利用組織培養法生產蘋果類黃酮的制作方法
【專利摘要】本發明公開了利用組織培養法生產蘋果類黃酮。本發明提供了一種利用組織培養法制備類黃酮的方法，包括如下步驟：1)將R6R6基因型植株外植體在愈傷組織誘導培養基中誘導培養，得到愈傷組織；2)將所述愈傷組織在繼代培養基中繼代培養，得到繼代愈傷組織；3)將所述繼代愈傷組織在增強培養基中增強培養，得到增強后愈傷組織；4)提取所述增強后愈傷組織中的類黃酮，得到目的產物。本發明的實驗證明，利用上述方法培養的愈傷組織，其類黃酮含量是‘金帥’等蘋果品種果肉類黃酮含量的30倍以上，可以實現利用組織培養法進行蘋果類黃酮的工業化生產。
【專利說明】利用組織培養法生產蘋果類黃酮

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及植物生物【技術領域】，具體涉及利用組織培養 法生產蘋果類黃酮。

【背景技術】
[0002] "醫食同源"是發展方向。類黃酮是蘋果果實中的一類主要多酚類物質，對人體健 康具有多方面的生理功能；而蘋果是世界性果品，由于其生態適應性強、果品營養價值高、 耐貯性好及供應周期長，世界上相當多的國家都將其列為主要消費果品而大力推薦；我國 是世界上最大的蘋果生產和消費國，其中2012年生產蘋果3950萬噸，主要用于鮮食，且近 70%是類黃酮含量較低的'紅富士'品種。因此，為保證消費者從蘋果中攝取足夠的多酚和 類黃酮，有效利用我國新疆野蘋果資源，進一步培育并推廣類黃酮含量高的功能型蘋果新 品種，研究建立利用愈傷組織生產蘋果類黃酮的離體組織培養技術體系，對于新疆野蘋果 資源的科學保護與持續利用、推動我國蘋果產業的優質高效發展及人類的健康具有重要意 義。
[0003] 新疆野蘋果及其紅肉變型（Malus sieversii f. neidzwetzkyana)是世界栽培蘋 果的祖先種，不僅遺傳多樣性豐富，而且果實多酚及Ca等功能成分含量均是'紅星'蘋果 品種的3倍以上，是蘋果品質育種的重要資源。但由于農田開墾等原因，新疆野蘋果資源 正遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕；為此，研究人員在對新疆野蘋果資源遺傳多樣性評價研究的基 礎上，于2006年在國內率先構建了 '紅富士'蘋果品種X新疆紅肉蘋果的F1雜種分離群 體；近期的研究發現，F1群體出現了紅/綿肉、紅/脆肉、白/綿肉及白/脆肉株系的分離 現象，從雜種F1代群體中能夠選育出果個較大、鮮食品質較好、抗氧化能力強、類黃酮含量 高的紅肉脆肉株系，并選出了紅脆1?10號。以此為技術依托，提出了"功能型蘋果"的概 念（在果實中富含類黃酮、可鮮食或加工的保健型蘋果），申報了鮮食類功能型蘋果"三選 兩早一促"的育種法發明專利。
[0004] 除了上述果個較大的紅肉脆肉株系外，從雜種F1代群體中還能選育出果個較小 (單果重20-40g)、分離比例極低、鮮食品質較差或很差、但類黃酮含量很高、果肉全紅、枝、 葉、花均為紫紅色的紫紅1?3號（見圖1);要以果個小、鮮食品質差的紫紅1?3號為雜 交親本，育成果個大、鮮食品質優良的功能型蘋果新品種比較困難。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種利用組織培養法制備類黃酮含量高的蘋果愈傷組 織的方法。
[0006] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)將R6R6基因型蘋果外植體在愈傷組織誘導培養基中誘導培養，得到愈傷組織；
[0008] 2)將所述愈傷組織在繼代培養基中繼代培養，得到繼代愈傷組織；
[0009] 3)將所述繼代愈傷組織在增強培養基中增強培養，得到增強后愈傷組織，即為類 黃酮含量高的蘋果愈傷組織。
[0010] 上述方法中，所述愈傷組織誘導培養基由終濃度為2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、 0. lmg/L KT、MS液體培養基（表1所示各組分及其終濃度，為有N的）、凝固劑和水組成；
[0011] 所述繼代培養基由終濃度為〇· 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液體培養基（表1所 示各組分及其終濃度，為有N的）、凝固劑和水組成；
[0012] 所述增強培養基由無 N MS培養基、終濃度為0. 3mg/L的NAA、終濃度為1. Omg/L的 6-BA、水和凝固劑組成。
[0013] 所述無 N MS培養基由表4所示的終濃度的各組分和水組成。
[0014] 上述方法中，所述凝固劑為為瓊脂，所述凝固劑在其所在的培養基中的終濃度均 為 7g/L。
[0015] 上述方法中，所述誘導培養的條件為先24°C暗培養2周，再光周期為16/8h培養 2?3周，光照強度50umol m^V1 ;
[0016] 所述繼代培養的條件為24°C、16/8h、光照強度50umol nT2s'培養2周；
[0017] 所述增強培養的條件為：24°C、16/8h、光照強度50umol πΓΥ1、培養15天。
