一種重組人內皮抑素融合蛋白及其制備方法和應用與流程

文檔序號：11211030閱讀：1907來源：國知局

本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種重組人內皮抑素融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術：

腫瘤需要功能性的血管網絡提供氧氣、養料并清除代謝產物。腫瘤除了通過與宿主血管融合而獲得部分血管外，還必須通過形成新生血管網構建自己的血管系統，這樣才能持續地生長和發展。如果沒有血管系統提供氧氣和養料，實體瘤的增長不會超過1mm³。實體腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管生成的學說的提出，為腫瘤治療開辟了一個新的途徑。

1997年，哈佛大學o’reilly等發現小鼠血管內皮瘤(eoma)細胞系的培養液能夠抑制血管內皮細胞的增殖。通過分離純化得到一種新的蛋白質，命名為鼠的endostatin，后來翻譯成血管內皮抑制素(簡稱內皮抑素)。內皮抑素是由細胞外基質成分膠原xⅷ的羧基末端水解而來的一種動物體內天然存在的蛋白，是一種內源性血管形成抑制因子，能有效地抑制機體內病理性血管的形成，具有廣譜的抗腫瘤作用。關于人血管內皮抑制素(es)，在臨床研究中發現，down’s綜合癥病人的es表達水平較高，實體瘤發病率很低；癌癥患者血清中es的含量有利于總生存時間的延長。體外研究發現，es特異性地抑制微血管內皮細胞的增殖、遷移、粘附和存活，能有效地抑制雞胚尿囊膜(cam)新生血管的形成，而實驗性動物研究也證實es有顯著的抗腫瘤作用。目前發現es可以和內皮細胞(ecs)表面多個非特異性受體結合，抑制ecs在血管形成中的作用。人血管內皮抑制素同樣具有抑制腫瘤的作用，因此，關于人內皮抑素的研究也越來越多。

中國專利文獻cn1177005a是國際上關于內皮抑素的最早獲得授權的專利之一，其中通過大腸桿菌表達了人內皮抑素基因，是人膠原蛋白十八基因1503-2055表達的蛋白活性片段，184個氨基酸，分子量20kd，與小鼠內皮抑素氨基酸序列有85.33％的同源性，目前已經完成三期臨床研究。我國以大腸桿菌表達系統生產了新型重組人內皮抑素(recombinanthumanendostatin，rh-es，商品名endostar，恩度)，其氨基末端經過基因修飾加上了9個氨基酸序列(mggshhhhh)，形成6個組氨酸標簽，從而簡化了純化工藝，中國食品藥品監督管理局(sfda)在2005年9月批準了恩度聯合np(諾維本+順鉑)方案治療晚期非小細胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，nsclc)的適應癥。但是endostar在使用時仍存在一些缺點，如由于其體內半衰期短，入胞能力差，臨床上的使用劑量較大，增加了患者的經濟和身體負擔。為解決上述問題，中國專利文獻cn105646701a中公開了一種與endostar有13個氨基酸差異的重組內皮抑素蛋白，該重組內皮抑素蛋白更容易進入血管內皮細胞和雞胚絨毛尿囊膜血管內皮細胞，蛋白穿膜效果和n端的結構穩定性都有了顯著提高。雖然改造后的重組內皮抑素其抑制腫瘤細胞生長的效果顯著提高，但重組內皮抑素進入人體后由于不具備器官靶向性，會在體內隨內循環進入各處，導致其組織分布的相對平均，未能在病灶部位形成有效的抗腫瘤濃度，且由于其未能有效地輸送至病變部位會產生擴散降解，因此臨床使用劑量較高和使用周期較長。為了提高重組內皮抑素蛋白的靶向性，目前采用的融合蛋白通常采用人源的單克隆抗體融合到重組內皮抑素蛋白上以提高靶向性，如美國專利文獻us9611313b2中，將人類野生型人內皮抑制素huendo或突變形式的人內皮抑制素(huendo-p125a)融合到人源化抗her2igg3抗體的3'端，產生兩種抗her2人內皮抑素融合蛋白αher2-huendo和her2igg3-huendo-p125a，然而采用人源的單克隆抗體雖然能夠提高靶向性，但是申請人發現人源的單克隆抗體穿膜效果較差，限制了抗her2人內皮抑素融合蛋白的應用。

