一種黑牛肝菌母種保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黑牛肝菌母種保藏方法，所述方法包括在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲以及取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10℃～15℃恒溫保藏。本發(fā)明還涉及一種黑牛肝菌母種保藏用培養(yǎng)基以及該培養(yǎng)基在黑牛肝菌培養(yǎng)和/或保藏中的用途。
【專利說明】一種黑牛肝菌母種保藏方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種黑牛肝菌母種保藏方法，屬于食用真菌栽培【技術領域】。
【背景技術】
[0002]黑牛肝菌(/%76^0/瓜5 /70_Τ--?/7?05.?),也名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌,是熱帶地區(qū)珍貴的、最受消費者喜愛的食用菌，也是目前牛肝菌科(Aohiaceae)脈柄牛肝菌屬(/%7?^ο/7?5.)中唯一一種可以用腐生栽培方法培養(yǎng)的牛肝菌，分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭及我國云南、廣西和海南等地。黑牛肝菌品質鮮嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富、高蛋白、低脂肪，富含17種人體必需氨基酸及豐富的磷、鉀、鈣、鎂、鐵、鋅等人體必須的礦質元素，是較好的健康食品并具有很好的藥用價值，深受消費者喜愛。在自然環(huán)境中常生長于鳳凰木(從?JrOfliz regia)fern咖啡(CbiTeaaraAica )、柚子(CYtras grand is)和菠蘿蜜 ClriocarjDW1S he terophyllus )等樹下和附近的草地上，和土壤中根粉蚧也有密切關系，其特殊的生活方式正在研究中。目前已可用栽培腐生菌的方式進行人工栽培，以及接種鳳凰木、咖啡、柚子、芒果寄主樹等寄主樹進行仿生栽培。
[0003]但是黑牛肝菌母種的保藏一直是個難題。黑牛肝菌是一種高溫食用菌，適宜菌絲生長的最適溫度28°C~30°C。在現(xiàn)有的技術條件下，其菌種不能像腐生食用菌那樣進行保藏。發(fā)明人多年對黑牛肝菌菌種保藏的實踐經(jīng)驗表明，一般微生物菌種常規(guī)使用的低溫保藏法及液氮超低溫保藏法都不能有效的保藏黑牛肝菌菌種。4°C低溫保藏法，保藏15天后，菌絲死亡；液氮超低溫保藏，試驗了在保護劑中添加20%甘油及添加20%甘油、5%海澡糖兩種處理進行菌種保藏，保藏6個月進行活化，結果表明:保護劑中添加20%甘油的處理，菌種全部死亡；保護劑添加20%甘油、5%海藻糖的處理，有10%菌絲塊萌發(fā)生長，但后期的栽培試驗結果表明菌株發(fā)生了嚴重退化、菌絲弱、形成菌皮多、出菇不整齊、子實體重量減輕以及減產(chǎn)嚴重。因此，在食用真菌栽培【技術領域】存在對簡便高效的保藏黑牛肝菌母種的方法的迫切需求。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種操作簡便、可長期保持菌株活力的黑牛肝菌母種保藏方法，以解決黑牛肝栽培及科學研究中其菌種難于保藏的問題，并為其他牛肝菌及菌根食用菌菌種保藏提供借鑒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種黑牛肝菌母種保藏用培養(yǎng)基以及該培養(yǎng)基在黑牛肝菌培養(yǎng)和/或保藏中的用途。
[0005]本發(fā)明一方面涉及一種黑牛肝菌(/%76^0/7?5.PoriefliolSW1S)的保藏方法,所述方法包括:
1)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲，
其中所述固體培養(yǎng)基包括: 紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5~6.5 ;以及
2)取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10°C~15°C恒溫保藏。
[0006]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的菌絲塊大小為0.5 cm~I cm X0.5 Cm~I Cm的菌絲塊。
[0007]在一個【具體實施方式】中， 步驟2)中的所述容器選自玻璃容器和塑料容器。
[0008]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的所述容器選自保藏專用管、試管和培養(yǎng)瓶。
[0009]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的恒溫保藏在具有恒定溫度能力的裝置和/或環(huán)境中進行。
[0010]本發(fā)明另一方面涉及一種黑牛肝菌的保藏方法，所述方法包括:
1)采集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取牛肝菌的組織塊接種于固體培養(yǎng)基中，于28°C~30°C恒溫培養(yǎng)25天~30天以獲得菌絲，
其中所述固體培養(yǎng)基包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5 ;
2)從步驟(1)得到的菌絲切取0.5 cm~I cm X0.5 cm~I cm的菌絲塊放于裝有滅菌蒸
