最優(yōu)選大約95%純度，如通過SDS-PAGE測定的。[0223]由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽也包括融合的多肽(fusedpolypeptide)或可切割的(cleavable)融合多肽，其中另一種多肽融合于多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)進(jìn)行融合而產(chǎn)生。產(chǎn)生融合多肽的方法是本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】所公知的，例如PCR或連接編碼所述多肽的編碼序列，所以它們在框(frame)內(nèi)，而且融合多肽的表達(dá)受到同樣的啟動子和終止子的控制。[0224]在又一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明排除一種或幾種蛋白酶，其源自(i)達(dá)松維爾擬諾卡氏菌NRRL18133，它已經(jīng)在W088/03947中公開；(ii)擬諾卡氏菌屬菌種菌株0PC-210(FERMP-10508)，它已經(jīng)在JP2-255081-A中公開；(iii)菌種達(dá)松維爾擬諾卡氏菌的菌株ZMET43647，它已經(jīng)在DD20043218中公開；(iv)擬諾卡氏菌屬菌種T0A-1(FERM-P-18676)，它已經(jīng)在JP2003284571中公開；和/或(V)相對應(yīng)的DNA。[0225]核酸序列[0226]本發(fā)明也涉及分離的核酸序列，其編碼本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的具體的核酸序列為SEQIDNO:1的核苷酸499-1062、SEQIDNO:7的核苷酸577-1164、SEQIDNO:9的核苷酸586-1152和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065;分別對應(yīng)于SEQIDN0s:2、8、10和12的成熟多肽編碼區(qū)域。本發(fā)明也包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQIDNOs:2,8、10和12中任一個的成熟肽部分的氨基酸序列，但所述的核酸序列分別與SEQIDN0s:U7、9和11的對應(yīng)部分通過遺傳密碼簡并性(degeneracy)的優(yōu)點(diǎn)相區(qū)別。本發(fā)明也涉及SEQIDN0s:l、7、9和11的子序列，其分別編碼具有蛋白酶活性的SEQIDN0s:2、8、10和12的片段。[0227]SEQIDNOs:1、7、9和11的子序列，是分別被SEQIDNOs:1、7、9和11包含的核酸序列，除了來自5'和/或3'末端的一個或多個核苷酸已經(jīng)被缺失。優(yōu)選地，子序列包含至少225個核苷酸，更優(yōu)選至少300個核苷酸，還更優(yōu)選至少375、450、500、531、600、700、800,900或1000個核苷酸。[0228]本發(fā)明也涉及核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸499-1062、SEQIDNO:7的核苷酸577-1164、SEQIDNO:9的核苷酸586-1152和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065具有至少60%的同一'丨生程度。在具體的實(shí)施方案中，與這些核苷酸中任一個的同一,注程度為至少62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。[0229]本發(fā)明也涉及突變體核酸序列，其在SEQIDNOs:1、7、9或11中任一個的成熟肽編碼部分包括至少一個突變，其中所述的突變體核酸序列編碼多肽，所述多肽(i)分別由SEQIDN0s:2、8、10和12中任一個的成熟肽部分組成，或(ii)是任何⑴的序列的變體，其中所述的變體包括一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，或(iii)是任何(i)的序列的等位基因變體，或(iv)是任何⑴的序列的片段。[0230]用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的方法是本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的，并包括從基因組DNA分離、從cDNA制備或`其組合。從上述基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列可例如，通過應(yīng)用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)(PCR)或抗體篩選表達(dá)文庫(antibodyscreeningofexpressionlibraries)以應(yīng)用共享的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)檢測克隆的DNA片段實(shí)施。參見，例如Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以應(yīng)用其他核酸擴(kuò)增方法，諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligasechainreaction)(LCR)、連接的活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription)(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleicacid-basedamplification)(NASBA)。可從Nocardiopsis或另一種或相關(guān)的生物體的菌株克隆所述的核酸序列，而由此，例如，所述的核酸序列可為所述核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或菌種變體。[0231]如本文應(yīng)用的術(shù)語“分離的核酸序列”指基本上無其他核酸序列的核酸序列，例如，至少大約20%純度,優(yōu)選至少大約40%純度，更優(yōu)選大約60%純度,還更優(yōu)選大約80%純度，最優(yōu)選大約90%純度，如通過瓊脂糖電泳測定的。例如，分離的核酸序列可以通過用于基因工程的標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法獲得，以重新定位(relocate)所述的核酸序列，從其天然的位點(diǎn)移至不同的位點(diǎn)而得到復(fù)制。所述的克隆方法可包括切除和分離所需的核酸片段，所述核酸片段包括編碼所述多肽的核酸序列，將所述片段插入載體分子，和將重組的載體整合入宿主細(xì)胞，其中所述核酸序列的多個拷貝或多個克隆將得到復(fù)制。所述核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的來源，或其任意組合。[0232]修飾編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列，可為合成基本類似于所述多肽的多肽所必需的。術(shù)語“基本類似”(substantiallysimilar)于所述的多肽指所述多肽的非-天然存在的形式。這些多肽可以以一些工程的方法與從其天然來源分離的多肽相區(qū)別，例如，在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH、變應(yīng)原性等不同的變體。所述的變體序列可在核酸序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建，所述的核酸序列如SEQID勵8:1、7、9和/或11的多肽編碼部分所顯示的，例如其子序列，和/或通過導(dǎo)入核苷酸取代，所述的核苷酸取代不產(chǎn)生由所述核酸序列編碼的多肽的另一個氨基酸序列，但其對應(yīng)于用于產(chǎn)生所述蛋白酶的宿主生物體的密碼子使用，或通過導(dǎo)入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代。對于核苷酸取代的一般性描述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification〗:95-107。低-變應(yīng)原性的多妝可例如，如上所述進(jìn)行制備。[0233]明顯地，對于那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員，上述取代可以在分子功能的關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行，并仍產(chǎn)生活性的多肽。可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，諸如定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)或丙氨酸-掃描突變(alanine-scanningmutagenesis),鑒定多肽的活性所必需的氨基酸殘基，所述的氨基酸殘基由本發(fā)明的分離的核酸序列編碼，并由此優(yōu)選不經(jīng)過取代(參見，例如，Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)。在后面的方法中，在分子每一個帶正電荷的殘基中引入突變，并測定得到的突變體分子的蛋白酶活性，以鑒定對于分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。[0234]底物-蛋白酶相互作用的位點(diǎn)也可以通過分析三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，如通過諸如核磁共振分析(nuclearmagneticresonanceanalysis)、結(jié)晶學(xué)(crystallography)>或光親和標(biāo)記(photoaffinitylabelling)的方法進(jìn)行測定(參見，例如，deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，JournalofMolecularBiology224:899-904;Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLetters309:59-64)。[0235]本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸序列，其在非常低的嚴(yán)緊性條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊性條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊性條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊性條件，還更優(yōu)選高嚴(yán)緊性條件，并最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊性條件下與核酸探針雜交，所述的核酸探針在同樣的條件下與所述核酸序列，優(yōu)選SEQIDN0s:l、7、9或11中任一個的成熟肽編碼部分，或它們的互補(bǔ)鏈；或其等位基因變體和其子序列雜交(Sambrook等，1989，見前文)，如本文所定義的。[0236]本發(fā)明也涉及分離的核酸序列，其通過(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高的嚴(yán)緊性條件下將DNA與⑴SEQIDNO:1的核苷酸499-1062、SEQIDN0:7的核苷酸577-1164,SEQIDN0:9的核苷酸586-1152和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065，(ii)⑴的子序列，或(iii)⑴或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離所述的核酸序列產(chǎn)生。所述的子序列優(yōu)選為至少100個核苷酸的序列，如編碼具有蛋白酶活性的多肽片段的序列。[0237]產(chǎn)生突變體核酸序列的方法[0238]本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生突變體核酸序列的方法，其包括將至少一個突變引入SEQIDN0s:l、7、9或11中任一個的成熟多肽編碼序列，或其子序列，其中所述的突變體核酸序列編碼多肽，所述多肽分別由SEQIDN0s:2、8、10或12中的任一個的成熟肽，或其具有蛋白酶活性的片段構(gòu)成。[0239]將突變引入所述核酸序列以用一個核苷酸交換另一個核苷酸，可以通過定點(diǎn)突變，應(yīng)用任何本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)。尤其有用的是應(yīng)用超螺旋的(supercoiled)雙鏈的DNA載體及目標(biāo)插入體，和兩個含有所需突變的合成引物的方法。所述的寡核苷酸引物，每一個與所述載體的相反鏈互補(bǔ)，在溫度循環(huán)的過程中通過PfuDNA聚合酶延伸。在引物結(jié)合的過程中，產(chǎn)生含有交錯切口(staggerednick)的突變的質(zhì)粒。溫度循環(huán)之后，將所述產(chǎn)物用對甲基化的和半甲基化的DNA有特異性的DpnI處理，以消化親代DNA模板，并選擇含有突變的合成的DNA。也可以應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的其他方法。[0240]核酸構(gòu)建體[0241]本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的本發(fā)明的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主細(xì)胞中，在與控制序列相適合的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)可理解為包括任何與產(chǎn)生多肽有關(guān)的步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾(posttranscriptionalmodification)、番羽譯、番羽譯后修飾(post-translationalmodification)和分泌。[0242]“核酸構(gòu)建體”在本文中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然產(chǎn)生的基因，或其已被修飾以含有以自然中不存在的方式組合的和并列的核酸的區(qū)段。當(dāng)所述的核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的所有控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)盒是同義的。