her2是由原癌基因her2/neu編碼的185kd的跨膜受體，是表皮生長因子(egf)酪氨酸蛋白激酶受體家族的成員。大約26％的乳腺癌出現her2基因的高表達，其過度活化可能與腫瘤的增殖、浸潤和轉移等行為有關，因此her2被認為是乳腺癌檢測和治療的最佳靶點，已經有相應的抗體藥物如曲妥珠單抗和帕妥珠單抗等臨床使用。曲妥珠單抗治療her2陽性乳腺癌療效確切，但即使是her2高表達或基因擴增的患者，有效率也僅為12％～34％。納米抗體(nanobody,nb)是近年來發現的一種新型抗體，即重鏈單域抗體vhh(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)，來源自駱駝體內存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chainantibody,hcab)，克隆其可變區而得到的只由一個重鏈可變區組成的單域抗體，是目前可以得到的具有完整功能的穩定的可結合抗原的最小單位。其相對分子質量為15kd，比單抗小很多，可以有效地穿透濃密的組織，到達傳統抗體無法到達的地方，并且納米抗體迅速通過腎臟系統的過濾排出身體。因此，當納米抗體用放射性或熒光染料標記，可以在給藥后在靶細胞部位產生非常高的對比度，對腫瘤的檢測和靶向治療具有非常重要的臨床價值。但納米抗體單體由于分子量過小，進入人體后穩定性差，作為藥物使用時需要多次服藥以維持藥用濃度；同時納米抗體在保藏以及運輸過程中容易發生降解，不利于長時間保藏與運輸，使納米抗體的使用成本升高，影響了納米抗體作為疾病治療藥物開發中的藥用效果，因此，現有技術中還未提出一種利用納米抗體制備重組人內皮抑素融合蛋白的方案。

技術實現要素：

因此，本發明要解決的第一個技術問題在于克服現有技術中納米抗體單體在進入人體后易分解，保藏時穩定性較低，易隨保藏時間延長而發生降解的缺陷，從而提供一種可以長時間穩定保藏和運輸的her2納米抗體二聚體。

本發明要解決的第二個技術問題在于克服現有技術中的重組人內皮抑素進入人體后由于不具備器官靶向性或靶向性差,未能有效地輸送至病變部位產生擴散降解，從而提供一種可以靶向her2陽性乳腺癌病變部位，并能有效抑制乳腺癌細胞增殖的重組人內皮抑素融合蛋白及其制備方法和應用。

本發明提供了一種her2納米抗體二聚體，所述her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結合肽。

所述的her2納米抗體二聚體，所述連接肽序列如seqidno.4所示，所述her2結合肽序列如seqidno.2所示。

所述的her2納米抗體二聚體，所述her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發明提供了一種編碼上述her2納米抗體二聚體的基因，所述her2納米抗體二聚體的編碼基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發明提供了一種重組人內皮抑素融合蛋白，所述重組人內皮抑素融合蛋白包括上述her2納米抗體二聚體和重組人內皮抑素蛋白。

所述的重組人內皮抑素融合蛋白，所述重組人內皮抑素蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示。

所述的重組人內皮抑素融合蛋白，所述重組人內皮抑素蛋白的編碼基因的核苷酸序列如seqidno.6所示。

所述的重組人內皮抑素融合蛋白，所述her2納米抗體二聚體連接于所述重組人內皮抑素蛋白的n端或c端。

所述的重組人內皮抑素融合蛋白，所述重組人內皮抑素融合蛋白還包括連接her2納米抗體二聚體和所述重組人內皮抑素蛋白的連接肽，所述連接肽序列如seqidno.4所示。

所述的重組人內皮抑素融合蛋白，所述重組人內皮抑素融合蛋白選自如下蛋白：

(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.7所示；

(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，其氨基酸序列如seqidno.8所示；或

(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.9所示。

本發明提供了一種編碼上述重組人內皮抑素融合蛋白的基因，所述編碼基因選自如下基因：

(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.10所示；

(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.11所示；或

(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.12所示。

上述的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)，即表示所述的重組人內皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為her2納米抗體二聚體、重組人內皮抑素蛋白；同理，所述的(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，表示所述的重組人內皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為重組人內皮抑素蛋白、her2納米抗體二聚體；(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)，表示所述的重組人內皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為her2納米抗體二聚體、連接肽和重組人內皮抑素蛋白。

本發明提供了包含上述的her2納米抗體二聚體的編碼基因或上述的重組人內皮抑素融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或轉基因重組菌。

本發明提供了一種重組人內皮抑素融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)構建所述her2納米抗體二聚體的編碼基因和所述重組人內皮抑素融合蛋白的編碼基因；

(2)將步驟(1)中的編碼基因克隆至表達載體中得到重組表達載體；

(3)將步驟(2)中獲得的所述重組表達載體轉化宿主細胞，獲得表達重組人內皮抑素融合蛋白的工程菌，發酵培養得到所述重組人內皮抑素融合蛋白；

(4)純化分離得到的所述重組人內皮抑素融合蛋白。

本發明提供了上述重組人內皮抑素融合蛋白在制備檢測或靶向治療乳腺癌的藥物中的應用。

本發明相對于現有技術具有如下優點：

1、本發明所述的her2納米抗體二聚體，包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結合肽；二聚體形態的her2納米抗體單體進入體內后的穩定性顯著提高，同時her2納米抗體二聚體能夠長時間保存，易于保藏和運輸，降低了抗體的使用成本；her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體，在結合癌細胞中her2受體時產生協同抑制作用，增強了對癌細胞的抑制作用；her2納米抗體二聚體包括her2結合肽，her2結合肽與her2受體特異性結合，提高了her2納米抗體二聚體靶向her2的結合親和力。