餾水的試管中，每支試管放入菌絲塊3塊~5塊，用塞子塞緊試管口；于10°C~15°C的恒溫箱中保臧。
[0011]本發(fā)明另一方面涉及一種黑牛肝菌菌種保藏方法，包括如下步驟:
(I)用改良的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)黑牛肝菌母種，母種培養(yǎng)基配方及配制方法如下: a:培養(yǎng)基配方
紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素B1 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5
b:配制方法
取1000 ml水，放入紅壤土，煮沸5分鐘，然后過濾，取濾液，加水定容至1000 ml，加入配方中其余成份，灌入規(guī)格25X200的試管中，灌入量每支20 ml，121°C滅菌20分鐘，然后擺成斜面；
(2)母種培養(yǎng):采集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取黑牛肝菌的組織塊接種于步驟(1)配制的培養(yǎng)基中，于28°C~30°C恒溫培養(yǎng)，25天~30天菌絲長滿培養(yǎng)基，得黑牛肝菌母種；
(3)母種保藏存儲管制作:用18X180規(guī)格的試管,每支試管裝蒸懼水10ml~15ml,然后常規(guī)滅菌待用；將步驟(2)得到的黑牛肝菌母種,切取0.5 cm~Icm X0.5 Cm~I Cm的菌絲塊放于已滅菌試管裝的蒸餾水中，每支試管放入3塊~5塊，用硅膠塞塞緊試管口，得母種存儲管；
(4)母種保藏溫度:步驟(3)得到的母種存儲管放于10°C~15°C的恒溫箱中保藏；
(5)母種活力及栽培性狀檢驗:步驟(4)保存的黑牛肝菌母種，分別于保藏半年、I年、3年、5年后活化菌株，擴繁菌種，再培養(yǎng)成液體菌種，液體菌種接種袋裝基質人工栽培黑牛肝菌，檢驗菌種活力及栽培性狀，結果如下:a、菌種擴繁菌絲生長快，用活化菌絲體接種于試管裝斜面培養(yǎng)基，接種后25天菌絲長滿斜面；b、用“a”擴繁的菌絲體接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種，接種第3天開始形成菌球,至第9天時菌球顏色金黃、色澤明亮,大小均勻、分布于液體培養(yǎng)基中，為菌球旺盛生長期；C、將“b”培養(yǎng)的液體菌種接種固體基質人工栽培黑牛肝菌，接種后第3天菌絲吃料，第50天菌絲長滿基質，然后覆土培養(yǎng)出菇，覆土第10天出菇且整齊，平均每個菌袋產(chǎn)子實體100g-120g，能實現(xiàn)黑牛肝菌規(guī)模化栽培。
[0012]本發(fā)明另一方面涉及一種固體培養(yǎng)基，其包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5。
[0013]本發(fā)明另一方面涉及一種固體培養(yǎng)基在黑牛肝菌培養(yǎng)和/或保藏中的用途，所述固體培養(yǎng)基，其包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~ 20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5。
[0014]本發(fā)明涉及的固體培養(yǎng)基的成分包括但不限于紅壤土、葡萄糖、酵母浸出汁、NH4NO3' CaCl2' ZnSO4' FeSO4、維生素 B1、瓊脂粉和水。
[0015]如本文所用，數(shù)值范圍包括上限值、下限值以及上限值與下限值之間的任意數(shù)值。例如，“紅壤土 100~200 g”指紅壤土的含量可以為100g、200g以及100g與200g之間的任意數(shù)值選項，例如IOlg, 125g、150g、175g、199g等。
[0016]使用本發(fā)明的方法及培養(yǎng)基保藏黑牛肝菌母種，其菌絲活力及菌種栽培性狀與一代母種相同。本發(fā)明可保存黑牛肝菌母種活力及優(yōu)良性狀達5-10年以上，解決了黑牛肝菌菌種保藏難的難題，為規(guī)模化栽培提供了有力保障。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點在于:利用本發(fā)明涉及的方法保藏黑牛肝菌菌種方法簡便有效，設備簡單，解決了高溫食用菌菌種難于保藏的難題，可長時期(5-10年)保存黑牛肝菌菌株活力及優(yōu)良性狀，為實現(xiàn)黑牛肝菌規(guī)模化生產(chǎn)提供了有力保障，具有較高的應用價值、經(jīng)濟意義及社會意義。
實施例
[0018]在以下實施例中進一步描述本發(fā)明，所述實施例示出了實施本發(fā)明的簡要方法，但不限定其所有可能變型。
[0019]實施例1
(I)用改良的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)黑牛肝菌母種，母種培養(yǎng)基配方及配制方法如下:
a:培養(yǎng)基配方
紅壤土100 g
葡萄糖10.0 g
酵母浸出汁 l.0g
NH4NO31.0gCaCl20.5 g
ZnSO40.5 g
FeSO40.5g
維生素B1 100.0ug 瓊脂粉15.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5
b:配制方法
取1000 ml水，放入紅壤土，煮沸5分鐘，然后過濾，取濾液，加水定容至1000 ml，加入配方中其余成份，灌入規(guī)格25X200的試管中，灌入量每支20 ml，121°C滅菌20分鐘，然后擺成斜面。
