常綠萱草的組織培養法
【專利摘要】本發明公開了一種常綠萱草的組織培養法，包括以下步驟：1）取常綠萱草植株莖段流水沖洗；2）莖段經消毒后，剝取莖尖接種到誘導無菌苗培養基上進行培養；3）待步驟2）所得的無菌苗長至1.0～2.0cm高時，進行割取，得小苗Ⅰ；將小苗Ⅰ接種到誘導不定芽培養基上進行培養；4）待上述小苗Ⅰ上誘導出的不定芽長到1.0～3.0cm高時，以2～5株為一叢進行割取，得叢生小苗；將上述叢生小苗接種到增殖培養基上進行培養；5）待上述叢生小苗長出的不定芽長到3.0～6.0cm時，進行割取，得小苗Ⅲ；將此小苗Ⅲ接種到生根培養基中培養；6）待上述小苗Ⅲ長出大于2cm的至少5條根時，得可出瓶種植的種苗。
【專利說明】常綠萱草的組織培養法
【技術領域】
[0001]本發明涉及常綠萱草的組織培養法。
【背景技術】
[0002]常綠萱草具有四季常綠、花期長、抗病性強、耐寒、耐半陰等特點，是一種廣受歡迎的綠化園林栽培植物。此外，常綠萱草的根可以入藥，具利尿、涼血功效，用于治療水腫、小便不利、淋濁、帶下、黃疸、便血、崩漏等癥。從常綠萱草分離出來的蒽醌類、二氫呋喃-Y -內酰胺類等化合物具有抗菌、抗癌、殺蟲等活性。據生產調查，常綠萱草在自然條件下生長很少能夠結籽繁殖，一般采用“分株法”進行繁殖，年繁殖系數一般為4~5倍左右，嚴重阻礙了常綠萱草的大規模應用。

【發明內容】

[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種常綠萱草的組織培養法，采用該方法能獲得大量的常綠萱草組培種苗。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供一種常綠萱草的組織培養法，依次包括以下步驟:
[0005]I)、取生長健壯且無病蟲害的常綠萱草植株，剝去外面I~2層老葉，取莖尖部位I~2cm長的莖段，放入紗袋中進行流水沖洗；
[0006]2)、將步驟I)所得的流水沖洗后的莖段經消毒(為常規消毒)后，剝取長度為3~5毫米的莖尖，接種到誘導無菌苗培養基上進行培養，得無菌苗；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40μOL M-2.S-1，溫度為27土 1°C ;8小時暗培養，溫度為21 土 1°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0007]3)、待步驟2)所得的無菌苗長至1.0~2.0cm高時，進行割取，得小苗I (為單株小苗)；將所述小苗I接種到誘導不定芽培養基上進行培養，從而使小苗I上誘導出不定芽；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40μπιΟ1 m_2 ?s—1，溫度為27±1°C;8小時暗培養，溫度為21±1°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0008]4)、待上述小苗I上誘導出的不定芽長到1.0~3.0cm高時，以2~5株為一叢進行割取，得叢生小苗；將上述叢生小苗接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40μ mol π2.s—1，溫度為26~28°C;8小時暗培養，溫度為20~22°C;上述光照和暗培養交替進行；
[0009]5)、待上述叢生小苗長出的不定芽長到3.0~6.0cm時，進行割取，得小苗III (為單株小苗)；將此小苗III接種到生根培養基中培養；培養條件為:16小時光照，光照強度40~50 μ mo I π2.s—1，溫度為26~28°C ；8小時暗培養，溫度為20~22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0010]6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少5條根時，得可出瓶種植的種苗。
[0011]作為本發明的常綠萱草的組織培養法的改進:步驟I)為:將常綠萱草的莖段放入紗袋中，無菌水沖洗0.5~I小時。
[0012]作為本發明的常綠萱草的組織培養法的進一步改進:
[0013]步驟2)中的誘導無菌苗培養基為:1/4MS基本培養基+白砂糖20~30g/L+瓊脂4 ~9g/L, pH 為 5.5 ~6.0。
[0014]上述誘導無菌苗培養基的制作方法具體如下:以1/4MS基本培養基(即溶液中大量元素的含量為MS基本培養基的四分之一)為基礎，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl調節pH為5.5~6.0 ;每IL的1/4MS基本培養基中加20~30g糖、4~9g瓊脂。