2、本發明所述的重組人內皮抑素融合蛋白，包括her2納米抗體二聚體和重組人內皮抑素蛋白；重組人內皮抑素蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示，該重組內皮抑素蛋白更容易進入血管內皮細胞和雞胚絨毛尿囊膜血管內皮細胞，蛋白穿膜效果和n端的結構穩定性都有了顯著提高，可以直接抑制腫瘤細胞生長，并發揮更好的抑制新生血管內皮細胞生成的作用；her2納米抗體二聚體連接于所述重組人內皮抑素蛋白的n端或c端，使重組人內皮抑素蛋白能夠直接靶向her2高表達的乳腺癌細胞，從而特異性抑制乳腺癌細胞和癌癥病變區域新生血管的形成，達到治療乳腺癌的效果；重組內皮抑素蛋白在病變區富集可減少全身用量，降低副作用，提高量效比。

3、本發明所述的重組人內皮抑素融合蛋白同時發揮高效抑制腫瘤新生血管內皮細胞生成和靶向癌癥病變部位的功能，能夠應用于制備檢測或靶向治療her2高表達的乳腺癌的藥物。

4、本發明所述的重組人內皮抑素融合蛋白，由于納米抗體具有較好的親水性和可溶性，提高了重組人內皮抑素融合蛋白在體內的吸收率和其作為靶向檢測和治療腫瘤藥物的利用率。

5、本發明所述的編碼重組人內皮抑素融合蛋白的基因，由于重組人內皮抑素融合蛋白能夠靶向her2高表達的腫瘤細胞并高效抑制腫瘤新生血管內皮細胞生成，上述編碼重組人內皮抑素融合蛋白的基因可應用于檢測或治療her2高表達的腫瘤。

6、本發明所述的包含her2納米抗體二聚體的編碼基因或重組人內皮抑素融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或轉基因重組菌，以及重組人內皮抑素融合蛋白的制備方法，為制備檢測或治療乳腺癌潛在藥物提供了新的基因工程表達載體、細胞系以及重組菌。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明實施例1中pet-28a-dim-1重組載體測序檢測結果；

圖2為本發明實施例1中top10-pet28a-dim-endo(m)質粒測序檢測結果；

圖3為本發明實施例1中top10-pet28a-dim-endo(m)的質粒圖譜；

圖4為本發明實施例1中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)誘導表達的鑒定結果；

其中圖a顯示20℃誘導18h后融合蛋白表達的sds-page檢測結果，泳道1：iptg0.5mm誘導后上清中融合蛋白，泳道2：iptg0.5mm誘導后沉淀中融合蛋白，泳道3：iptg1.0mm誘導后上清中融合蛋白，泳道4：iptg1.0mm誘導后沉淀中融合蛋白；

圖b顯示37℃誘導6h后融合蛋白表達的sds-page檢測結果，泳道1：iptg0.5mm誘導后上清中融合蛋白，泳道2：iptg0.5mm誘導后沉淀中融合蛋白，泳道3：iptg1.0mm誘導后上清中融合蛋白，泳道4：iptg1.0mm誘導后沉淀中融合蛋白；

圖c顯示融合蛋白表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示iptg0.5mm、20℃誘導18h后的上清、iptg0.5mm、20℃誘導18h后的沉淀，iptg1.0mm、20℃誘導18h后的上清、iptg1.0mm、20℃誘導18h后的沉淀，iptg0.5mm、37℃誘導6h后的上清、iptg0.5mm、37℃誘導6h后的沉淀，iptg1.0mm、37℃誘導6h后的上清、iptg1.0mm、37℃誘導6h后的沉淀；

圖5為本發明實施例1中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)純化復性后的鑒定結果；

其中圖a顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)純化和復性后sds-page檢測結果，泳道1：pbs洗滌2次后的電泳圖，泳道2：pbs洗滌3次后的電泳圖，泳道3：pbs洗滌4次后的電泳圖，泳道4：pbs洗滌5次后的電泳圖；

圖b顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)純化復性后的梯度復性；m為標準蛋白。

圖6為本發明實施例4中pet-28a-dim、pet-28a-tet和pet-28a-hex的質粒圖譜，其中圖a顯示pet-28a-dim的質粒圖譜，圖b顯示pet-28a-tet的質粒圖譜，圖c顯示pet-28a-hex的質粒圖譜；

圖7為本發明實施例4中her2納米抗體二聚體誘導表達的鑒定結果；

其中圖a顯示不同誘導條件下her2納米抗體二聚體表達的sds-page檢測結果，泳道自左向右依次表示誘導條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體二聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的沉淀；

圖8為本發明實施例4中her2納米抗體四聚體誘導表達的鑒定結果；

其中圖a顯示不同誘導條件下her2納米抗體四聚體表達的sds-page檢測結果，泳道自左向右依次表示誘導條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體四聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的沉淀；

圖9為本發明實施例4中her2納米抗體六聚體誘導表達的鑒定結果；

其中圖a顯示不同誘導條件下her2納米抗體六聚體表達的sds-page檢測結果，泳道自左向右依次表示誘導條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體六聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導后的沉淀；