術(shù)語“編碼序列”在本文中定義為核酸序列，其直接地指明其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebindingsite)(原核生物)或由恰位于mRNA的5’末端的開放閱讀框的上游的ATG起始密碼子(真核生物)和恰位于mRNA的3’末端的開放閱讀框的下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列進(jìn)行確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組的核酸序列。[0243]編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸序列，可以以各種方式操作以提供所述多肽的表達(dá)。將所述核酸序列插入載體之前的操作可為需要的或必須的，這取決于表達(dá)載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的方法在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】中是眾所周知的。[0244]術(shù)語“控制序列”在本文中定義為，包括所有對于表達(dá)本發(fā)明的多肽來說必需的或有利的成分。每個控制序列對于編碼所述多肽的核酸序列可為天然的或外源的。上述控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列(leader)`、聚腺苷酸化序列(polyadenylationsequence)、前肽(propeptidesequence)、啟動`子(promoter)、信號肽序列(signalpeptidesequence)和轉(zhuǎn)錄終止子(transcriptionterminator)。最低限度,所述的控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄信號和轉(zhuǎn)錄終止信號。所述的控制序列可與接頭一起提供，用于引入具體的限制酶切位點(diǎn)(restrictionsites)以便于將所述的控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接。術(shù)語“可操作地連接”在本文中定義為一種構(gòu)造(configuration),其中控制序列適合地位于相對于DNA序列的編碼序列的位點(diǎn)，以使所述的控制序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。[0245]所述的控制序列可為適當(dāng)?shù)膯幼有蛄校幢槐磉_(dá)所述核酸序列的宿主序列識別的核酸序列。所述啟動子序列包含轉(zhuǎn)錄控制序列(transcriptionalcontrolsequences),其介導(dǎo)所述多肽的表達(dá)。所述啟動子可為任意核酸序列，其在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，包括突變體啟動子(mutant)、被截短的啟動子(truncated)和雜合體啟動子(hybridpromoter),所述啟動子可從編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)與所述宿主細(xì)胞同源或異源的多妝的基因中獲得。[0246]指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的實(shí)例，是從大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂水解酶(agarase)基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因(sacB)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)α_淀粉酶(a-amylase)基因(amyL)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶(penicillinase)基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β_內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)得到的啟動子。其他的啟動子在ScientificAmerican,1980，242:74-94的"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"中和在Sambrook等，1989，見前文中描述。[0247]指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的實(shí)例，是從米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶(asparticproteinase)、黑曲霉(Aspergillusniger)中性ct_淀粉酶(neutrala-amylase)、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶(acidstablea-amylase)、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glucoamylase)(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶(lipase)、米曲霉堿性蛋白酶(alkalineproteinase)、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酉先胺酶(acetamidase)和尖鍵抱(Fusariumoxysporum)膜蛋白酶-樣蛋白酶(trypsin-likeproteinase)(W096/00787)，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的啟動子的雜合體)的基因中得到的啟動子，及其突變體啟動子、被截短的啟動子和雜合體啟動子。[0248]在酵母宿主中，有用的啟動子從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(enolase)(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(galactokinase)(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)/3-憐酸甘油醒脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)(ADH2/GAP)和釀酒酵母3_憐酸甘油酸酷激酶(3-phosphoglyceratekinase)的基因中得到。酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動子通過Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。[0249]所述的控制序列也可為合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止序列可操作地與編碼所述多肽的核酸序列的3’末端連接。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的終止子可用于本發(fā)明。[0250]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸鹽合成酶(anthranilatesynthase)、黑曲霉α-葡萄糖苷酶(ct-glucosidase)和尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶的基因中得到。[0251]優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞的終止子從釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(cytochromeC)(CYCl)和釀酒酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因中得到。酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子通過Romanos等，1992，見前文描述。[0252]優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞，如芽孢桿菌宿主細(xì)胞的終止子，是來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)或解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的終止子。[0253]所述控制序列也可為合適的前導(dǎo)序列(leadersequence),即mRNA的不翻譯的區(qū)域，其對于由宿主細(xì)胞的翻譯是重要的。所述的前導(dǎo)序列可操作地與編碼所述多肽的核酸序列的5’末端連接。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。[0254]優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因中得到。[0255]合適的酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列從釀酒酵母烯醇酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/3-磷酸甘油醛脫氫酶(ADH2/GAP)的基因中得到。[0256]所述的控制序列以可為聚腺苷酸化序列，即可操作地與所述核酸序列的3’末端連接的序列，而且當(dāng)它被轉(zhuǎn)錄時，它被宿主細(xì)胞識別為一個信號以將聚腺苷酸殘基添加在轉(zhuǎn)錄的mRNA上。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。[0257]優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸鹽合成酶、尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因中得到。[0258]酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化序列通過Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiologyl5:5983-5990描述。[0259]所述的控制序列也可為信號肽編碼區(qū)域，其編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，并指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑(secretorypathway)。所述核酸序列的編碼序列的5'末端可天然地包含信號肽編碼區(qū)，所述信號肽編碼區(qū)天然地在翻譯閱讀框中與編碼分泌的多肽的編碼區(qū)的部分連接。可替換地，編碼序列的5'末端可包含信號肽編碼區(qū)，其對于所述的編碼序列是外源的。所述外源的信號肽編碼區(qū)可為必需的，其中所述編碼序列天然地不含信號肽編碼區(qū)。可`替換地，所述外源的信號肽編碼區(qū)可簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)所述多肽的分泌。然而，任何指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑可用于本發(fā)明。[0260]細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)為從芽孢桿菌NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、解淀粉芽孢桿菌ct-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因中得到的信號肽編碼區(qū)。另外的信號肽通過Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。[0261]絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)為從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicolainsolens纖維素酶和Humicolalanuginosa脂肪酶的基因中得到的信號肽編碼區(qū)。[0262]酵母宿主細(xì)胞的有用的信號肽從釀酒酵母α-因子(a-factor)和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(invertase)的基因中得到。其他有用的信號肽編碼區(qū)通過Romanos等，1992，見前文描述。[0263]所述控制序列也可為前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。得到的多肽被稱為前酶(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或有些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并可通過將多肽從前多肽上催化的或自催化的(autocatalytic)切割，轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。所述多肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE),枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT),釀酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(Iaccase)(W095/33836)的基因中得到。[0264]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述前肽編碼區(qū)為編碼SEQIDN0:2的氨基酸-166至-1的SEQIDNO:1的核苷酸1-498、編碼SEQIDNO:8的氨基酸-165至-1的SEQIDN0:7的核苷酸82-576、編碼SEQIDNO:10的氨基酸-166至-1的SEQIDNO:9的核苷酸88-585和編碼SEQIDNO:12的氨基酸-167至-1的SEQIDNO:11的核苷酸1-501。[0265]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號肽編碼區(qū)為編碼SEQIDNO:8的氨基酸I至29的SEQIDNO:7的核苷酸1-81，或編碼SEQIDNO:10的氨基酸1-29的SEQIDNO:9的核苷酸1-87。[0266]信號肽區(qū)和前肽區(qū)出現(xiàn)在多肽的氨基末端，所述前肽區(qū)緊接著位于多肽的氨基末端，而所述信號肽區(qū)緊接著位于前肽區(qū)的氨基末端。