[0015]步驟3)中的誘導不定芽培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20 ~30g/L+ 瓊脂 4 ~9g/L, pH 為 5.5 ~6.0。[0016]上述誘導不定芽誘導培養基的制作方法具體如下:以MS基本培養基為基礎，分別加入N-苯基-N' -1, 2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl調節pH為5.5~6.0 ;每IL的MS基本培養基加入0.05~0.5mg的TDZ、20~30g白砂糖、4~9g瓊脂。
[0017]步驟4)中的增殖培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+ 瓊脂 4 ~9g/L，pH 為 5.5 ~6.0。
[0018]上述增殖培養基的制作方法具體如下:以MS基本培養基為基礎，分別加入N-苯基-N' -1, 2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl調節pH為5.5~6.0 ;每IL的MS基本培養基加入0.05~0.5mg的TDZ、20~30g白砂糖、4~9g瓊脂。
[0019]步驟5)中的生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖15~20g/L+瓊脂4~10g/L, pH 為 5.5 ~6.0。
[0020]上述生根培養基的制作方法具體如下:以1/2MS基本培養基(即溶液中大量元素的含量為MS基本培養基的一半)為基礎，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl調節pH為5.5~6.0 ;每1L1/2MS基本培養基中加15~20g糖、4~IOg瓊脂。
[0021]依照本發明的方法，只需60~90天即可獲得試管苗；因此采用本發明的方法可以長期得到大量的試管苗。
[0022]在本發明中，步驟3)中的誘導不定芽培養基的配方同步驟4)中的增殖培養基的配方。
[0023]本發明的特點在于:
[0024]1、本發明使用了植物激素TDZ，使用效果優于使用激素6-BA ；
[0025]本發明采用“1/4MS基本培養基”作為無菌苗培養基，1/4MS基本培養基中無機鹽濃度相對較低，植株長的較快，更有利于誘導無菌苗。
[0026]2)、本發明以2~5株為一叢進行割取，轉接該叢生小苗進行繼代，叢生小苗有看護作用，利于植株的增殖；單株轉接容易損傷不利于植株的增殖。
[0027]3)、本發明對繼代增殖次數進行了比較，發現繼代周期為2-3次時增殖的倍數和苗的質量為最佳。
[0028]本發明的常綠萱草組織培養法，屬于一種離體快速繁殖的組織培養方法。依照植物組織培養中細胞全能性的原理，可以在短時間內生產大量遺傳背景相同、長勢一致的優質種苗(種子)，而且依靠實驗室可以實現周年的長期提供優質種苗。在本發明的方法中，將長勢健壯且無病蟲害的常綠萱草植株上取得的莖尖進行消毒；再通過合適的誘導培養基進行誘導不定芽以及增殖不定芽，可以獲得大量的無菌苗。采用本發明的方法，一般僅需60~90天即可得到可出瓶種植的種苗；因此常綠萱草組培苗一周年內的繁殖系數理論上為81°倍以上。所以，本發明的常綠萱草的組織培養法，是一種不受季節等因素影響，高效、快速提供優質常綠萱草種苗的方法，可以加速良種推廣速度，提高田間品種種植產量。
[0029]綜上所述，本發明建立的常綠萱草組織培養體系將為良種(常綠萱草)工廠化育苗提供理論依據和技術支撐。 [0030]本發明所得的種苗可采用以下方法進行種植:待種苗高4~8cm、具有至少3條長于2cm的根時，進行煉苗馴化，在室溫下(25°C左右)放置2~3d后開瓶，然后在自然光下放置2~3d后取出小苗，用溫水(30°C左右)洗凈根部瓊脂，并晾干，移栽入營養土中，(泥炭:珍珠巖:蛭石=4:3:3的體積比)，于人工氣候箱室培養，培養條件:溫度20~25°C，濕度85%~90%,光照強度15~25 μ mol m 2 *s 1 ;3~5周后光照強度30~40 μ mol m 2 *s 1 ；2個月后，存活率達到95%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為實施例1中激素濃度是TDZ0.05mg/L時所誘導出來的常綠萱草芽；
[0032]圖2為激素濃度是TDZ0.lmg/L時所誘導出來的常綠萱草芽；
[0033]圖3為激素為6-BA時所誘導出來的常綠萱草芽；
[0034]圖4為實施例1所得的常綠萱草的生根苗(即，可出瓶種植的種苗)；
【具體實施方式】