圖10為本發明實施例4中動態光散射(dls)實驗檢測her2納米抗體多聚體的粒徑大小分布比例；

其中圖a顯示her2納米抗體二聚體的粒徑大小分布比例；圖b顯示her2納米抗體四聚體的粒徑大小分布比例；圖c顯示her2納米抗體六聚體的粒徑大小分布比例；

圖11為本發明實施例4中圓二色譜法測定her2納米抗體多聚體的二級結構；

圖12為本發明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置14天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置14天后剩余蛋白的sds-page檢測結果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置14天后剩余蛋白的量化圖；

圖13為本發明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置21天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置21天后剩余蛋白的sds-page檢測結果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置21天后剩余蛋白的量化圖；

圖14為本發明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置42天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置42天后剩余蛋白的sds-page檢測結果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置42天后剩余蛋白的量化圖；

圖15為本發明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置60天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置60天后剩余蛋白的sds-page檢測結果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置60天后剩余蛋白的量化圖；

圖16為本發明實施例5中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)對乳腺癌細胞sk-br-3、mcf-7、mda-mb-231和正常乳腺細胞hbl100的抑制作用；柱形圖由左至右依次蛋白濃度為5.50ug/ml對細胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；蛋白濃度為13.75ug/ml對細胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；蛋白濃度為27.50ug/ml對細胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；

圖17為本發明實施例6中細胞免疫熒光檢測her2納米抗體二聚體與乳腺癌細胞sk-br-3的結合情況；圖片由左至右依次顯示細胞核dapi染色結果、her2納米抗體二聚體在細胞中的染色定位結果和前兩者染色的融合結果；

圖18為本發明實施例7中細胞免疫熒光檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)與乳腺癌細胞的結合情況；橫向第一排顯示sk-br-3細胞中的免疫熒光檢測結果，橫向第二排顯示mcf-7細胞中的免疫熒光檢測結果；豎向第一列顯示細胞核dapi染色結果，豎向第二列顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)在細胞中的染色定位結果，豎向第三列為第一列和第二列染色的融合結果。

具體實施方式

以下通過具體實施例來說明本發明的實施方式，除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法均采用本技術領域常規技術，所有引物合成以及測序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成，實施例中所用到的試劑和原料均可由市場購得。如pet28a(+)購自novagen公司，菌株bl21(de3)購自novagen公司；下述實施例中所涉及的細胞均來自上海細胞所。

實施例1(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)的制備

1、構建top10-pet28a-dim-endo(m)重組表達載體

所述her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結合肽，所述her2結合肽序列如seqidno.2所示，所述連接肽序列如seqidno.4所示，所述her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.3所示。

1)由南京金斯瑞公司依據seqidno.3所示的核苷酸序列合成her2納米抗體二聚體基因，利用引物1(5’-caagtcaaactggtggaatcg-3’)和引物2(5’-cacgtccatgtaacacgcatag-3’)通過pcr在her2納米抗體二聚體基因的氨基端添加bamhi酶切位點，羧基端添加ecori酶切位點，克隆進入pet28a(+)載體的bamhi和ecori兩個酶切位點位置，測序驗證重組載體，驗證結果如圖1所示，序列符合seqidno.3所示的質粒即為pet-28a-dim-1重組載體；

2)設計引物endo-f和endo-r，endo-f序列為5’-atgcgccgccgccgccgccgccgccgccgc-3’，endo-r序列為5’-ttacttggaggcagtcatgaagctg-3’，以pet28a-m-endostatin(保存于南京大學)為dna模板，利用上述兩種引物pcr擴增重組人內皮抑素融合蛋白基因，pcr擴增體系下所示：

dna模板,1μl，

endo-r,3pmol,2μl，

endo-f,3pmol,2μl，

dntpmixture,1μl，

taqdna聚合酶,1μl，

ddh2o,補齊50μl；

pcr反應條件為：94℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，30個循環；72℃退火10min。將pcr擴增產物純化后和步驟1)中得到的所述pet-28a-dim-1重組載體同時用ecori和xhoi雙酶切，跑膠純化，連接，連接體系如下所示：

pet-28a-dim(ecori和xhoi雙酶切),1μl，

pcr擴增片段,10μl，

10×t4ligasebuffer,2μl，

t4ligase,1μl，

ddh2o,補齊20μl，

混勻后，22℃反應2h后，65℃10min或70℃5min終止反應。

3)將步驟2)中得到的連接產物轉化到大腸桿菌top10感受態細胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過對菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.10所示的質粒，測序結果如圖2所示，即獲得(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)基因克隆載體top10-pet28a-dim-endo(m)(如圖3所示)。

2、(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)的誘導表達和純化

1)將質粒top10-pet28a-dim-endo(m)轉化到表達菌株bl21(de3)中。誘導表達菌株表達，在不同的iptg誘導劑濃度(0.5mmol/l和1.0mmol/l)和不同的誘導溫度(20℃和37℃)下分別誘導表達，在20℃培養溫度下誘導18h，37℃培養溫度下誘導6h。