[0267]也需要添加調(diào)控序列，其允許調(diào)控相對于所述宿主細(xì)胞的生長的多肽的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是那些響應(yīng)化學(xué)的或物理的刺激物(stimulus)，包括調(diào)控化合物的存在，使所述基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac，tac和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可采用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子可用作調(diào)控序列。其他調(diào)控序列的實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的調(diào)控系統(tǒng)。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控系統(tǒng)包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase)基因，其在甲氨喋呤(methotrexate)存在的條件下被擴(kuò)增，和金屬硫蛋白(metallothionein)基因,其以重金屬擴(kuò)增。在這些情況中，編碼所述多肽的核酸序列可操作地與所述調(diào)控序列連接。[0268]表達(dá)載體`[0269]本發(fā)明也涉及重組表達(dá)載體，包括本發(fā)明的核酸序列、啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。可將上述的多種核酸和控制序列結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可包括一種或多種方便的限制酶切位點(diǎn)，以允許在這些位點(diǎn)上插入或取代編碼所述多肽的核酸序列。可替換地，本發(fā)明的核酸序列可以通過將所述核酸序列或包含所述序列的核酸構(gòu)建體插入適于表達(dá)的載體中進(jìn)行表達(dá)。在創(chuàng)建所述表達(dá)載體的過程中，使所述編碼序列位于所述載體中，這樣一來，所述的編碼序列可操作地與適于表達(dá)的控制序列連接。[0270]所述的重組表達(dá)載體可為任意載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其可以方便地經(jīng)過重組DNA方法，并可使所述核酸序列表達(dá)。所述載體的選擇通常依賴于所述載體與被導(dǎo)入所述載體的宿主細(xì)胞的相容性(compatibility)。所述載體可為線狀的質(zhì)粒或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。[0271]所述載體可為自發(fā)復(fù)制的(autonomouslyreplicating)載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外的元件(element)、極微染色體(minichromosome)或人造染色體。所述質(zhì)粒可包含確保自我復(fù)制(self-replication)的任何方法(means)。可替換地,所述載體可為當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時它被整合入基因組，并與被整合入所述載體的染色體一起復(fù)制。此外，可以采用單一的載體或質(zhì)粒或一起含有待導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組的總DNA的兩種或多種載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子(transposon)。[0272]本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一種或多種可選擇的標(biāo)記，其允許容易地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。可選擇的標(biāo)記為基因，該基因的產(chǎn)物可提供給殺蟲劑(biocide)或病毒抗性(viralresistance)、抗重金屬(resistancetoheavymetals)、營養(yǎng)缺陷型的原營養(yǎng)(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌的可選擇的標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因。酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中應(yīng)用的可選擇的標(biāo)記包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酸基轉(zhuǎn)移酶(ornithinecarbamoyltransferase))、bar(勝絲菌素乙酸基轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase))、hygB(潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase))、niaD(硝酸鹽還原酶(nitratereductase))、PyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶(orotidine-5,-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶(sulfateadenyltransferase))、trpC(鄰氨基苯甲酸鹽合成酶)，以及其相等物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0273]本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，所述元件允許將所述載體穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組，或在所述細(xì)胞中不依賴于基因組自發(fā)地復(fù)制所述載體。[0274]為了整合入所述宿主細(xì)胞基因組，所述載體可依賴于編碼多肽的核酸序列或通過同源的或非同源的重組將所述載體穩(wěn)定地整合入基因組中的任何其他元件。可替換地，所述的載體可包含附加的核酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞的基因組。所述附加的核酸序列使所述載體在染色體的準(zhǔn)確位置整合入宿主細(xì)胞基因組。為了提高在準(zhǔn)確位置進(jìn)行整合的可能性，所述的整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至1，500個堿基對，優(yōu)選400至1，500個堿基對并最優(yōu)選800至1，500個堿基對，所述的核酸與對應(yīng)的靶序列高度同源以增強(qiáng)同源重組的可能性。所述的整合元件可為與所述宿主細(xì)胞的基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，所述的整合元件可為非-編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，所述載體可通過非-同源重組整合如所述宿主細(xì)胞的基因組中。[0275]為了自發(fā)復(fù)制，所述載體可進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)(originofreplication),它能夠使所述質(zhì)粒在所述的宿主細(xì)胞中自發(fā)的復(fù)制。細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例為允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒PUB110、pE194、pTA1060、和pAMf31的復(fù)制起點(diǎn)。在酵母宿主細(xì)胞中應(yīng)用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例為2微米(micron)復(fù)制起點(diǎn)，ARSl、ARS4、ARSl和CEN3的組合、和ARS4和CEN6的組合。所述的復(fù)制起點(diǎn)可為具有突變的復(fù)制起點(diǎn)，所述突變使其在所述宿主細(xì)胞中具有溫度-敏感性的功能(參見，例如，Ehrlich,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)?[0276]超過一個拷貝的本發(fā)明的核酸序列可被插入宿主細(xì)胞以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。通過將所述序列的至少一個附加的拷貝整合如宿主細(xì)胞基因組，或者通過將可擴(kuò)增的可選擇的標(biāo)記基因包含于所述的核酸序列中，其中細(xì)胞含有可選擇的標(biāo)記基因的擴(kuò)增的拷貝，并由此所述核酸序列的附加的拷貝可以通過在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑存在的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞來選擇，所述核酸序列的拷貝數(shù)可以得到增加。[0277]用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見前文)。[0278]所述的蛋白酶也可與至少一種其他用于動物飼料的目標(biāo)酶一起共-表達(dá)，所述的目標(biāo)酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.-.-)、磷酯酶A1(EC3.1.1.32)、磷酯酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷酯酶C(3.1.4.3)、磷酯酶D(EC3.1.4.4)和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4*EC3.2.1.6)。[0279]所述的酶可為由不同的載體、由一種載體或應(yīng)用兩種方法的結(jié)合進(jìn)行共-表達(dá)。當(dāng)應(yīng)用不同載體時，所述載體可具有不同的可選擇的標(biāo)記和不同的復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)只應(yīng)用一種載體時，所述基因可以從一個或多個啟動子表達(dá)。如果在一個啟動子(雙-或多-順反子的)的調(diào)控下克隆，克隆的基因的順序可影響蛋白的表達(dá)水平。所述蛋白酶也可表達(dá)為融合蛋白，即編碼所述蛋白酶的基因已經(jīng)被融合到編碼另一個蛋白的基因的框架內(nèi)。此蛋白可為另一種酶或來自另一種酶的功能域(functionaldomain)。[0280]宿主細(xì)胞[0281]本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其方便地應(yīng)用于所述多肽的重組產(chǎn)生。包含本發(fā)明的核酸序列的載體被引入宿主細(xì)胞,所以所述載體作為染色體的組成部分，或作為自我-復(fù)制的染色體外的載體保持，如較早所述的。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何親代細(xì)胞的后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親代細(xì)胞不相同。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上依賴于編碼所述多肽的基因及其來源。[0282]所述宿主細(xì)胞可為單細(xì)胞的微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞的微生物，例如真核生物。[0283]有用的單細(xì)胞的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于，[0284]芽孢桿菌細(xì)胞，或鏈霉菌細(xì)胞，或乳酸細(xì)菌的細(xì)胞；或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌和假單胞菌。所述的乳酸細(xì)菌包括，但不限于，乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)的菌種。[0285]將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可，例如，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Moleculargeneralgeneticsl68:ΙΙΙ-ΙΙδ),應(yīng)用感受態(tài)細(xì)胞(competentcells)(參見，例如，Young和Spizizin,1961，JournalofBacteriology81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209-221),電穿孔(electroporation)(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(conjugation)(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,JournalofBacteriologyl69:5771-5278)進(jìn)行。[0286]宿主細(xì)胞可為真核的，如非-人動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。[0287]在一個具體的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。本文中應(yīng)用的“真菌”包括子囊菌門(phylaAscomycota),擔(dān)子菌門(Basidiomycota),壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等在AinsworthandBisby;sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，見前文，pagel71所引用的)和所有有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等，1995，見前文)。[0288]在另一個具體的實(shí)施方案中，所述真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文中應(yīng)用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可變化，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，將酵母定義為如在BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所描述的。