[0035]實施例1、一種常綠萱草的組織培養法，依次進行以下步驟:
[0036]I)、取生長健壯且無病蟲害的常綠萱草植株，剝去外面I~2層老葉，取莖尖部位I~2cm長的莖段，放入紗袋中無菌水流水沖洗0.5~I小時。
[0037]2)、將上述流水沖洗后的莖段經常規消毒后(即0.l%w/v HgCl2處理6~10分鐘后，無菌水沖洗5~8遍，然后用無菌濾紙吸干)，剝取長度為3~5毫米的莖尖，接種到誘導無菌苗培養基上進行培養；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40 μ mo I π2.s_1,溫度為27±1°C ；8小時暗培養，溫度為21±1°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0038]誘導無菌苗培養基為:1/4MS基本培養基+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.8。
[0039]3)、待上述無菌苗長至1.0~2.0cm高時(約25天)，割取單株小苗，得小苗I ;將上述小苗I接種到誘導不定芽培養基上進行培養，從而使小苗I上誘導出不定芽；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40μπιΟ1 π2.s—1，溫度為27土1°C ；8小時暗培養，溫度為21±1°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0040]誘導不定芽誘導培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH 為 5.8。
[0041]4)、待上述小苗I上誘導出的不定芽長到2.0cm高時，以2~5株為一叢進行割取，得叢生小苗；將上述叢生小苗接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40 μ mo lm2.s—1，溫度為26~28°C ；8小時暗培養，溫度為20~22°C ；上述光照和暗培養交替進行；
[0042]增殖培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.8。
[0043]5)、待上述叢生小苗長出的不定芽長到4.0cm時，單株割取，得小苗III ;將此小苗III接種到生根培養基中培養；培養條件為:16小時光照，光照強度50μmol m_2 s—1，溫度為26~28°C ；8小時暗培養，溫度為20~22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
[0044]生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖20g/L+瓊脂8g/L，pH為5.8。
[0045]6)待上述小苗III長出大于2cm的至少5條根時，得可出瓶種植的種苗(如圖4)。
[0046]依照上述方法，只需60天即可獲得試管苗；因此采用本發明的方法可以長期得到大量的試管苗。
[0047]備注說明:圖1為上述實施例1的激素濃度是TDZ0.05mg/L時所誘導出來的常綠萱草芽(叢生小苗長出的不定芽)。增殖倍數為10~12倍。
[0048]對比例1、
[0049]步驟1)同實施例1的步驟1)。
[0050]將實施例1的步驟2)中的誘導無菌苗培養基改為:1/2MS基本培養基+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.8。步驟2)中的培養條件同實施例1的步驟2)。
[0051]無菌苗長至1.0~2.0cm高，約需35天。所得到的無菌苗根比較細，無菌苗長勢也比較弱。即，該例得到的無菌苗沒有實施例1中長的快且好。
[0052]原因是:實施例1中的誘導無菌苗培養基選用的是1/4MS基本培養基，無機鹽濃度低，有助于根源基的發育，從而有助于根從培養基中吸取營養，加快了無菌苗的生長。
[0053]對比例2、
[0054]步驟1)~2)同實施例1的步驟1)~2)。
[0055]將步驟3)中的誘導不定芽培養基改為:MS基本培養基+TDZ0.lmg/L+白砂糖30g/L+瓊脂 8g/L，pH 為 5.8。
[0056]步驟4)中的增殖培養基改為:MS基本培養基+TDZ0.lmg/L+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH 為 5.8。
[0057]步驟3)和步驟4)的培養條件對應的同實施例1的步驟3)和步驟4)。
[0058]圖2為上述激素濃度是TDZ0.lmg/L時所誘導出來的常綠萱草芽(叢生小苗長出的不定芽)。增殖倍數為5~7倍。
