一種利用檉柳組織培養系統生產多種次生產物的方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用檉柳組織培養系統生產多種次生產物的方法。以內蒙檉柳嫩枝為外植體，分別進行不同激素組合（兩水平NAA和四個水平6-BA）及五種類型培養基（MS、1/2MS、NT、B5和WPM）處理，經不同處理的檉柳叢生苗組織中總酚含量可達136.84～353.58mg/g（干重），總三萜含量可達17.65～63.13mg/g（干重），總黃酮含量可達11.10～18.92mg/g（干重）。在附加激素為6-BA?1.0mg/L+NAA?0.05mg/L的不同類型培養基條件下，檉柳組培苗一個生長周期（30d）內的總酚產量（生長干重mg×含量mg/g）以1/2MS最高，可達60.76mg；總三萜產量以MS培養基最高，可達9.13mg；總黃酮產量以1/2MS和MS培養基較高，分別為3.25mg和2.50mg。該申請發明為通過生物發酵方法進行檉柳藥用成分的規模化生產奠定了基礎。
【專利說明】一種利用檉柳組織培養系統生產多種次生產物的方法
所屬【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用檉柳組織培養系統生產多種次生產物的方法。
【背景技術】
[0002]檉柳是我國的傳統中藥材，歷代本草多有記載，藥理實驗證明具有抑菌、止咳、解熱等作用，臨床主要用于透疹，治療慢性氣管炎、類風濕性關節炎，外用治療皮膚搔癢等，最近的研究表明，檉柳嫩枝葉中含豐富的萜類、黃酮和酚類物質，其中多種物質具有較強的抗腫瘤活性。檉柳的次生代謝產物對于開發新型藥物制劑，具有廣闊前景。
[0003]目前，對檉柳的研究主要包括:檉柳植株藥用成分及藥理活性，檉柳抗旱、抗鹽堿生理及分子機制，如干旱脅迫下膜保護酶類(S0D、P0D等)的活性以及膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)的含量等的變化，體內各種可溶性物質如脯氨酸、可溶性糖、N、K的變化，以及內源激素ABA、IAA, GA等的變化規律等；檉柳抗逆功能基因挖掘、克隆與功能驗證。
[0004]以細胞全能性為基礎建立起來的植物組織培養技術為植物藥生產提供了一條新途徑，由于利用組織或細胞培養法生產植物天然活性物質具有不依賴和消耗自然植物資源的特點，因而被視為是從根本上解決植物天然活性物質生產可持續發展問題的一種新型生物技術。目前利用細胞工程手段已實現紫杉醇、白樺三萜、人參皂苷、紫草寧、喜樹堿多種植物天然產物的合成或生產。關于檉柳組織培養及快繁的研究已有一些報道，但主要集中在組織快繁方面，而很少有關于檉柳組織培養合成次生產物的研究報道。如喬夢吉研究短穗檉柳最適組培芽啟動及增殖培養基為MS+6-BA 0.5mg/L十NAA 0.05mg/L,生根培養基為1/2MS。韓琳娜研究表明，利用檉柳的嫩芽作為外植體，最佳分化誘導培養基為MS+1.0mg/L BA+0.01mg/L NAA ;生根培養基為M S+0.05mg/L NAA。李先芳研究結果表明，采用MS培養基進行檉柳生根培養時，NAA的適宜添加濃度為0.05mg/L ;不定芽誘導最適合激素為BA
2.0mg/L ;叢生芽增殖最適培養基為MS+BA 0.05mg/L+NAA 0.01mg/L。上述檉柳組織培養不同培養基篩選的結果不盡相同，主要與其檉柳產地及品種特性有關。本發明專利以檉柳嫩芽為外植體，通過不同激素和培養基類型的篩選，明確不同處理對檉柳組織生長及次生產物合成的影響，以期為利用細胞工程規模生產檉柳藥用成分技術體系的建立及規模化生產奠定基礎。

【發明內容】
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[0005]以檉柳嫩芽為外植體，通過不同激素和培養基類型的篩選，明確不同處理對檉柳組織生長及次生產物合成的影響，以期為利用細胞工程規模生產檉柳藥用成分技術體系的建立及規模化生產奠定基礎。
[0006]技術方案是:所用實驗材料為內蒙古紅皮檉柳(Tamarix chinensis Lour.),將檉柳Icm嫩芽為外植體，進行無菌消毒處理，接種于固體培養基MS中培養。將繼代兩次后的MS培養基中的檉柳組培苗進行不同培養基和不同激素組合處理。以MS為基本培養基進行不同激素組合處理，NAA為2個水平:0.01和0.05mg/L,6-BA為4個水平:0、0.25,0.5和1.0mg/L。不同培養基類型處理為MS、1/2MS、NT、B5和WPM五種類型，附加激素均為6-BA
1.0mg/L+NAA 0.05mg/L ;不同處理均接種在100ml三角瓶中，內裝50ml固體培養基，接種量為檉柳組培苗0.30g,每個處理重復接種10瓶。培養周期為30d，培養期間進行拍照和記錄生長狀態。培養30d后收獲材料，進行鮮重測定，烘干至恒重后測定干重，同時進行次生產物總黃酮、總酚和總三萜物質含量檢測和分析。