[0289]酵母宿主細(xì)胞可為念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細(xì)胞。[0290]真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括所有絲狀形式的真菌和卵菌亞門(如由Hawksworth等，1995，見前文所定義的)。所述的絲狀真菌以由甲殼質(zhì)(chitin)、纖維素、葡聚糖(glucan)、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖(mannan)和其他復(fù)合多糖類(complexpolysaccharides)組成的菌絲體壁(mycelialwall)為特征。通過菌絲延長(hyphalelongation)進(jìn)行營養(yǎng)生長(vegetativegrowth),而碳分解代謝(carboncatabolism)是專性需氧的(obligatelyaerobic)。與此相反,酵母,諸如釀酒酵母的營養(yǎng)生長則是通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行的，而碳分解代謝是可為發(fā)酵的(fermentative)。[0291]絲狀真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例為，但不限于，枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、梭抱殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)的菌種的細(xì)胞。[0292]真菌細(xì)胞可通過包括形成原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和細(xì)胞壁再生的方法，以其公知的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。[0293]轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適的方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適的方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可應(yīng)用由Becker和Guarente在AbelsonJ.N.和Simon,M.1.，editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-l87,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163和Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。[0294]產(chǎn)生方法[0295]本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)菌株，其野生型能夠產(chǎn)生所述的多肽；和(b)回收所述的多肽。優(yōu)選地，所述菌株是Nocardiopsis屬，更優(yōu)選達(dá)松維爾擬諾卡氏菌、Nocardiopsisalba或Nocardiopsisantarctica,更優(yōu)選達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種。[0296]本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述的多肽。[0297]本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包括突變體核酸序列，其包括SEQIDN0:1的核苷酸499-1062，SEQIDNO:7的核苷酸577-1164，SEQIDN0:9的核苷酸586-1152，和/或SEQIDNO:11的核苷酸502-1065中至少一個突變，其中所述突變體核酸序列編碼多肽，其(i)由SEQIDNO:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸I至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188，或(ii)為⑴的任何序列的變體，其中所述的變體包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸，或(iii)為(i)的任何序列的等位基因變體，或(iv)為(i)的任何序列的片段。[0298]在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，所述細(xì)胞在適于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，用本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的方法培養(yǎng)。例如，所述細(xì)胞可通過搖瓶培養(yǎng)、小-規(guī)模或大-規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、批式的、補(bǔ)料分批的或固態(tài)的發(fā)酵)，在實(shí)驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中，在合適的培養(yǎng)基中和允許所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述的培養(yǎng)采用本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的方法，在合適的包含碳源、氮源和無機(jī)鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)者得到，或桿菌發(fā)表的組合物(例如，在AmericanTypeCultureCollection的目錄中)進(jìn)行制備。如果所述多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述多肽可直接從培養(yǎng)基中回收，如果所述多肽不分泌，那么它可以從細(xì)胞裂解物(celllysate)中回收。[0299]所述多肽可采用本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的、對所述多肽具有特異性的方法進(jìn)行檢測。這些檢測方法可包括應(yīng)用特異性抗體、產(chǎn)物形成或底物消失。例如，蛋白酶分析可用于測定所述多肽的活性，如本文所述。[0300]得到的多肽可以通過本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的方法進(jìn)行回收。例如，所述多肽可以通過常規(guī)的方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括，但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。[0301]本發(fā)明的多肽可通過本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的各種方法進(jìn)行純化，所述方法包括，但不限于色譜法(例如，離子交換、親和、疏水、色譜焦聚和大小排阻)、電泳的方法(例如，制備等電聚焦(preparativeisoelectricfocusing))、溶解性差異(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(extraction)(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPubl`ishers,NewYork,1989)。[0302]植物[0303]本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因的植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼具有本發(fā)明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化，以表達(dá)和以可回收的量產(chǎn)生所述多肽。所述多肽可從植物或植物部分中回收。可替換地，可應(yīng)用所述的包含重組多肽的植物或植物部分以提高食物(food)或飼料(feed)的質(zhì)量,例如，提高營養(yǎng)價值(nutritionalvalue)、適口性(palatability)和流變學(xué)的(rheological)性質(zhì),或破壞反營養(yǎng)性的因子(antinutritivefactor)。[0304]在具體的實(shí)施方案中，將所述的多肽祀向種子中的胚乳忙藏液泡(endospermstoragevacuoles)。這可通過將其作為一個合適的信號肽的前體合成而得到，參見Horvath等在PNAS,Feb.15，2000，vol.97，n0.4，p.1914-1919。[0305]轉(zhuǎn)基因的植物可為雙子葉的(dicotyledonous)(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)或其工程的變體。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis;和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、黑小麥(triticale)(小麥(Tricicum)和黑麥(黑麥屬(Secale))的穩(wěn)定雜交體和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如向日葵(sunflower)(向日葵屬(Helianthus)),棉花(棉屬(Gossypium))羽扇豆(lupins),馬鈴薯,糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。低-肌醇六磷酸鹽(Low-phytate)植物,例如在美國專利n0.5,689,054和美國專利n0.6，111，168中描述的，是工程植物的實(shí)例。[0306]植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leave)、根(root)、果實(shí)(fruits)、種子(seed)和根莖(tuber),以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissues)、分生組織(meristems)。而且具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments),如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。[0307]同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚胎(embryos)、胚乳(endosperms)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。上述植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。[0308]表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞，可以依照本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的方法構(gòu)建。簡言之，所述植物或植物細(xì)胞通過將一個或多個編碼本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體整合入植物宿主基因組，并在轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞中，增殖得到的改良的植物或植物細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建。[0309]方便地，所述的表達(dá)構(gòu)建體是核酸構(gòu)建體，其包括編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地與在優(yōu)先選擇的植物或植物部分中表達(dá)所述核酸序列所必需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列相連接。此外，所述的表達(dá)構(gòu)建體可包含可選擇的標(biāo)記，其用于鑒別已經(jīng)整合入表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，和將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所需的DNA序列(后者依賴于所采用的DNA導(dǎo)入方法)。[0310]調(diào)控序列，如啟動子和終止子序列及任選的信號序列或轉(zhuǎn)運(yùn)(transit)序列的選擇，例如，在需要所述多肽何時、何地和怎樣表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行確定，例如，表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的基因可為組成型的(constitutive)或誘導(dǎo)的(inducible),或可為發(fā)育特異性的、階段特異性的或組織特異性的，而基因產(chǎn)物可靶向具體的組織或植物部分，如種子或葉。調(diào)控序列為，例如，由Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所描述的。[0311]對于組成型表達(dá)，可以應(yīng)用下面的啟動子:35S_CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294)、玉米泛素(maizeubiquitin)I(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation)、或稻肌動蛋白(riceactin)I啟動子(PlantM0.Biol.18,675-689.；ZhangW,McElroyD.和WuR1991,AnalysisofriceActl5'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特異性的啟動子可為，例如，來自忙藏庫組織(storagesinktissue),如種子、馬鈴薯根莖和果實(shí)的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissues)，如分生組織(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性的啟動子，諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)啟動子、醇溶蛋白(prolamin)啟動子、球蛋白(globulin)啟動子或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，Plant和CellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和香豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708-711)、來自種子油體蛋白(bodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，Plant和CellPhysiology39:935-941)，來自Brassicanapus的藏蛋白apA啟動子，或本【