2)離心收集菌體，將菌體超聲破碎后分別取上清和沉淀進行sds-page凝膠電泳，鑒定結果如圖4所示，結果顯示誘導后菌體在50kd附近有明顯表達帶，與預期相符；且在不同的誘導條件下融合蛋白均主要存在于沉淀中，即融合蛋白以包涵體的形式存在；iptg濃度為0.5mm、20℃誘導18h后的沉淀中得到最高表達量的融合蛋白。

3)選用包涵體變性復性的方法純化目的蛋白，首先大量誘導表達目的蛋白，離心獲取菌體沉淀，預冷pbs懸浮后，超聲破碎菌體，高速離心得到包涵體。離心得到的包涵體中含有一些細胞碎片和雜蛋白，通過pbs反復洗滌后，包涵體中目的蛋白的純度有所上升。然后使用變性液(含質量濃度1％β-巰基乙醇的6m鹽酸胍溶液)對包涵體進行溶解提純，經20mmtris-hcl(ph8.0)溶液沉淀后，加入6m鹽酸胍進行包涵體的再溶解，高速離心獲取的上清即為純度較高的包涵體溶液。隨后在變性環境(6m鹽酸胍)下，使用nta-ni柱進行目的蛋白的純化，最終獲得目的蛋白溶液。

由于純化得到的蛋白溶液中含有6m鹽酸胍，蛋白處于變性可溶狀態，需要進行復性才能獲取具有活性的蛋白質。采用梯度透析法：(1)復性液i含4m鹽酸胍，1mm還原型谷胱甘肽(gsh)，0.1mm氧化型谷胱甘肽(gssg)，20mm醋酸緩沖液(naac-hac)(ph5.0)溶液，4℃旋轉透析12h；(2)復性液ii含2m鹽酸胍，1mmgsh，0.1mmgssg，20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉透析12h；(3)復性液iii含1m鹽酸胍，1mmgsh，0.1mmgssg，20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉透析12h；(4)復性液iv為20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉透析12h；(5)重復步驟(4)一次。復性得到的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)溶液經超濾濃縮后，加入凍干保護劑甘油后分裝并保存于-20℃冰箱，所述(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)的氨基酸序列如seqidno.7所示。復性后的融合蛋白進行sds-page和western-blot檢測，結果如圖5所示，結果顯示在50kd附近可得到明顯條帶，蛋白復性效率高。

實施例2(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的制備

1、構建top10-pet28a-endo(m)-dim重組表達載體

1)將實施例1中合成的序列為seqidno.3所示的her2納米抗體二聚體基因，利用引物3(5’-caagtcaaactggtggaatcg-3’)和引物4(5’-taacacgtccatgtaacacgcatag-3’)通過pcr在氨基端添加ecori酶切位點，羧基端添加xhoi酶切位點，克隆進入pet28a(+)載體的ecori和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim-2重組載體；

2)設計引物endo-f’和endo-r’，endo-f’(5’-atgcgccgccgccgccgccgccgccgccgc-3’)，endo-r’(5’-cttggaggcagtcatgaagctg-3’)，以pet28a-m-endostatin為dna模板，利用上述兩種引物pcr擴增重組人內皮抑素融合蛋白基因，pcr擴增體系依據實施例1中所述的pcr擴增體系；

pcr反應條件為：94℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環；72℃退火10min。將pcr擴增產物純化后和步驟1)中得到的pet-28a-dim-2同時用bamhi和ecori雙酶切，跑膠純化，連接，連接體系和連接條件依據實施例1中所述方法進行。

3)將步驟2)中得到的連接產物轉化到大腸桿菌top10感受態細胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.11所示的質粒，即獲得(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)基因克隆載體top10-pet28a-endo(m)-dim。

2、(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的誘導表達和純化

依據實施例1中蛋白誘導和純化方法，獲得復性的(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，其其氨基酸序列如seqidno.8所示。

實施例3(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)的制備

1、構建top10-pet28a-dim-linker-endo(m)重組表達載體

1)將實施例1中合成的序列為seqidno.3所示的her2納米抗體二聚體基因，利用引物1和引物2通過pcr在氨基端bamhi酶切位點，在羧基端沿蛋白編碼方向添加連接肽序列和ecori酶切位點；所述連接肽的氨基酸序列如seqidno.4所示，核苷酸序列如seqidno.13所示；將上述her2納米抗體二聚體基因克隆進入pet28a(+)載體的bamhi和ecori兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim-3重組載體；

2)以實施例1中所述的引物和pcr方法擴增重組人內皮抑素融合蛋白基因，并通過ecori和xhoi位點與pet-28a-dim-3重組載體進行連接。

3)將步驟2)中得到的連接產物轉化到大腸桿菌top10感受態細胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.12所示的質粒，即獲得(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)基因克隆載體top10-pet28a-dim-linker-endo(m)。

2、(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)的誘導表達和純化。

依據實施例1中蛋白誘導和純化方法，獲得復性的(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.9所示。

實施例4her2納米抗體二聚體的性能評估

1、構建her2納米抗體二聚體(pet-28a-dim)、her2納米抗體四聚體(pet-28a-tet)和her2納米抗體六聚體(pet-28a-hex)的重組表達載體