[0018] 上述方法中，所述類黃酮含量高的蘋果愈傷組織為類黃酮含量高于10mg/g的蘋 果愈傷組織或類黃酮含量高于15mg/g的蘋果愈傷組織或類黃酮含量高于20mg/g的蘋果愈 傷組織或類黃酮含量高于25mg/g的蘋果愈傷組織或類黃酮含量高于28mg/g的蘋果愈傷組 織。
[0019] 上述方法中，所述R6R6基因型蘋果為以新疆紅肉蘋果為父本，紅富士蘋果為母本 進行雜交，得到R6R6基因型的雜交子代蘋果；
[0020] 所述R6R6基因型植株具體為紫紅1號。
[0021] 所述R6R6基因型的雜交子代蘋果的選取方法為以雜交子代的果肉組織基因組 DNA作為模板，用下述引物對進行PCR擴增，得到504bp大小條帶的為R6R6基因型植株：
[0022] F: 5 ' -GGTGGTCAAAGATGTGTGTTG-3 '
[0023] R: 5 ' -CTTATCTTTTGCCTGCTACCC-3 '。
[0024] 本發明的另一個目的是提供一種利用組織培養法制備類黃酮含量高的蘋果愈傷 組織的培養基組。
[0025] 本發明提供的培養基組，由單獨使用的愈傷組織誘導培養基、繼代培養基和增強 培養基組成，
[0026] 所述愈傷組織誘導培養基由終濃度為2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、0. lmg/L KT、 MS液體培養基、凝固劑和水組成；
[0027] 所述繼代培養基由終濃度為0. 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液體培養基、凝固劑和 水組成；
[0028] 所述增強培養基由無 N MS培養基、終濃度為0. 3mg/L的NAA、終濃度為1. Omg/L的 6-BA、水和凝固劑組成。
[0029] 上述各培養基中的凝固劑均為瓊脂，且在各培養基中的終濃度可以為7g/L，也可 為能使液體培養基凝固的濃度。
[0030] 本發明的實驗證明，本發明利用紫紅3號葉片誘導出了愈傷組織，在愈傷組織繼 代培養過程中發現，激素種類、濃度不同的培養基培養的愈傷組織，其花青苷或類黃酮含量 及其相關基因表達量存在明顯差異，高濃度的生長素抑制了類黃酮的生物合成，而無 N培 養基則顯著促進了類黃酮的生物合成，制備得到類黃酮含量高的愈傷組織。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為新疆輪胎國家種質資源圃保存的新疆紅肉蘋果與'紅富士'等蘋果品種雜 交一代（F1)果實性狀分離情況
[0032] 圖2為從F1分離群體選擇基因型為R6R6的紫紅1號幼葉為愈傷組織誘導的外植 體
[0033] 圖3為從紫紅1號幼葉誘導出愈傷組織
[0034] 圖4為低濃度NAA繼代培養基（NAAO. 3mg/L+6-BAl. Omg/L)上的紅色愈傷和2, 4-D 組合培養基（2, 4-DO. 6mg/L+TDZ0. 5mg/L)上的黃色愈傷
[0035] 圖5為低濃度NAA繼代培養基上紅色愈傷的花青苷含量及生長量
[0036] 圖6為2, 4-D組合培養基上黃色愈傷的花青苷含量及生長量
[0037] 圖7為高濃度的NAA及低濃度的2, 4-D均影響愈傷組織類黃酮生物合成
[0038] 圖8為紅色和黃色愈傷組織類黃酮生物合成相關基因表達量的比較
[0039] 圖9為紅色和黃色愈傷組織類黃酮的HPLC色譜圖
[0040] 圖10為正常MS培養基與無 N MS培養基上愈傷組織的比較
[0041] 圖11為無 N MS培養基和正常MS培養基愈傷組織花青苷含量

【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] 下述實施例中用的紫紅1號記載在如下文獻中：王燕，劉大亮，王傳增，宋楊，陳 曉流，張艷敏，陳學森，'紫紅1號'紅肉蘋果果肉抗氧化性及花色苷分析，園藝學報，2012， 39(9) :1551-1558,公眾可從山東農業大學獲得。
[0045] '夏紅肉'新疆紅肉蘋果記載在如下文獻中：陳學森，張晶，劉大亮，冀曉昊，張宗 營，張芮，毛志泉，張艷敏，王立霞，李敏，新疆紅肉蘋果雜種一代果實性狀遺傳變異及功能 型蘋果優株評價，中國農業科學，2014，47 (11) :2193-2204，公眾可從山東農業大學獲得。 [0046] 實施例1、利用組織培養法提高蘋果類黃酮
[0047] 一、外植體的獲得
[0048] 1、構建F1分離群體
[0049] 以新疆輪胎國家種質資源圃保存的'夏紅肉'新疆紅肉蘋果為父本，以'紅富士'蘋 果品種為母本進行雜交，構建雜交一代（F1)分離群體；
[0050] 2、從Fi分離群體選擇外植體
[0051] 根據紅肉蘋果轉錄因子MYB10啟動子序列（R6)設計引物，
[0052] 引物序列如下：
[0053] F:5,-GGTGGTCAAAGATGTGTGTTG-3，（序列 1)
[0054] R:5,-CTTATCTTTTGCCTGCTACCC-3，（序列 2)
[0055] 用雜交一代（F1)分離群體蘋果果肉組織的基因組DNA作為模板，上述引物進行 PCR擴增，得到504bp大小條帶的為R6R6基因型。