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】公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或馬鈴薯的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiologyl02:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺票呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular和generalgenetics248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588).同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源應(yīng)用的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)、赤霉酸(gibberellicacid)和/或重金屬。[0312]啟動子增強(qiáng)子元件也可用于在所述植物中實(shí)現(xiàn)所述蛋白酶的更高表達(dá)。例如，所述啟動子增強(qiáng)子元件可為內(nèi)含子(intron)，其被置于啟動子和編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列之間。例如，Xu等，1993，見前文公開了稻肌動蛋白I基因的第一個內(nèi)含子增強(qiáng)表達(dá)的應(yīng)用。[0313]更進(jìn)一步，可優(yōu)化植物種的密碼子應(yīng)用以改善表達(dá)(參見前面提到的Horvath坐、`寸/O[0314]可選擇的標(biāo)記基因和所述表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分，可選自本【
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】中可得到的那些。[0315]所述的核酸構(gòu)建體，根據(jù)本【
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】公知的常規(guī)技術(shù)，整合入植物基因組，包括土壤桿菌(Agrobacterium)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊(particlebombardment)、生物射彈轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989,Nature338:274)。[0316]目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)先選擇的方法(為了考察，參見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiologyl9:15-38),而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法通常是優(yōu)選的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)先選擇(以補(bǔ)充土壤桿菌方法)的方法，是用粒子(涂有轉(zhuǎn)化DNA的微觀的金或鶴粒子)轟擊胚胎愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚芽(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等,1992,Bio/TechnologylO:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可替換的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-428中所描述的。[0317]轉(zhuǎn)化之后，篩選具有整合入其中的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并將其根據(jù)本【
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】中熟知的方法在全植物中再生。[0318]本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞，其包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下具有本發(fā)明的蛋白酶活性；和(b)回收所述的多肽。[0319]動物[0320]本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因的非-人動物和產(chǎn)物或其成分，其實(shí)例為體液，如乳液和血液，器官，肉和動物細(xì)胞。表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，例如在哺乳動物細(xì)胞中，是本【
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】中公知的，參見例如thehandbookProteinExpression:APracticalApproach,Higgins和Hames(編)，OxfordUniversityPress(1999),和此系列中與基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯后加工有關(guān)的其他三本手冊。一般而言，為了制備轉(zhuǎn)基因的動物，用編碼具有本發(fā)明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列，轉(zhuǎn)化選擇的動物的選擇的細(xì)胞，以表達(dá)和產(chǎn)生所述的多肽。所述的多肽可從所述的動物，例如從雌性動物的乳液中回收，或可表達(dá)所述的多肽以有益于動物本身，例如幫助動物消耗。動物的實(shí)例在下面標(biāo)題為動物飼料的部分中提及。[0321]產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的動物的目的在于從該動物的乳液中回收所述的蛋白酶，可將編碼所述蛋白酶的基因插入所述動物的受精卵中，例如通過利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其包括合適的乳蛋白啟動子和編碼所述蛋白酶的基因。將所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體顯微注射乳受精卵，并優(yōu)選永久地整合乳染色體。一旦所述的卵開始生長和分裂，就將可能的胚胎植入代孕母體(surrogatemother)中，并鑒定攜帶所述轉(zhuǎn)基因的動物。然后將得到的動物通過常規(guī)的飼養(yǎng)進(jìn)行繁殖。所述多肽可從所述動物的乳液中純化，參見例如Meade，H.Μ.等(1999):Expressionofrecombinantproteinsinthemilkoftransgenicanimals,geneexpressionsystems:Usingnaturefortheartofexpression.J.M.Fernandez和J.P.Hoeffler(編)，AcademicPress。[0322]在替換方案中，為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非-人動物，在其體細(xì)胞和/或生殖細(xì)胞中，攜帶含有異源的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的核酸序列，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包括編碼所述蛋白酶的轉(zhuǎn)基因，所述的轉(zhuǎn)基因可操作地與所述蛋白酶的唾液腺(salivarygland)特異性表達(dá)的第一個調(diào)控序列相連接，如在W000/064247中公開的。[0323]組合物[0324]在又一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。[0325]所述的多肽組合物可以根據(jù)本【
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】公知的方法制備，并可為液體組合物或者干燥的組合物的形式。例如，所述的多肽組合物可為顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。包含在所述組合物中的多肽可依據(jù)本【
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】公知的方法穩(wěn)定。[0326]本發(fā)明的多肽或多肽組合物的優(yōu)選的用途在下面給出實(shí)施例。[0327]動物飼料[0328]本發(fā)明也著眼于本發(fā)明的多肽在動物飼料中應(yīng)用的方法，以及包含本發(fā)明的多肽的飼料組合物和飼料添加劑。[0329]術(shù)語動物包括所有的動物,包括人。動物的實(shí)例為非-反芻動物(non-ruminant)和反芻動物(ruminant)。反芻動物包括,例如,動物諸如綿羊、山羊、馬和牛,例如肉牛(beefcattle)、奶牛和小牛犢(youngcalves)。在具體的實(shí)施方案中，所述動物是非-反芻動物。非-反芻動物包括單胃的(monogastric)動物,例如豬(pig)或豬(swine)(包括,但不限于小豬(piglet)、成長的豬(growingpig)和母豬(sow));家禽，諸如火雞(turkey)、鴨(duck)和小雞(chicken)(包括但不限于肉雞(broilerchick)、蛋雞(layers))；youngcalves;和魚(包括但不限于鮭魚(salmon)、蹲魚(trout)、羅非魚(tilapia),魚(catfish)和鯉魚(carp);和甲殼類動物(crustacean)(包括但不限于奸(shrimp)和對蟲下(prawn))。[0330]術(shù)語飼料或飼料組合物指適于或旨在被動物攝取的任何化合物、制劑、混合物或組合物。[0331]在本發(fā)明的應(yīng)用中，所述的蛋白酶可以在飲食之前、之后或與飲食同時喂給所述的動物，后者是優(yōu)選的。[0332]在具體的實(shí)施方案中，所述的蛋白酶，其加入所述飼料的形式或何時包含入飼料添加劑，是適當(dāng)限定的(well-defined)。適當(dāng)限定的指所述的蛋白酶制劑至少50%的純度，如通過大小排阻色譜測定的(參見WO01/58275的實(shí)施例12)。在其他具體的實(shí)施方案中，所述的蛋白酶制劑至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純度，如通過此方法測定的。[0333]適當(dāng)限定的蛋白酶制劑是有利的。例如，更容易正確地配制(dose)以將基本無其他蛋白酶干擾或污染的蛋白酶作為飼料供給。術(shù)語正確地配制具體指獲得一致的(consistent)和不變的(constant)產(chǎn)物的目的,和根據(jù)所需的效果優(yōu)化劑量的能力。[0334]然而，對于在動物飼料中的應(yīng)用，所述的蛋白酶并不需要那么純；它可以例如包括其他酶，在這樣的情況下它可被稱為蛋白酶制劑。`[0335]所述的蛋白酶制劑可以(a)直接加入所述的飼料(或直接用于蛋白質(zhì)的處理過程)，或(b)它可被用于產(chǎn)生一種或多種中間體組合物(intermediatecomposition),如飼料添加劑或被隨后加入所述飼料(或用于處理過程)的預(yù)混合物。上述的純度(Thedegreeofpurity)指初始的蛋白酶制劑純度，無論根據(jù)上面的(a)還是(b)進(jìn)行應(yīng)用。[0336]尤其是應(yīng)用重組產(chǎn)生方法，可得到具有此數(shù)量級純度的蛋白酶制劑，然而并不容易得到，而且當(dāng)所述的蛋白酶通過傳統(tǒng)發(fā)酵方法產(chǎn)生時，也遭受到更大的批與批間的變化。[0337]上述蛋白酶制劑當(dāng)然可與其他酶混合。[0338]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明應(yīng)用的蛋白酶能夠溶解蛋白質(zhì)。檢測溶解的蛋白質(zhì)的合適的實(shí)驗在實(shí)施例3中公開。[0339]所述蛋白可為動物蛋白，如肉和骨粉，和/或魚粉；或者它可為植物蛋白。[0340]本文中應(yīng)用的術(shù)語植物蛋白指包含至少一種蛋白的任何化合物、組合物、制劑或混合物，所述蛋白源自或起源于含有變性蛋白(modifiedprotein)和蛋白衍生物(protein-derivative)的植物。在具體的實(shí)施方案中，所述植物蛋白的蛋白含量為至少10、20、30、40、50或60%(w/w)。[0341]植物蛋白可源自植物蛋白來源，如豆類和谷類，例如來自豆科(familiesFabaceae)(?科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、黎科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料,諸如大豆粉(soybeanmeal),羽扇豆粉(lupinmeal)和油菜桿粉(rapeseedmeal)。[0342]在具體的實(shí)施方案中，所述的植物蛋白來源是來自豆科的一種或多種植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆(bean)。[0343]在另一個具體的實(shí)施方案中，所述的植物蛋白來源是來自藜科的一種或多種植物的材料，例如甜菜(beet)、糖甜菜(sugarbeet)、菠菜(spinach)或昆諾阿藜(quinoa)。[0344]植物蛋白來源的其他實(shí)例為油菜籽、向日葵子(sunflowerseed)、棉籽(cottonseed)和甘藍(lán)(cabbage)。[0345]大豆是優(yōu)選的植物蛋白來源。[0346]植物蛋白來源的其他實(shí)例為谷類，如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、稻、小麥屬植物(triticale)和高粱。[0347]根據(jù)本發(fā)明，用至少一種本發(fā)明的蛋白酶處理蛋白質(zhì)導(dǎo)致蛋白的溶解性增加。[0348]下面為在單胃體外模型(monogastricinvitromodel)中應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶得到的％溶解蛋白的實(shí)例:至少102%、103%、104%、105%、106%或至少107%，相對于空白。