1)設計her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體的編碼基因，上述多聚體由her2納米抗體單體通過連接肽相連，并由南京金斯瑞公司依據下述序列進行基因合成：

her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.3所示；her2納米抗體四聚體的氨基酸序列如seqidno.14所示，核苷酸序列如seqidno.15所示；her2納米抗體六聚體，其氨基酸序列如seqidno.16所示，核苷酸序列如seqidno.17所示。

利用引物1和引物2通過pcr方法在her2納米抗體二聚體的氨基端引入ndei位點，羧基端引入xhoi位點，克隆至pet28a(+)載體的ndei和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim重組載體(圖6-a)；利用引物5(5'-caagtcaaactggtggaatcg-3')和引物6(5'-cacgtccatgtaacacgcataaag-3')在her2納米抗體四聚體的氨基端引入bamhi位點，羧基端引入hindiii位點，克隆至pet28a(+)載體的bamhi和hindiii兩個酶切位點位置，得到pet-28a-tet重組載體(圖6-b)；利用引物7(5'-caagtcaaactggtggaatcg-3')和引物8(5'-cacgtccatgtaacacgcataaag-3')在her2納米抗體六聚體的氨基端引入bamhi位點，羧基端引入xhoi位點，克隆至pet28a(+)載體的bamhi和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-hex重組載體(圖6-c)；酶切得到片段大小～750bp的質粒為構建成功的pet-28a-dim重組載體,酶切得到片段大小～1500bp的質粒為構建成功的pet-28a-tet重組載體,酶切得到片段大小～2200bp的質粒為構建成功的pet-28a-hex重組載體。

2)分別在(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)六種條件下誘導her2納米抗體二聚體表達，表達產物經sds-page凝膠電泳檢測(圖7)，結果顯示誘導后菌體在27kd附近有明顯表達帶，與預期相符；在不添加iptg時，菌體基本不表達her2納米抗體二聚體；使用iptg誘導產生的her2納米抗體二聚體在不同的誘導條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體二聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體二聚體蛋白。

3)在步驟2)所述的六種條件下誘導her2納米抗體四聚體表達，表達產物經sds-page凝膠電泳檢測(圖8)，結果顯示誘導后菌體在53kd附近有明顯表達帶，與預期相符；在不添加iptg時，菌體表達量較低；使用iptg誘導產生的her2納米抗體四聚體在不同的誘導條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體四聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體四聚體蛋白。

4)在步驟2)所述的六種條件下誘導誘導her2納米抗體六聚體表達，表達產物經sds-page凝膠電泳檢測(圖9)，結果顯示誘導后菌體在75kd附近有明顯表達帶，與預期相符；在不添加iptg時，菌體表達量較低；使用iptg誘導產生的her2納米抗體六聚體在不同的誘導條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體六聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體六聚體蛋白。

5)依據實施例1中所述的蛋白純化、復性方法，得到her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體蛋白溶液。

2、her2納米抗體的物理學性能檢測

1)動態光散射(dls)實驗

將步驟1中得到的三種蛋白溶液，使用醋酸鹽緩沖液(ph5.5)稀釋成1mg/ml，后取1.5ml放入貝克曼庫爾特ls13320系列激光粒度分析儀粒徑池后在25℃下測量蛋白粒徑。醋酸鹽緩沖液(ph5.5)用于基線調零。

2)圓二色實驗

運用圓二色儀(jasco,日本)檢測三種納米抗體蛋白的二級結構，蛋白溶液濃度為12μg/ml，掃描范圍為190-250nm。

3)蛋白穩定性

將步驟1中得到的三種蛋白溶液進行分裝，每管40μl，分別放置于4℃，-20℃和-80℃溫度下，待放置14天、21天、42天和60天后，sds-page檢測蛋白穩定性。

3、結果與討論

1)動態光散射(dls)實驗

通過動態光散射(dls)分析測定純化納米抗體粒徑的尺寸分布：her2納米抗體二聚體的平均粒徑是92.57±0.94nm(圖10-a),her2納米抗體四聚體蛋白的平均粒徑是140.83±1.13nm(圖10-b),her2納米抗體六聚體蛋白的平均粒徑是395.45±0.59nm(圖10-c)。隨著納米抗體粒徑的增大，在蛋白純化復性過程中析出的沉淀也會逐漸增加，從而影響納米抗體的復性效率和產量。

2)圓二色結果

采用圓二色譜法測定納米抗體蛋白的二級結構，通過cdpro軟件在195-250nm波長范圍內測得納米抗體的相對摩爾橢圓率(deg.cm2.dmol-1)。如圖11所示，her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體的α螺旋的比重分別為1.88％、3.16％和3.55％，呈現上升趨勢；β折疊的比重分別為42.32％、33.79％和24.27％，呈現下降趨勢。由于蛋白質表面的疏水性隨α-螺旋含量的增加而減小，隨β-折疊及不規則性含量的增加而增加。結果表明，her2納米抗體六聚體的表面疏水性遠遠高于her2納米抗體四聚體和her2納米抗體二聚體，這使得her2納米抗體六聚體相比her2納米抗體二聚體在純化時易于積累和沉淀，從而影響其復性效率和產量。