[0056] 結果發現，雜交一代（F1)中紫紅1?3號為R6R6,紅肉脆肉株系為R6R1，而白肉 株系為R1R1，表明R6R6基因型具有高類黃酮含量的遺傳基礎。
[0057] 因此，選擇基因型為R6R6的紫紅1號葉片為愈傷組織誘導的外植體（圖2)。
[0058] 二、利用組織培養法生產蘋果類黃酮
[0059] 1、葉片愈傷組織誘導培養
[0060] 春天采紫紅1號幼嫩葉片作為外植體，用自來水清洗干凈，75 %乙醇水溶液浸泡 15s，用無菌水沖洗3遍，3 %次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗6遍，剪成lcm2的小塊， 置于愈傷組織誘導培養基，在24°C恒溫培養室中暗培養2周，再光周期為16/8h (光/暗） 培養2?3周，光照強度50umol πΓ2^1，得到葉片愈傷組織（圖3)。
[0061] 愈傷組織誘導培養基經過研究發現，如下組分為最佳愈傷組織誘導培養基：由終 濃度為2. 5mg/L2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸）、終濃度為0. 5mg/L6-BA (6-芐氨基腺嘌呤）、終 濃度為〇. lmg/L KT (激動素）、MS液體培養基、終濃度為7g/L凝固劑和水組成，其中凝固劑 為瓊脂，用lmol/L NaOH或lmol/L HC1調整培養基pH至5. 8。
[0062] MS液體培養基組分如表1所示：
[0063] 表1為MS液體培養基中的組分
[0064]

【權利要求】
1. 一種利用組織培養法制備類黃酮含量高的蘋果愈傷組織的方法，包括如下步驟： 1) 將R6R6基因型蘋果外植體在愈傷組織誘導培養基中誘導培養，得到愈傷組織； 2) 將所述愈傷組織在繼代培養基中繼代培養，得到繼代愈傷組織； 3) 將所述繼代愈傷組織在增強培養基中增強培養，得到增強后愈傷組織，即為類黃酮 含量高的蘋果愈傷組織。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于： 所述愈傷組織誘導培養基由終濃度為2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、0. lmg/L KT、MS液 體培養基、凝固劑和水組成； 所述繼代培養基由終濃度為〇. 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液體培養基、凝固劑和水組 成； 所述增強培養基由無 N MS培養基、終濃度為0. 3mg/L的NAA、終濃度為1. Omg/L的 6-BA、水和凝固劑組成。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述凝固劑為為瓊脂，所述凝固劑在其所 在的培養基中的終濃度均為7g/L。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述誘導培養的條件為先24°C暗培養2周，再光周期為16/8h培養2?3周，光照強度 50umol m 2s 1 ； 所述繼代培養的條件為24-C、16/8h、光照強度50umol nT2s'培養2周； 所述增強培養的條件為：24-C、16/8h、光照強度50umol nT2s'培養15天。
5. 根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述類黃酮含量高的蘋果愈傷 組織為類黃酮含量高于l〇mg/g的蘋果愈傷組織或類黃酮含量高于15mg/g的蘋果愈傷組織 或類黃酮含量高于20mg/g的蘋果愈傷組織或類黃酮含量高于25mg/g的蘋果愈傷組織或類 黃酮含量高于28mg/g的蘋果愈傷組織。
6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述R6R6基因型蘋果為以新疆紅肉蘋果為父本，紅富士蘋果為母本進行雜交，選取雜 交子代蘋果中R6R6基因型蘋果； 所述R6R6基因型蘋果具體為紫紅1號，所述外植體為葉片。
7. -種利用組織培養法制備類黃酮含量高的蘋果愈傷組織的培養基組，由單獨使用的 愈傷組織誘導培養基、繼代培養基和增強培養基組成， 所述愈傷組織誘導培養基由終濃度為2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、0. lmg/L KT、MS液 體培養基、凝固劑和水組成； 所述繼代培養基由終濃度為〇. 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液體培養基、凝固劑和水組 成； 所述增強培養基由無 N MS培養基、終濃度為0. 3mg/L的NAA、終濃度為1. Omg/L的 6-BA、水和凝固劑組成。
【文檔編號】A01H4/00GK104115747SQ201410315266
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】冀曉昊, 陳學森, 張宗營, 王楠, 姜生輝, 毛志泉, 吳樹敬, 陳曉流, 張艷敏 申請人:山東農業大學