溶解的蛋白的百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用實(shí)施例3和/或?qū)嵤├?0的單胃體外模型確定。術(shù)語蛋白質(zhì)的增溶溶解(solubilisation)基本上指將蛋白質(zhì)帶入溶液。上述增溶溶解可由蛋白酶-介導(dǎo)的蛋白從常見復(fù)合物天然組合物，如飼料的其他成分中釋放而引起。[0349]在又一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明應(yīng)用的蛋白酶能夠增加可消化的(digestible)蛋白質(zhì)的量。下面為在單胃體外模型中應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶得到的％已消化的或可消化的蛋白的實(shí)例:至少104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%或至少116%，相對于空白。已消化的或可消化的蛋白的百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用實(shí)施例3和/或?qū)嵤├?0的體外模型確定。[0350]下面為在溶液培養(yǎng)體外模型(aquacultureinvitromodel)中，應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶得到的％已消化的或可消化的蛋白的實(shí)例:至少103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%或至少110%，相對于空白。已消化的或可消化的蛋白的百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用實(shí)施例4的溶液培養(yǎng)體外模型確定。[0351]在又一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明應(yīng)用的蛋白酶能夠增加蛋白質(zhì)的水解程度(theDegreeofHydrolysis)(DH)。下面為在單胃體外模型中應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶得到水解程度增加的實(shí)例:至少102%、103%、104%、105%、106%或至少107%，相對于空白。所述的DH應(yīng)用實(shí)施例3的單胃體外模型確定。下面為在溶液培養(yǎng)體外模型中，應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶得到水解程度增加的實(shí)例:至少102%、103%、104%、105%、106%或至少107%，相對于空白。所述的DH應(yīng)用實(shí)施例4的溶液培養(yǎng)體外模型確定。[0352]在本發(fā)明的(預(yù)_)處理方法的具體的實(shí)施方案中，所述蛋白酶影響(或作用于，或發(fā)揮其溶解效應(yīng)(solubilisinginfluence)于)蛋白或蛋白來源。為了實(shí)現(xiàn)它，所述蛋白或蛋白來源通常懸浮于溶劑，例如水的溶劑，如水，并根據(jù)所述的酶的特性調(diào)節(jié)PH和溫度值。例如，所述的處理可在PH-值進(jìn)行，在所述的pH值，實(shí)際的蛋白酶的活性為至少40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。同樣地，例如，所述的處理可在溫度進(jìn)行，在所述的溫度，實(shí)際的蛋白酶的活性為至少40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。上述的百分比活性指標(biāo)與最大活性相關(guān)。所述的酶反應(yīng)持續(xù)直到得到需要的結(jié)果，然后可以或不可以通過使所述的酶失活，例如通過熱-處理步驟終止所述的酶反應(yīng)。[0353]在本發(fā)明的處理方法的又一個具體的實(shí)施方案中，所述的蛋白酶作用得到保持，它的意思是，例如將所述的蛋白酶加入所述蛋白或蛋白來源，但其溶解效應(yīng)可以說直到后來需要的時候才出現(xiàn)，一旦建立合適的溶解條件，或一旦任何酶抑制物失活，或諸如此類，可以應(yīng)用其他方法延遲所述的酶的作用。[0354]在一個實(shí)施方案中，所述的處理是動物飼料或用于動物飼料的蛋白質(zhì)的預(yù)-處理。[0355]術(shù)語改善動物飼料的營養(yǎng)值，是指改善所述蛋白質(zhì)的可用性和/或可消化性，由此導(dǎo)致從飲食成分中提取蛋白增加，蛋白產(chǎn)量(yield)更高，蛋白降解增加和/或蛋白用途改善。所述飼料的營養(yǎng)值由此增加，而且動物性能(animalperformance),諸如所述動物的生長速率(growthrate)和/或增重(weightgain)和/或飼料轉(zhuǎn)化率(feedconversionratio)(即消化的飼料的重量與增重之比)得到改善。[0356]在具體的實(shí)施方案中，所述的飼料轉(zhuǎn)化率增長至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或至少10%。在又一個具體的實(shí)施方案中，增重增加至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或至少11%。這些數(shù)字相對于不加入蛋白酶的對照實(shí)驗。[0357]所述的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)和增重可以如在EEC(1986):DirectivedeIaCommissiondu9avril1986fixantlamethodedecalculdelavaleurenergetiquedesalimentscomposesdestines?lavolaille.JournalOfficieldesCommunautesEuropeennesjL130，53-54中所描述的進(jìn)行計算。[0358]所述的蛋白酶可以以任何形式，或作為相對純的蛋白酶，或與意欲加入動物飼料的其他成分相混合，即以動物飼料添加劑，如所謂的動物飼料的預(yù)混物的形式，加入所述的飼料中。[0359]在又一方面，本發(fā)明涉及用于動物飼料的組合物，諸如動物飼料和動物飼料添加劑，例如預(yù)混物。[0360]除了本發(fā)明的蛋白酶之外，本發(fā)明的動物飼料添加劑含有至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物。所述的飼料添加劑也可包含至少一種常量的(macro)礦物。[0361]其他的、可選擇的飼料添加劑成份為著色劑(colouringagent),例如類葫蘿卜素(carotenoids)諸如β_胡蘿卜素、奸青素(astaxanthin)和葉黃素(lutein);芳香族化合物(aromacompounds);穩(wěn)定劑(stabiliser);抗微生物月太(antimicrobialpeptides);聚不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids);活性氧產(chǎn)生物(reactiveoxygengeneratingspecies);和/或至少一種其他的酶，所述其他的酶選自α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.、磷脂酶Al(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC3.1.4.4)、淀粉酶，例如，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。[0362]在具體的實(shí)施方案中，這些其他的酶是適當(dāng)限定的(在前面對于蛋白酶制劑所限定的)。[0363]抗微生物肽(AMP's)的實(shí)例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、內(nèi)源性抗微生物多肽(Protegrin)-1、Thanatin、防衛(wèi)素(Defensin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer,2000)、Plectasins和他汀類(Statins)，其包括在WO03/044049和WO03/048148中公開的化合物和多肽，以及上述保持抗微生物活性的變體或片段。[0364]抗真菌多肽(AFP's)的實(shí)例是巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)肽和黑曲霉肽peptides，以及其保持抗真菌活性的變體和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中所公開的。[0365]聚不飽和脂肪酸的實(shí)例是C18、C20和C22聚不飽和脂肪酸，如花生四烯酸(arachidonicacid)、二十二碳六稀酸(docosohexaenoicacid)、二十碳五稀酸(eicosapentaenoicacid)和Y-亞油酸(gamma-1inoleicacid)。[0366]活性氧產(chǎn)生物是化學(xué)品，諸如過硼酸鹽(perborate)、過硫酸鹽(persulphate)、或過碳酸鹽；和酶諸如氧化酶(oxidase)、加氧酶(oxygenase)或合成酶(syntethase)。[0367]通常地，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物，形成意欲加入到所述的飼料中的所謂的預(yù)混物的一部分，然而，常量礦物通常單獨(dú)地加入所述的飼料。富含本發(fā)明的蛋白酶的預(yù)混物是本發(fā)明的動物飼料添加劑的實(shí)例。[0368]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑，以0.01至10.0%;更具體為0.05至5.0%;或0.2至1.0%(%表示g添加劑每100g飼料)的水平預(yù)期包含(或規(guī)定為必須包含)在動物飲食或飼料中。尤其對于預(yù)混物來說是這樣的。[0369]下面是這些成分的實(shí)例的非-排他性(non-exclusive)的列表:[0370]脂溶性維生素的實(shí)例為維生素A、維生素D3、維生素E,和維生素K,例如維生素K3。`[0371]水溶性維生素的實(shí)例為維生素B12、生物素(biotin)和膽堿(choline)、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸(niacin)、葉酸(folicacid)和泛酸鹽(pantothenate),例如Ca-D-泛酸鹽。[0372]痕量礦物的實(shí)例為錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。[0373]常量礦物的實(shí)例為鈣、磷和鈉。[0374]這些成分的營養(yǎng)需求(以家禽和小豬/豬進(jìn)行例示)列表于WO01/58275的表A中。營養(yǎng)需求指這些成分應(yīng)該以指定的濃度在所述的飲食中提供。[0375]在替換方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑包括WO01/58275的表A中的指明的獨(dú)立成分的至少一種。至少一種是指一種，或兩種，或三種，或四種等等直至所有十三種，或直至所有十五種獨(dú)立成分中的任何一種或多種。更具體地，此至少一種獨(dú)立成分，以提供給料濃度(in-feed-concentration)的含量,包含在本發(fā)明的添加劑中，所述的給料濃度在表A的第四列，或第五列，或第六列中顯示的范圍之內(nèi)。[0376]本發(fā)明也涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或食物(diet)具有相對高含量的蛋白。可以表征家禽和豬的食物，如在WO01/58275的表B，第2-3列中所顯示的。可以表征魚食，如此表B的第4列中所顯示的。此外，這樣的魚食通常具有200-310g/kg的粗脂肪(crudefat)含量。W001/58275對應(yīng)于US09/779334，其在此并入以作為參考。[0377]本發(fā)明的動物飼料組合物具有50_800g/kg的粗蛋白含量,并進(jìn)一步包含至少一種蛋白酶，如本文要求的。[0378]而且，或在(上面顯示的粗蛋白含量的)替換方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量的含量；和/或0.l-200g/kg的鈣含量；和/或0.l_200g/kg的可利用磷(availablephosphorus)的含量；和/或0.Ι-lOOg/kg的甲硫氨酸的含量；和/或0.l-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸的含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸的含量。[0379]在具體的實(shí)施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量，在WOO1/58275(R.2-5)的表B中范圍2、3、4或5中的任一個之內(nèi)。[0380]將氮(N)乘以因子6.25計算粗蛋白，即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)X6.25。所述氮含量由Kjeldahl方法(A.0.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)石角定。[0381]可代謝能量可根據(jù)NRC出版物Nutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.，pp.2-6和theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,ffageningen.1SBN90-71463-12-5進(jìn)行計算。[0382]鈣、可利用磷和氨基酸在完整動物食物中食用的量，根據(jù)飼料表(feedtable)，諸如Veevoedertabel1997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.1SBN90-72839-13-7進(jìn)行計算。[0383]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含至少一種蛋白或蛋白來源，如上面定義的。它也可通常以0-25%的含量包含動物蛋白，諸如肉和骨粉和/或魚粉。[0384]在又一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含0-80%玉蜀黍；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%魚粉；和/或0-25%肉和骨粉；和/或0-20%乳清(whey)。[0385]動物食物可，例如作為糊狀物飼料(非顆粒狀的(nonpelleted))或顆粒狀飼料(pelletedfeed)產(chǎn)生。