利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法
【專利摘要】本發(fā)明對蛹蟲草分生孢子進行單孢分離，獲得兩種不同交配型單孢株，并按特定比例接種到柞蠶蛹或者米飯培養(yǎng)基獲得高產子實體。同時傳代多次的菌株按照mat-alpha與mat-HMG特定比例的量接種到柞蠶蛹上或者米飯培養(yǎng)基上，相對傳代多次的混合菌株具有較高子實體產量。
【專利說明】利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及利用分子生物學方法區(qū)分蛹蟲草交配型，利用新的接種方法對蛹蟲草菌株進行復壯和提高子實體產量的方法。
【背景技術】
[0002]真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎。據目前所知真菌交配系統(tǒng)包括同宗配合和異宗配合兩種。由同一孢子萌發(fā)的菌絲間能通過自體結合而產生有性孢子，這一自交可育的生殖方式稱為同宗結合，同宗結合還包括初級同宗結合和次級異宗接合兩種。必須由不同性別的菌絲接合產生的雙核菌絲才具有結實性，可產生有性孢子，這種自交不育的有性生殖方式稱為異宗結合，異宗接合還包括兩極性和四極性異宗接合。對真菌交配型的研究及減緩菌株退化，改良菌種具有重要作用。
[0003]蛹蟲草(Cordyceps militaris)具有極高的藥用價值,是一種異宗配合的子囊菌，異核體所產生的有性后代中具有兩種可親和的交配型，即mat-alpha和mat-HMG兩種交配型。研究表明，當菌株只含有其中一類交配型不能夠完成有性生活史，只有當同時含有這兩種交配型時才能完成有型生活史，具備形成具有子囊殼的子實體。因此，研究蛹蟲草菌株在生長過程中所需的兩種交配型的最優(yōu)比例，對提高蛹蟲草子實體產量、退化菌株的復壯和減緩菌株菌株退化具有重要 意義。
[0004]近年來，對蛹蟲草交配型的報道和研究日益增多，但是有關蛹蟲草兩種交配型比例與菌株生長狀況之間關系的研究報道很少。繼2005年Yokoyama等成功獲得蛹蟲草的mat-alpha和mat-HMG兩種交配型基因的全長序列后(序列號分別是AB194982和AB084257)，zhang等2013年利用子囊孢子彈射獲得蛹蟲草單孢株后，PCR檢測單孢株的交配型，將不同交配型單孢菌株混合培養(yǎng)得到的子實體產量是單一交配型(mat-alpha或mat-HMG)菌株的5倍。但是Zhang等利用子囊孢子彈射獲得單孢株的方法比較繁瑣，且準確度較低，同時Zhang等并沒有找到高產子實體的兩種交配型菌株的最優(yōu)比例。
[0005]本發(fā)明通過對蛹蟲草分生孢子單孢分離獲得單孢菌株，PCR檢測單孢株的交配型得到mat-alpha和mat-HMG兩種交配型菌株，按照mat-alpha與mat-HMG菌株特定比例的量接種于昨蠶蛹上獲得高產的子實體，按照mat-alpha與mat-HMG菌株特定比例的量接種于米飯培養(yǎng)基上獲得高產的子實體，傳代多次的菌株單孢分離獲得兩種交配型單孢株后，按照mat-alpha與mat-HMG特定比例的量接種到昨蠶蛹上或者米飯培養(yǎng)基上,相對傳代多次的混合菌株具有較高子實體產量。
[0006]本發(fā)明對蛹蟲草分生孢子進行單孢分離，獲得兩種不同交配型單孢株，并按特定比例接種到柞蠶蛹或者米 飯培養(yǎng)基獲得高產子實體，這種方法在國內外未見報道。同時傳代多次的菌株按照mat-alpha與mat-HMG特定比例的量接種到昨蠶蛹上或者米飯培養(yǎng)基上，相對傳代多次的混合菌株具有較高子實體產量，這一方法在國內外也未見有報道。

【發(fā)明內容】
[0007]本發(fā)明是提供了一種快速提高子實體產量的方法，同時克服了菌株傳代多次導致子實體產量迅速降低的問題。本方法可以直接用于生產，是一種提高子實體產量快速而又簡潔的方法。
[0008]本發(fā)明通過對蛹蟲草分生孢子進行單孢分離獲得單孢菌株，利用PCR檢測獲得mat-alpha和mat-HMG兩種交配型單抱株。
[0009]本發(fā)明利用對獲得mat-alpha和mat-HMG兩種交配型單孢株分別接種到搖瓶內，200rpm/min培養(yǎng)5天后測搖瓶菌絲質量體積比，最后換算得到單位體積內兩種交配型單孢株菌絲質量比。