[0007]本專利具有一下特點:
[0008]I)生產環境不受地域、季節、水質、病蟲害、氣候等自然環境的影響。
[0009]2)生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無污染，具有生態效益。 [0010]3)利用培養基及生長激素處理的方法處理促進檉柳叢生芽生長及總酚、總三萜、黃酮的高效積累，叢
[0011]生芽次生產物合成穩定，組織增殖快，有利于實現檉柳天然植物資源及其藥用成分的開發利用。
【具體實施方式】
[0012]I)植物材料來源
[0013]檉柳外植體來自15年生內蒙古紅皮檉柳(Tamarix chinensis Lour.),取直徑為
l-2cm枝條于花盆中扦插，待嫩芽長至Icm左右，進行無菌消毒，轉移至MS基本培養基中培養。
[0014]2)從生芽的誘導培養及培養體系建立
[0015]將繼代兩次后的MS培養基中的檉柳組培苗進行不同培養基和不同激素組合處理。以MS為基本培養基進行不同激素組合處理，NAA(l-naphthlcetic acid)為2個水平:
0.01 和 0.05mg/L，6-BA(6-benzyIadenine)為 4 個水平:0、0.25,0.5 和 1.0mg/L。不同培養基類型處理為|^、1/21^、見\85和1?11五種類型，附加激素均為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L ;不同處理均接種在100ml三角瓶中，內裝50ml固體培養基，接種量為檉柳組培苗0.30g，每個處理重復接種10瓶。培養周期為30d，培養期間進行拍照和記錄生長狀態。培養30d后收獲材料，進行鮮重測定，烘干至恒重后測定干重，同時進行次生產物總黃酮、總酚和總三萜物質含量檢測和分析。
[0016]固體培養基:鹿糖20g ? L'瓊脂粉5.3g ? L' pH值為6.0~6.5。培養基均以121 °C高壓蒸汽滅菌20min，培養溫度為24~26°C，光照強度為20001x，光照時間16h.cf1,濕度為40%~50%。
[0017]3)總三萜的提取及含量測定
[0018]精密稱取0.05g叢生芽干樣，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超聲40min，取IOOii L上清液于IOml離心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 y L 5%香草醛-冰乙酸和800 ii L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷卻。乙酸乙酯定容至5ml后測定其在551nm的吸光值(對照組為200 u L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0019]總三萜的標準曲線以齊墩果酸為標準品進行繪制，其回歸方程為y=43.044x-0.6438，相關系數R2=0.997，齊墩果酸在4~32mg/L含量范圍內具有良好的線性關系。
[0020]4)總酚物質的提取及含量測定
[0021]標準溶液的配制:精密稱取標準品25.0m g沒食子酸，置于100m L容量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.25mg/mL的沒食子酸標準溶液，低溫保存備用。
[0022]酒石酸亞鐵溶液的配制:稱取0.5g硫酸亞鐵及2.5g酒石酸鉀鈉置于500mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，低溫保存備用。
[0023]磷酸緩沖液的配制:將0.0667mol/L磷酸氫二鈉溶液與0.0667m o 1/L磷酸二氫鉀溶液按84:16的比例混合，調節pH7.5備用。
[0024]標準曲線的繪制:精密吸取沒食了酸標準溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml，分別置于25m L的容量瓶中，加蒸餾水至體積為5.0mI，再加入酒石酸亞鐵溶液5.0ml，用pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容至25ml，混勻，靜置15m in，隨行空白，在540rnn處測定吸光度值(A)。以沒食子酸標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線得線性回歸方程:A=15.2850+0.0061 (r=0.99985)，結果表明，沒食子酸濃度在0.01~0.05mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。