通常，將磨碎了的飼料材料混合，并根據(jù)所述物種的說明書添加足夠量的基本的維生素和礦物。酶可以作為固體或液體的酶劑型(enzymeformulations)添加。例如，固體酶劑型通常在混合步驟之前或其過程中加入；而液體酶制劑通常在造粒步驟之后加入。所述的酶也可被整合到飼料添加劑或預(yù)混物中。[0386]食物中的終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白每kg食物的范圍之內(nèi)，例如在0.5_25mg酶蛋白每kg動物食物的范圍內(nèi)。[0387]所述的蛋白酶當(dāng)然應(yīng)該以有效量應(yīng)用，即足夠改善溶解性和/或改善飼料的營養(yǎng)值的量。目前可以預(yù)期，所述的酶以下列含量(劑量范圍)的一種或多種給予:0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50;或0.10-10—所有這些范圍的單位是mg蛋白酶酶蛋白每kg飼料(ppm)。[0388]為了確定mg酶蛋白每kg飼料,從所述的飼料組合物中純化所述的蛋白酶，并用相關(guān)的分析方法測定純化的蛋白酶的比活性(參見蛋白酶活性、底物和分析方法)。所述飼料組合物的蛋白酶活性同樣也應(yīng)用相同的分析方法進(jìn)行測定，并基于這兩種測定計算mg酶蛋白每kg飼料的劑量。[0389]在飼料添加劑中確定mg酶蛋白每kg飼料應(yīng)用同樣的原理。當(dāng)然，如果可以得到用于制備所述飼料添加劑活所述飼料的蛋白酶的樣品，就可以從這個樣品(不需要從所述飼料組合物或所述的添加劑中純化所述的蛋白酶)測定比活性。[0390]洗漆劑組合物(detergentcomposition)[0391]可加入本發(fā)明的蛋白酶，其因此成為洗滌劑組合物的成分。[0392]本發(fā)明的洗滌劑組合物，可被配制為手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，其包括適于預(yù)-處理弄臟的纖維織物的洗衣添加劑組合物，和漂洗加入的織物柔軟劑組合物，或被配制為洗滌劑組合物，用于一般的家庭硬面的清潔操作，或被配制用于手洗或機(jī)洗碗碟的操作。[0393]在具體的方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的蛋白酶的洗滌劑添加劑。所述的洗滌劑添加劑，以及所述的洗滌劑組合物可包括一種或多種其他的酶，如另一種蛋白酶，如來自芽孢桿菌的堿性蛋白酶、脂肪酶、cutinase、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶(pectinase)、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶,例如，漆酶和/或過氧化物酶。[0394]通常，所選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)該與所選擇的洗滌劑相適應(yīng)，(即最適pH，與其他的酶成份和非-酶成份等相適應(yīng)，而且所述的酶應(yīng)以有效量存在。[0395]合適的脂肪酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來自腐質(zhì)霉屬(異名嗜熱霉屬)的脂肪酶，例如來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，如在EP258068和EP305216中所描述的，或來自H.1nsolens，如在W096/13580中所描述的；假單胞菌脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)喊假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GBI,372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌菌株SD705(W095/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(W096/12012);芽抱桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽抱桿菌(Dartois等(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(W091/16422)。其他實(shí)例為蛋白酶變體如那些在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所描述的。優(yōu)選的商業(yè)可得到的脂肪酶包括Lipolase?和LipolaseUltra?(NovozymesA/S)。合適的淀粉酶(0-和/或0_)包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。蛋白酶包括，例如，從芽孢桿菌得到的α-淀粉酶，例如地衣芽孢桿菌的具體菌株，在GB1，296，839中詳述。有用的淀粉酶的實(shí)例為在WO94/02597、WO94/18314、WO95/26397、W096/23873、WO97/43424、WO00/60060和WO01/66712中描述的變體，尤其是在一個或多個如下位點(diǎn)具有取代的變體:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上可得到的淀粉酶是Natalase?、SupramyI?、Stainzyme?、DuramyI?、TermamyI?、FungamyI?和BAN?(NovozymesA/S),Rapidase?和Purastar?(來自genencorInternationalInc.)。[0396]合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂抱霉屬的纖維素酶，例如由HumicolainsoIens、Myceliophthorathermophila和尖鍵孢產(chǎn)生的在US4，435，307、US5，648，263、US5，691，178、US5，776，757和WO89/09259中公開的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有顏色養(yǎng)護(hù)(colourcare)益處的堿性或中性的纖維素酶。這樣的纖維素酶的實(shí)例為在EPO495257、EP531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其他實(shí)例為纖維素酶變體，如那些在WO94/07998，EPO531315、US5，457，046、US5，686，593、US5，763，254、WO95/24471、WO98/12307和WO99/01544中所描述的。商業(yè)上可得到的纖維素酶包括Celluzyme?和Carezyme?(NovozymesA/S)，Clazinase?和PuradaxHA?(genencorInternationalInc.)和KAC-500(B)?(KaoCorporation)。[0397]合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。有用的過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬(Coprinus)的過氧化物酶，例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus)及其變體，如那些在WO93/24618,WO95/10602和WO98/15257中所描述的。商業(yè)上可得到的過氧化物酶包括Guardzyme?(Novozymes)。[0398]所述的洗滌劑酶可通過加入含有一種或多種酶的獨(dú)立的添加劑，或通過加入包含所有所述酶的組合的添加劑，包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨(dú)立的添加劑或組合的添加劑，可以配制為，例如顆粒、液體、衆(zhòng)體(slurry)等。優(yōu)選的洗漆劑添加劑配制為顆粒，尤其是非-粉化的(non-dusting)顆粒，液體，尤其是穩(wěn)定的液體，或漿體。[0399]非-粉化的顆粒可以，例如，如在US4，106,991和4,661,452中所公開的進(jìn)行制備，并可以任意地通過本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】公知的方法進(jìn)行包覆(coat)。蠟質(zhì)包覆材料(waxycoatingmaterial)的實(shí)例是具有1000至20000的平均分子量的聚(環(huán)氧乙燒)產(chǎn)品(聚乙二醇(polyethyleneglycol)，PEG);具有16至50個環(huán)氧乙燒單元的乙氧基化的壬基酹(ethoxylatednonylph`enols);乙氧基化的脂肪醇,其中所述的醇包含12至20個碳原子，而且其中有15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇類；脂肪酸；和脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯和甘油三酯。適于以流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包覆材料(film-formingcoatingmaterial)的實(shí)例在GB1483591中給出。液體酶制劑可，例如，根據(jù)已建立的方法，通過添加多元醇(polyol),如丙二醇(propyleneglycol),糖或糖醇(sugaralcohol),乳酸或硼酸(boricacid)穩(wěn)定化。保護(hù)的酶可根據(jù)在EP238216中公開的方法進(jìn)行制備。[0400]本發(fā)明的洗滌劑組合物可為任何方便的形式，例如，條、片、粉、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可為水性的，通常包含多至70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑；或為非-水性的。[0401]所述的洗漆劑組合物包含一種或多種表面活性劑(surfactant),其為非-離子的，包括半-極性的(sem1-polar)和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的(zwitterionic)。所述的表面活性劑通常以0.1%至60%(按重量計算)的水平存在。[0402]當(dāng)在其中包含時，所述的洗滌劑通常包含大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，諸如線狀的烷基苯磺酸鹽(linearalkylbenzenesulfonate)、α-烯烴磺酸鹽(a-olefinsulfonate),烷基硫酸酯(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸酯(fattyalcoholsulfate)),醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)，仲烷基橫酸鹽(secondaryalkanesulfonate),α-橫基脂肪酸甲酯(a-sulfofattyacidmethylester),烷基-或烯基丁二酸(alkenylsuccinicacid)或肥阜。[0403]當(dāng)在其中包含時，所述的洗滌劑通常包含大約0.2%至大約40%的非-離子表面活性劑，諸如醇乙氧基化合物，壬基酹乙氧基化合物(nonylphenolethoxylate),烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside),烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide),乙氧化的脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide),脂肪酸單乙醇酰胺(fattyacidmonoethanolamide),多羥基化的經(jīng)基脂肪酸酸胺(polyhydroxyalkylfattyacidamide),或葡糖胺(glucosamine)(“葡糖酰胺(glucamides)”)的N-酰基N烴基(N-acylN-alkyl)衍生物。[0404]所述的洗漆劑可包含0-65%的洗漆增效助劑(detergentbuilder)或絡(luò)合劑(complexingagent),諸如沸石(zeolite),二磷酸鹽(diphosphate),三磷酸鹽(triphosphate),膦酸鹽(phosphonate),碳酸鹽(carbonate),梓檬酸鹽(citrate),氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid),以二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid),二次乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaaceticacid),烷基-或烯基丁二酸，可溶性的硅酸鹽(silicate)或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS-6)。[0405]所述的洗滌劑可包括一種或多種聚合物。實(shí)例為羧甲基纖維素(carboxymethylcelIulose),聚(乙烯礎(chǔ)咯燒酮)(poly(vinylpyrrolidone)),聚(乙二醇)(poly(ethyleneglycol)),聚(乙烯醇)(poly(vinylalcohol)),聚(乙烯吡唳_N_氧化物)(poly(vinylpyridine-N-oxide)),聚(乙烯咪唑)(poly(vinylimidazole)),[0406]聚羧酸酯(polycarboxylates)，諸如聚丙烯酸酯(polyacrylate)，馬來酸/丙烯酸共聚物(maleic/acrylicacidcopolymer)和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物(laurylmethacrylate/acrylicacidcopolymer)。[0407]所述的洗漆劑可包含漂白裝置(bleachingsystem),所述漂白裝置可包括H2O2源，諸如過硼酸鹽(perborate)或過碳酸鹽(percarbonate)，其可與形成過酸的漂白活化劑(peracid-formingbleachactivator),如四乙酰乙二胺(tetraacetyIethyIenediamine)或壬酉先氧基苯石黃酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)。可替換地，所述漂白裝置可包括例如酰胺類、酰亞胺類或砜類的過氧酸。[0408]本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可應(yīng)用常規(guī)的穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定化，所述的穩(wěn)定劑，例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香族的硼酸酯(aromaticborateester)或苯基硼酸衍生物如4_甲酰苯基(formylphenyl)硼酸,而所述的組合物可例如在WO92/19709和WO92/19708中所描述的進(jìn)行配制。