[0010]本發(fā)明通過按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種于昨蠶蛹上獲得高產的子實體。
[0011]本發(fā)明通過按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種于米飯培養(yǎng)基上獲得高產的子實體。
[0012]本發(fā)明通過對傳代多次的菌株按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種到柞蠶蛹或者米飯培養(yǎng)基上，相對傳代多次的混合菌株具有較高子實體產量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為孢子在20h剛萌發(fā)伸長，箭頭所指為孢子。
[0014]圖2為對不同 單孢菌株的交配型PCR產物的檢測，上面為mat-alpha (180bp)、下面為 mat-HMG(2IObp)。
[0015]圖3為蛹蟲草菌株接種到柞蠶蛹，從左到右依次為mat-alpha與mat-HMG菌株I二 12的質量比接種、原始蛹蟲草混合菌株接種、單交配型菌株接種。
[0016]圖4為蛹蟲草菌株接種到米飯培養(yǎng)基，接種菌株順序同圖2。
[0017]圖5為傳代多次的蛹蟲草菌株接種到柞蠶蛹，從左到右依次為:對傳代多次蛹蟲草菌株單孢分離獲得的mat-alpha與mat-HMG菌株按照1:12的質量比接種、傳代多次的蛹蟲草混合菌株接種、傳代多次蛹蟲草菌株單孢分離后獲得的單交配型菌株接種。
[0018]圖6為傳代多次的蛹蟲草菌株接種到米飯培養(yǎng)基，接種菌株順序同圖4。
[0019]圖7為按不同mat-alpha與mat-HMG菌絲質量比例接種到柞蠶蛹體后生物轉化率(橫坐標為mat-alpha與mat-HMG比例,縱坐標為生物轉化率)。
【具體實施方式】
[0020]1、蛹蟲草單孢株的獲得
[0021]a、將蛹蟲草原始菌株和傳代多次的蛹蟲草菌株接種到PPDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)15天，取少量分生孢子于已加入無菌吐溫80溶液三角瓶中，劇烈渦旋后過濾，用血球計數(shù)板計數(shù)孢懸液濃度，梯度稀釋成200個孢子/mL的孢懸液。
[0022]b、將直徑為5mm的無菌玻璃紙圓片放置于90mm PPDA培養(yǎng)基平板上，用微量移液器取5 μ L孢子懸浮液滴加在5_的圓形玻璃紙中央。
[0023]c、25°C恒溫箱培養(yǎng)20h至孢子剛萌發(fā)伸長，利用倒置顯微鏡依次查看圓片上孢子萌發(fā)情況，將只帶有一個孢子且已萌發(fā)出芽管的圓片轉接至新的PPDA培養(yǎng)基平板中央，每個平板接I個孢子，25°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)至單菌落，即為單孢株。[0024]2、單孢株交配型的PCR檢測及兩種交配型的液體培養(yǎng)
[0025]a、利用氯化芐方法提取蛹蟲草單孢株基因組，PCR檢測其交配型，PCR引物參照 2009 年張等專利:mat-alpha (ΜΑΤ-1F CGCATTCAGAAGTGAGTGCA MAT-1RATATACCTTCGCGATCATTG)、mat-HMG (MAT-2F CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC MAT-2RGGGATGCCGTTCGAGGAGAG)。分別取mat-alpha和mat-HMG單孢株接種到搖瓶中，避光25°C、200rpm/min,培養(yǎng) 5d。
[0026]b、利用打散器打散菌液，分別檢測兩種搖瓶菌絲質量體積比，最后換算得到單位體積內兩種交配型單孢株菌絲質量比。
[0027]3、柞蠶蛹活體接種及子實體的培養(yǎng)
[0028]a、按照mat-alpha與mat-HMG菌絲質量比為1: 12將兩種菌液混合均勻,用無菌注射器吸取混合菌液注射到柞蠶蛹體內，每個柞蠶蛹注射400uL。