3)蛋白穩定性

如圖12所示，三種納米抗體蛋白在4℃、-20℃和-80℃溫度下放置14天后，三種抗體的相對濃度可保持在90％以上；如圖13所示，在4℃下放置21天后三種抗體均能保持相應的濃度(75％～80％)；如圖14所示，三種抗體在-20℃和-80℃時的穩定性較好，能夠維持42天左右，且her2納米抗體二聚體和her2納米抗體四聚體的穩定性優于her2納米抗體六聚體。如圖15所示，當放置在不同的溫度60天后，目標蛋白已經失去了一半以上，her2納米抗體六聚體剩余量已不足30％，不能繼續使用。her2納米抗體二聚體和her2納米抗體四聚體具有較好的穩定性，在沒有保護劑的情況下，放置在4℃可以使用三個星期，在低溫(-20℃和-80℃)可放置六至七周左右，平均剩余量在70％以上。

實驗結論：her2納米抗體二聚體的穩定性高，加上保護劑可長時間運輸及保藏，可降低抗體使用成本；her2納米抗體二聚體對比納米抗體單體有更大的分子量，可延長納米抗體進入人體后的半衰期，提高了納米抗體在體內的穩定性；her2納米抗體二聚體對比其他多聚體，有較小的蛋白粒徑和較高親水性的蛋白結構，有利于蛋白誘導后的純化復性，并可提高蛋白的吸收率。

實施例5重組人內皮抑素融合蛋白對乳腺癌的抑制作用

通過cck-8實驗分別檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)、(n)-重組人內皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)和(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內皮抑素蛋白-(c)三種融合蛋白對乳腺癌細胞sk-br-3生長的抑制效果，三種蛋白對乳腺癌細胞的抑制效果無明顯差異，選擇(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)檢測對乳腺癌細胞mcf-7、sk-br-3、mda-mb-231生長的抑制效果，正常乳腺細胞hbl100作為對照。

cck-8檢測重組人內皮抑素融合蛋白對細胞活力的影響，具體步驟如下：

1)將細胞轉接至96孔板中，待到細胞密度生長至50％覆蓋率，棄去原培養基，用無菌pbs洗一次；

3)將重組人內皮抑素融合蛋白用不含胎牛血清的dmem培養基稀釋成梯度濃度的溶液，分別加入到96孔板中，每孔100μl，另設置直接加入100μldmem培養基的空白對照組，設3組重復；

4)將培養板置于37℃，含5％co2的培養箱中繼續進行培養；

5)培養24小時后，吸去培養基，每孔加入100μl單獨dmem培養液和10μlcck-8試劑，置于37℃培養箱中繼續培養2h后，用酶標儀在450nm處檢測吸光值。由于細胞數量與od450的值成正比，所以od450的值即可以反映細胞的相對數量。按照以下公式進行細胞活力的計算：

抑制率數據以x±s表示，統計學處理采用graphpadprim軟件包，組間差異采用單向方差分析。統計學顯著性水平為p<0.05，所有的p值均為雙尾檢驗。

cck8實驗結果顯示三種融合蛋白對乳腺癌細胞sk-br-3生長的抑制效果沒有明顯差別，結合蛋白表達純化結果，最終于選擇(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)蛋白作為檢測蛋白，并檢測該融合蛋白對多種乳腺癌細胞的抑制效果。

檢測結果如圖16所示：隨著(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)蛋白濃度的升高，對乳腺癌細胞mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的抑制作用也隨之加強，其中對her2陽性細胞株sk-br-3的抑制效果要明顯優于對其它乳腺癌細胞株的抑制效果，27.50ug/ml的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)蛋白對sk-br-3細胞的抑制率達80％。

結果分析：因為(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)的her2納米抗體二聚體同時具有靶向作用和穿膜肽的作用，使融合蛋白靶向her2高表達乳腺癌細胞株sk-br-3的表面，與細胞表面的her2受體特異性結合；融合蛋白的重組人內皮抑素蛋白部分是經過改造的人內皮抑素蛋白，重組人內皮抑素蛋白的n端包括穿膜肽序列(氨基酸序列：rrrrrrrrr)，具有更好的蛋白穿膜效果和n端的結構穩定性，在her2納米抗體二聚體與細胞表面her2受體結合后，重組人內皮抑素蛋白部分進入細胞內，直接抑制腫瘤細胞生長。her2納米抗體二聚體包括her2結合肽，her2結合肽與her2受體特異性結合進一步提高了her2納米抗體二聚體靶向her2受體的結合親和力；her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體，在結合乳腺癌細胞中her2抗原時對癌細胞可產生協同抑制作用，進一步增強了(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)對乳腺癌細胞的抑制效果。