[0020](2)黑牛肝菌母種培養(yǎng):采集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取黑牛肝菌的組織塊接種于步驟(1)配制的培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)，25天菌絲長滿培養(yǎng)基，得黑牛肝菌母種。
[0021](3)母種保藏存儲管制作:用18X180規(guī)格的試管，每支試管裝蒸餾水10 ml，然后常規(guī)滅菌待用；將步驟(2)得到的黑牛肝菌母種，切取0.75 cm X0.75 cm的菌絲塊放于已滅菌試管裝的蒸餾水中，每`支試管放入3塊，用硅膠塞塞緊試管口，得母種存儲管。
[0022](4)母種保藏溫度:步驟(3)得到的母種存儲管放于10°C的恒溫箱中保藏。
[0023](5)母種活力及栽培性狀檢驗:將步驟(3)保存的黑牛肝菌菌種，在保藏2半年后活化菌株，擴繁菌種，再培養(yǎng)成液體菌種，液體菌種接種袋裝基質人工栽培黑牛肝菌，檢驗菌種活力及栽培性狀，結果:a、菌種擴繁菌絲生長快，用活化菌絲體接種于試管裝斜面培養(yǎng)基，接種后25天菌絲長滿斜面；b、用“a”擴繁的菌絲體接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種，接種第3天開始形成菌球，至第9天時菌球顏色金黃、色澤明亮，大小均勻、分布于液體培養(yǎng)基中，為菌球旺盛生長期；C、將“b”培養(yǎng)的液體菌種接種固體基質人工栽培黑牛肝菌，接種后第3天菌絲吃料，第50天菌絲長滿基質，然后覆土培養(yǎng)出菇，覆土第10天出菇且整齊，平均每個菌袋產(chǎn)子實體120.8g，菌種活力及栽培性狀較佳。
[0024]實施例2-3
作為優(yōu)選，實施例2-3中母種培養(yǎng)基配制、母種培養(yǎng)、母種保藏存儲管制作及保藏溫度、母種活力及栽培性狀檢驗與實施例1相同，不同之處見表1。
[0025]表1
【權利要求】
1.一種黑牛肝菌(/%76^ο/7?5.portentosus)的保藏方法,所述方法包括: 1)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲， 其中所述固體培養(yǎng)基包括: 紅壤土100~200 g 葡萄糖10.0~20.0 g 酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g CaCl20.5 ~1.0 g ZnSO40.5 ~1.0 g FeSO40.5 ~1.0 g 維生素BI100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g 水1000ml pH4.5~6.5 ;以及 2)取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10°C~15°C恒溫保藏。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中在步驟2)中菌絲塊大小為0.5 cm~I cm X0.5 cm~Icm的菌絲塊。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中步驟2)中的所述容器選自玻璃容器和塑料容器。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中步驟2)中的所述容器選自保藏專用管、試管和培養(yǎng)瓶。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的方法，其中步驟2)中的恒溫保藏在具有恒定溫度能力的裝置和/或環(huán)境中進行。
6.一種黑牛肝菌的保藏方法，所述方法包括: 1)采集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取牛肝菌的組織塊接種于固體培養(yǎng)基中，于28°C~30°C恒溫培養(yǎng)25天~30天以獲得菌絲， 其中所述固體培養(yǎng)基包括: 紅壤土100~200 g 葡萄糖10.0~20.0 g 酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g CaCl20.5 ~1.0 g ZnSO40.5 ~1.0 g FeSO40.5 ~1.0 g 維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g 水1000ml pH4.5 ~6.5 ;2)從步驟(1)得到的菌絲切取0.5 cm~I cm X0.5 cm~I cm的菌絲塊放于裝有滅菌蒸餾水的試管中，每支試管放入菌絲塊3塊~5塊，用塞子塞緊試管口；于10°C~15°C的恒溫箱中保藏。
7.—種固體培養(yǎng)基，其包括:紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g酵母浸出汁1.0~2.0gNH4NO31.0 ~2.0gCaCl20.5 ~1.0 gZnSO40.5 ~1.0 gFeSO40.5 ~1.0 g維生素BI100~200ug瓊脂粉15.0~20.0 g水1000mlpH4.5 ~6.5。
8.權利要求7的固體`培養(yǎng)基在黑牛肝菌培養(yǎng)和/或保藏中的用途。
【文檔編號】C05G3/00GK103766138SQ201310546293
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權日:2013年11月7日
【發(fā)明者】石建同 申請人:石泉