[0409]所述的洗滌劑也可含有其他常規(guī)洗滌劑成分，例如纖維調(diào)節(jié)劑(fabricconditioners)包括粘土(clay),發(fā)泡劑(foambooster),抑泡劑(sudssuppressor),防腐蝕劑(ant1-corrosionagent),懸污劑(soil-suspendingagent),抗污垢再沉積試劑(ant1-soilredepositionagent),染料(dye)，殺菌劑(bactericide),突光增白劑(opticalbrightener),助水溶物(hydrotrope),晦暗抑制劑(tarnishinhibitor)或香料(perfume)。[0410]目前可以預(yù)期，在所述的洗滌劑組合物中，任何酶，尤其是本發(fā)明的酶可以以相應(yīng)于0.01-1OOmg的酶蛋白每升洗漆液(washliquor)的量加入,優(yōu)選0.05_5mg的酶蛋白每升洗滌液，尤其是0.1-1mg的酶蛋白每升洗滌液。[0411]本發(fā)明的酶可附加地并入WO97/07202中公開的洗滌劑配方中。[0412]生物材料的保藏[0413]如下的生物材料已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約在DSMZ(德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),Mascheroderffeglb,D_38124Braunschweig,Germany)進(jìn)行了保藏，并提供了如下的登錄號(accessionnumbers):[0414]保藏物(Deposit)保藏登錄號保藏日期(DateofDeposit)[0415]NocardiopsisalbaDSM156472003年5月30日[0416]擬諾卡氏菌屬菌種DSM164242004年5月24日[0417]這些菌株已在確保在這樣的條件下得到保藏，所述條件為確保在本專利申請在未決(pendency)的過程中，由CommissionerofPatentsandTrademarks所確定的人根據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122有權(quán)得到所述的培養(yǎng)物。所述的保藏物代表被保藏的菌株的基本純的培養(yǎng)物。所述的保藏物在提交這些申請的副本(counterpart)或其后續(xù)文件的國家按照該外國專利法所要求是可以得到的。然而，應(yīng)該理解的是，保藏物的獲得不構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明將侵權(quán)由政府行為所授予的專利權(quán)。[0418]達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235可公開地從DSMZ獲得。它也在如下其他保藏機(jī)構(gòu)保藏:ATCC23219,IMRU1250、NCTC10489。[0419]在此描述并要求的本發(fā)明不受限于在此公開的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因為這些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明的某些方面的說明。任何等同的實(shí)施方案確定地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除去在這里顯示和描述的之外，對本發(fā)明前述的說明書的各種更改，對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的更改也確定地落在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包含定義的本說明書為準(zhǔn)。[0420]在此引用各種參考文獻(xiàn)，其`公開整體地并入作為參考。實(shí)施例[0421]實(shí)施例1:克隆和表達(dá)來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235的蛋白酶[0422]試劑和培養(yǎng)某[0423]【權(quán)利要求】1.分離的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78°c的解鏈溫度(Tm)，如通過差示掃描量熱法(DSC)在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液中，pH7.0，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述多肽選自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的1-188、SEQIDNO:8的1-196,SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一'I"生程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDΝΟ:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸雜交；(c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度；(d)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDN0s:2、8、10或12中任一個的成熟肽的同一性程度為至少大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。(e)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸I至188或者SEQIDNO:8的氨基酸I至196的的差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過I個氨基酸；和/或(f)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸I至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188的氨基酸序列，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸。2.權(quán)利要求1的多`肽，其是擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶,優(yōu)選是源自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種(Nocardiopsisdassonvilleisubsp.dassonvillei)DSM43235的蛋白酶、源自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsissp.)DSM16424的蛋白酶或者是源自NocardiopsisalbaDSM15647的蛋白酶。3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述的氨基酸差異是保守的氨基酸取代。4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、1201\1221?、1250、129￥、1305、13比、135隊147卩、1515、1655、166￥、171￥、1791和/或1861;優(yōu)選10￥、381\825、99六、118隊1201\1221?、1250、129￥、1305、1311^、1655和/或171￥;更優(yōu)選與95P、100V和/或1141中的至少一個一起；和/或與(H35+D61+S143)—起；其中每個位點(diǎn)對應(yīng)于SEQIDNO:2的位點(diǎn)。5.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列在所述的指定位點(diǎn)包含至少一個下列的氨基酸:25S、38T、42P、44S、49Q、54R、62S、89S、91S、92S、95A、99Q、1001、114V、120T、125Q、129Q、131L、135N、147F、151S、165S、166F、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T；優(yōu)選25S、38T、42P、44S、54R、62S、125Q、131L、165S、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T;更優(yōu)選與24A、51V、53E、86A、87T、96I和/或186L中至少一個一起，和/或與(H35+D61+S143)一起；其中每個位點(diǎn)對應(yīng)于SEQIDNO:12的位點(diǎn)。6.分離的核酸序列,包括編碼權(quán)利要求1-5中任一項的多肽的核酸序列。7.分離的核酸序列，包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解鏈溫度(T。)，如通過差示掃描量熱法(DSC)在1OmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液中，PH7.0，應(yīng)用1.5°C/分鐘的恒定掃描速率進(jìn)行測定，其中所述核酸序列(a)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577-1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個雜交；(b)與SEQIDNO:1的499-1062、SEQIDNO:7的577_1164、SEQIDNO:9的586-1152和/或SEQIDNO:11的502-1065的核苷酸中的任一個具有至少60%的同一性程度；(c)編碼多肽，所述多肽與SEQIDNO:2的l-188、SEQIDNO:8的1-196、SEQIDNO:10的1-189和/或SEQIDNO:12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一性程度(d)編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDN0s:2、8、10或12中任一個的成熟肽的同一性程度為至少大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。(e)編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸I至188或者SEQIDNO:8的氨基酸I至196的的差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過I個氨基酸；和/或(f)編碼多肽，所述多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸I至188，SEQIDNO:8的氨基酸1至196，SEQIDNO:10的氨基酸I至189和/或SEQIDNO:12的氨基酸I至188的氨基酸序列，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸。8.核酸構(gòu)建體，包括可操作地與一個或多個控制序列連接的權(quán)利要求6或7的核酸序列，所述的控制序列在合適的表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。9.重組表達(dá)載體，包括權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。10.重組宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求9的載體。11.產(chǎn)生權(quán)利要求1-5中任一項的多肽的方法,所述方法包括:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求10的重組宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。12.轉(zhuǎn)基因的植物，或植物部分，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項的多肽。13.轉(zhuǎn)基因的非-人動物或產(chǎn)品或其成分，能夠表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項的多肽。14.產(chǎn)生權(quán)利要求1-5中任一項的多肽的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)如下菌株中的任一種:(i)達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維爾亞種DSM43235，(ii)擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424，或(iii)NocardiopsisalbaDSM15647;和(b)回收所述的多肽。15.將至少一種權(quán)利要求1-5中任一項定義的多肽應(yīng)用于(i)動物飼料；(ii)制備用于動物飼料的組合物；(iii)改善動物飼料的營養(yǎng)值；Qv)在動物飲食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在動物飲食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白質(zhì)。16.動物飼料添加劑，包括至少一種權(quán)利要求1-5任一項中定義的多肽；和(a)至少一種脂溶性的維生素，和/或(b)至少一種水溶性的維生素，和/或(C)至少一種痕量礦物。17.動物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一種權(quán)利要求1-5任一項中定義的多肽，或至少一種權(quán)利要求13的飼料添加劑。18.權(quán)利要求17的飼料組合物，其為魚飼料。19.一種組合物，包括至少一種權(quán)利要求1-5中任一項定義的多肽，連同至少一種其他的酶，所述其他的酶選自淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶和/或葡聚糖酶。20.至少一種權(quán)利要求1-5中任一項定義的多肽在洗滌劑中的用途。21.擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424。22.NocardiopsisalbaDSM15647。【文檔編號】A23K3/00GK103509776SQ201310342223【公開日】2014年1月15日申請日期:2004年6月21日優(yōu)先權(quán)日:2003年6月19日【發(fā)明者】索倫.F.拉森,卡斯滕.肖霍姆,彼得.R.奧斯特加德,卡斯藤.安德森,莫滕.費(fèi)希爾申請人:諾維信公司