實施例6her2納米抗體二聚體對乳腺癌細胞的靶向作用

1、cck-8檢測重組納米抗體對細胞活力的影響

分別將skbr3細胞、mcf7細胞以合適的濃度轉接至96孔板中，待到細胞密度生長至50％覆蓋率，按以下步驟對細胞進行處理：

(1)棄去原培養基，用無菌pbs洗一次；

(2)將納米抗體母液用不含胎牛血清的dmem培養基稀釋成梯度濃度的溶液，分別加入到96孔板中，每孔100μl，另設置對照組，直接加入100μldmem培養基。設3組重復；

(3)將培養板置于37℃，含5％co2的培養箱中繼續進行培養；

(4)培養24小時后，吸去培養基，每孔加入100μl單獨dmem培養液和10μlcck-8試劑，置于37℃培養箱中繼續培養2h后，用酶標儀在450nm處檢測吸光值。由于細胞數量與od450的值成正比，所以od450的值即可以反映細胞的相對數量。按照以下公式進行細胞活力的計算：

2、fitc標記納米抗體蛋白

將三種納米抗體蛋白dimnanobody、tetnanobody和hexnanobody上樣到sephadexg-50脫鹽柱中，洗脫液為0.1mna2co3(ph＝9.0)，收集最大吸收峰時的洗脫液，經bsa試劑盒測量蛋白的濃度，每1mg蛋白加入25μl溶于dmso的1mg/mlfitc，37℃下避光孵育1h。將標記好的蛋白在避光條件下透析約24h，以去除游離的fitc。最終獲得fitc-labelednanobodies，測量蛋白體積并計算蛋白濃度。

3、細胞結合實驗

將培養好的細胞取出培養箱，棄去培液，用無菌的pbs溶液清洗細胞2次，胰酶消化細胞1-2min，加新鮮培液終止反應，用移液器將細胞吹打混勻，將細胞懸液分裝到2mlep管中，4℃下2000rpm離心5min，吸走上清，pbs重懸細胞后再次離心除去上清。加入用新鮮陪液稀釋的同濃度的fitc-labelednanobodies后重懸，37℃孵育30min后，4℃2000rpm離心5min，pbs洗滌兩次以去除未結合的游離蛋白，加入1mlpbs懸浮后轉移到流式管中，使用流式細胞儀進行分析。

4、細胞免疫熒光

將乳腺癌細胞傳代到事先放有蓋玻片的六孔板中，在co2培養箱中培養8h后細胞貼壁生長良好時，吸去培養液后用預冷的pbs輕輕洗滌兩次，4％多聚甲醛固定1h。預冷pbs洗滌三次，每孔加入0.02mg/ml的fitc-labelednanobodies，每孔培液體積為2ml，室溫孵育1h后，預冷pbs洗滌三次后，dapi染色30min，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

如圖17所示，在乳腺癌細胞sk-br-3的細胞質中可檢測到強的熒光，表明her2納米抗體二聚體能夠高效靶向sk-br-3細胞，并富集于細胞質中。

結果分析：her2納米抗體二聚體可以靶向識別sk-br-3細胞表面表達的her2受體，并與her2受體特異性結合；由于納米抗體良好的穿透性，her2納米抗體二聚體通過細胞膜后集中在sk-br-3細胞質中。her2納米抗體二聚體中的her2納米抗體單體，在結合到sk-br-3細胞后對癌細胞的生長產生協同抑制作用。

實施例7重組人內皮抑素融合蛋白對乳腺癌細胞的靶向作用

細胞免疫熒光檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)與乳腺癌細胞的結合效果，細胞免疫熒光檢測步驟如下：

1)將乳腺癌細胞sk-br-3和mcf-7培養一段時間后，傳代到放有蓋玻片的六孔板中，加新鮮培液培養過夜；

2)pbs洗滌細胞三次后，4％多聚甲醛溶液固定細胞30分鐘，pbs洗滌3次；

3)5％血清pbs室溫封閉細胞30分鐘，去除封閉液；

4)兔多抗內皮抑素抗體(1：200)室溫孵育2小時，封閉液洗滌3次；羊抗兔cy3熒光標記二抗孵育1小時(避光)，pbs洗滌3次；

5)熒光倒置顯微鏡觀察。

如圖18所示，在乳腺癌細胞sk-br-3的細胞質中可檢測到強的熒光，表明(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)蛋白與sk-br-3細胞結合量高，并定位于細胞質中；在mcf-7細胞中，熒光效果弱，表明(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)與mcf-7細胞結合量少。

結果分析：(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)具有對her2陽性乳腺癌細胞株sk-br-3的特異性結合和識別作用，穿膜肽可以將融合蛋白帶入細胞內部。在her2納米抗體二聚體和穿膜肽的雙重作用下，免疫熒光主要集中在sk-br-3細胞質中。證明較多的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內皮抑素蛋白-(c)進入到高表達her2受體的乳腺癌細胞sk-br-3的細胞質中，進一步證實了該融合蛋白作為檢測和治療her2和高表達的乳腺癌細胞的藥用效果。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>江蘇吳中醫藥集團有限公司蘇州中凱生物制藥廠

<120>一種重組人內皮抑素融合蛋白及其制備方法和應用

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