[0029]b、將注射好的柞蠶蛹放到無菌罐頭瓶內，每瓶放2個。避光16°C培養(yǎng)15d，然后換做16°C避光7h、22°C光照17h培養(yǎng)5d，最后22°C光照培養(yǎng)45d。
[0030]4、米飯培養(yǎng)基接種及子實體的培養(yǎng)
[0031]a、按照mat-alpha與mat-HMG菌絲質量比為1: 12將兩種菌液混合均勻，用移液器吸取混合菌液均勻噴灑到米飯培養(yǎng)基表面，每瓶米飯培養(yǎng)基噴灑5ml。
[0032]b、將接種好的米飯培養(yǎng)基罐頭瓶，避光16°C培養(yǎng)15d，然后換做16°C避光7h、22°C光照17h培養(yǎng)5d，最后22°C光照培養(yǎng)40d。
[0033]5、按不同mat-alpha與mat-HMG菌絲質量比例接種到昨蠶蛹體后生物轉化率計算
[0034]a、將按不同比例接種獲得的子實體及柞蠶蛹分別放到60°C、24h烘干。
[0035]b、參照2012年Shrestha B等方法分別計算出不同接種比例的生物轉化率(BE),公式為:生物轉化率(BE)=子實體重量/(子實體干重量+蠶蛹干重量)X 100%。
[0036]通過分析不同接種比例獲得生物轉化率可以看出，mat-alpha與mat-HMG菌絲接種質量比為1:12時，生物轉化率值遠高于原始菌株和其它接種比例菌株。
[0037]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換， 都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。
【權利要求】
1.利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法，其特征在于將蛹蟲草菌株按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種于昨蠶蛹上。
2.利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法，其特征在于將蛹蟲草菌株按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種于米飯培養(yǎng)基。
3.利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法，其特征在于通過對傳代多次的菌株按照mat-alpha與mat-HMG菌株1:12的質量比接種到昨蠶蛹或者米飯培養(yǎng)基上，相對傳代多次的混合菌株具有較高子實體產量。
4.根據權利要求1或2所述的培養(yǎng)方法,其特征在于所述的mat-alpha與mat-HMG菌株通過如下方法得到: a、將蛹蟲草原始菌株或傳代多次的蛹蟲草菌株接種到PPDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)15天，取少量分生孢子于已加入無菌吐溫80溶液三角瓶中，劇烈渦旋后過濾，用血球計數(shù)板計數(shù)孢懸液濃度，梯度稀釋成200個孢子/mL的孢懸液； b、將直徑為5mm的無菌玻璃紙圓片放置于90mmPPDA培養(yǎng)基平板上，用微量移液器取5 μ L孢子懸浮、液滴加在5mm的圓形玻璃紙中央； c、25°C恒溫箱培養(yǎng)20h至孢子剛萌發(fā)伸長，利用倒置顯微鏡依次查看圓片上孢子萌發(fā)情況，將只帶有一個孢子且已萌發(fā)出芽管的圓片轉接至新的PPDA培養(yǎng)基平板中央，每個平板接I個孢子，25°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)至單菌落，即為單孢株； d、利用氯化芐方法提取蛹蟲草單孢株基因組，PCR檢測其交配型；分別取mat-alpha和mat-HMG單孢株接種到搖瓶中，避光25°C、200rpm/min,培養(yǎng)5d ； e、利用打散器打散菌液 ， 分別檢測兩種搖瓶菌絲質量體積比，最后換算得到單位體積內兩種交配型單孢株菌絲質量比。
【文檔編號】A01G1/04GK103609331SQ201310578734
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】黃勃, 王玉龍, 陳安徽 申請人:安徽農業(yè)大學