[0025]樣品溶液的制備和含量測定:準確稱取干燥的檉柳芽粉末0.2g，加入一定量的石油醚超聲提取2次，每次30min過濾，濾渣揮發干燥去除殘余石油醚后，加7ml60%乙醇，超聲提取45min。精密吸取上述樣品溶液3.0ml，按上述標準品測定方法測定吸光度，并根據回歸方程計算檉柳總多酚的含量。
[0026]5)黃酮的提取及含量測定
·[0027]A、對照品溶液的配置:精確稱取蘆丁對照品IOmg置于IOml的容量瓶中，加入4ml的50%乙醇溶解,定容制成對照品。
[0028]B、檢測波長的選擇:取500ul的蘆丁對照品置于250ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻靜置6min，再加入10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻靜置6min，加10%氫氧化鈉10ml，并用50%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15min，置石英比色皿中在波長400-600nm之間測定吸光值，最后確定最大波長為550nm。
[0029]C、供試品溶液的制備:將干燥好的檉柳芽用研缽磨成粉末，精確稱取0.200g樣品于50ml的三角瓶中，加入20ml 50%乙醇,密封好后超聲提取90min,過濾并定容至25ml備用。
[0030]D、標準曲線的繪制:精確吸取標準品 250ul、400ul、500ul、600ul、750ul、1000ul、Oul，分別置于25ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻靜置6min，再加入10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻靜置6min，加10%氫氧化鈉10ml，并用50%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15min，加lml5%亞硝酸鈉溶液搖勻，加入Iml 10%硝酸鋁溶液和IOml 10%氫氧化鈉做空白對照，于550nm下檢測吸光值。標準曲線為:y=0.0875x+0.0002，檢測含量范圍4~40mg/L含量范圍內具有良好的線性關系。
[0031]E、樣品檢測:取4ml “C”所得的供試品溶液，按照“B”所述方法加入藥品，檢測550nm下的吸光值。根據“D”得到的標準曲線方程計算檉柳叢生苗中黃酮的含量。
[0032]6)次生產物分析顯示，各處理下檉柳叢生苗組織中總酚含量均較高，可達136.84~353.58mg/g,其次為總三萜，含量可達17.65~63.13mg/g,總黃酮含量相對較低，為11.10~18.92mg/g。相同激素水平(6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L)不同培養基類型分析結果表明，檉柳叢生芽總酚產量以1/2MS最高，其次為MS和WPM培養基，分別可達60.76mg、32.32mg和32.50mg ；MS培養基最有利于總三萜產量積累，總三萜產量可達9.13mg ;總黃酮產量以1/2MS和MS培養基較高，分別為3.25mg和2.50mg。
[0033]8)該申請明確了檉柳叢生芽最佳生長培養基及次生產物生產培養基，該研究為通過懸浮培養或大規模發酵培養的方式進行檉柳藥用成分的規模化生產提供了種質材料，也為在細胞工程水平調控檉柳藥 用成分積累及遺傳改良奠定了基礎。
【權利要求】
1.一種利用檉柳組織培養系統生產多種次生產物的方法，其特征在于包括以下步驟:以內蒙紅皮檉柳嫩枝為外植體，分別進行八種激素組合(兩水平NAA和四個水平6-BA)及五種類型培養基(MS、1/2MS、NT、B5和WPM)處理，各處理下檉柳叢生苗組織中總酚含量均較高，可達136.84~353.58mg/g，其次為總三萜含量，可達17.65~63.13mg/g，總黃酮含量相對較低，為11.10~18.92mg/g。在附加激素為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L的不同類型培養基條件下，檉柳組培苗一個生長周期(30d)內的總酚產量(生長干重mgX含量mg/g)以1/2MS最高，可達60.76mg ;總三萜產量以MS培養基最高，可達9.13mg ;總黃酮產量以1/2MS和MS培養基較高，分別為3.25mg和2.50mg。
【文檔編號】A01H4/00GK103583362SQ201310553697
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】尹靜, 梁甜, 肖佳雷, 詹亞光, 王思瑤, 李明陽, 邵占媛, 鞏媛, 姜立超 申請人:東北林業大學, 尹靜, 詹亞光