[0059]對比例3、
[0060]步驟1)~2)同實施例1的步驟1)~2)。
[0061]僅僅將步驟3)的誘導不定芽培養基和步驟4)中的增殖培養基中的TDZ用6-BA進行替代(濃度不變)；
[0062]步驟3)和步驟4)的培養條件對應的同實施例1的步驟3)和步驟4)。
[0063]圖3為激素為6-BA時所誘導出來的常綠萱草芽(叢生小苗長出的不定芽)。增殖倍數(僅為2~3倍)及苗的長勢均不如實施例1。
[0064]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.常綠萱草的組織培養法，其特征是依次包括以下步驟: . 1)、取生長健壯且無病蟲害的常綠萱草植株，剝去外面I~2層老葉，取莖尖部位I~.2cm長的莖段，放入紗袋中進行流水沖洗； . 2)、將步驟I)所得的流水沖洗后的莖段經消毒后，剝取長度為3~5毫米的莖尖，接種到誘導無菌苗培養基上進行培養，得無菌苗；培養條件為:16小時光照，光照強度30~.40 μ mo I m_2.s'溫度為27±1°C ；8小時暗培養，溫度為21±1°C ;上述光照和暗培養交替進行； .3)、待步驟2)所得的無菌苗長至1.0~2.0cm高時，進行割取，得小苗I ;將所述小苗I接種到誘導不定芽培養基上進行培養，從而使小苗I上誘導出不定芽；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40 μ mo I um~2.s—1，溫度為27± 1°C ；8小時暗培養，溫度為21 ± 1°C;上述光照和暗培養交替進行； . 4)、待上述小苗I上誘導出的不定芽長到1.0~3.0cm高時，以2~5株為一叢進行割取，得叢生小苗；將上述叢生小苗接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為:16小時光照，光照強度30~40 μ mo I um~2.s—1，溫度為26~28°C ；8小時暗培養，溫度為20~22°C ；上述光照和暗培養交替進行； .5)、待上述叢生小苗長出的不定芽長到3.0~6.0cm時，進行割取，得小苗III ;將此小苗III接種到生根培養基中培養；培養條件為:16小時光照,光照強度40~50 μ mo I um~2.s_1,溫度為26~28°C ；8小時暗培養，溫度為20~22°C ;上述光照和暗培養交替進行； . 6)、待上述小苗III長出 大于2cm的至少5條根時，得可出瓶種植的種苗。
2.根據權利要求1所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是:所述步驟I)為:將常綠萱草的莖段放入紗袋中，無菌水沖洗0.5~I小時。
3.根據權利要求1或2所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是:步驟2)中的誘導無菌苗培養基為:1/4MS基本培養基+白砂糖20~30g/L+瓊脂4~9g/L，pH為5.5~6.0。
4.根據權利要求3所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是:步驟3)中的誘導不定芽培養基為=MS基本培養基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+瓊脂4~9g/L，pH為.5.5 ~6.0。
5.根據權利要求4所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是:步驟4)中的增殖培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+瓊脂4~9g/L，pH為5.5~.6.0。
6.根據權利要求5所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是:步驟5)中的生根培養基為:1/2MS基本培養基+白砂糖15~20g/L+瓊脂4~10g/L，pH為5.5~6.0。
7.根據權利要求6所述的常綠萱草的組織培養法，其特征是: 誘導不定芽培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為.5.8 ； 增殖培養基為:MS基本培養基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK103609444SQ201310576929
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月17日 優先權日:2013年11月17日
【發明者】毛碧增, 劉輝輝 申請人:浙江大學