本發(fā)明屬于食用菌藥用菌遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種紫外線二次誘變育種的方法，尤其涉及一種提高菌種的變異量的蛹蟲(chóng)草紫外線二次誘變育種的方法。

背景技術(shù)：

冬蟲(chóng)夏草(拉丁學(xué)名cordycepssinensis(berk.)sacc)又名蟲(chóng)草，是我國(guó)特產(chǎn)的一種名貴滋補(bǔ)藥材，與人參、鹿茸齊名，為傳統(tǒng)三大補(bǔ)品之一。其營(yíng)養(yǎng)成分高于人參，可入藥，也可食用，是上乘的佳肴，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。冬蟲(chóng)夏草可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，滋補(bǔ)肺腎，對(duì)肺癌、肝癌等有明顯的抑制作用。在臨床上對(duì)肺虛久咳，氣喘，肺結(jié)核咯血，盜汗，腎虛腰膝酸痛，陽(yáng)痿遺精，神經(jīng)衰弱及化療、放療后的紅細(xì)胞下降都有療效。

蛹蟲(chóng)草(拉丁學(xué)名cordycepsmilitaris)，又稱(chēng)作北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)蛹草、北蛹蟲(chóng)草等，屬于麥角菌科蟲(chóng)草屬，與冬蟲(chóng)夏草同屬異種，藥用價(jià)值與馳名中外的冬蟲(chóng)夏草相似。蛹蟲(chóng)草世界性分布，天然資源數(shù)量很少，在我國(guó)主要產(chǎn)于云南(昆明、安寧、江川)、吉林(安圖、永吉)、遼寧(沈陽(yáng))、內(nèi)蒙古(哲里木盟)等地，生于針、闊葉林或混交林地表土層中鱗翅目昆蟲(chóng)的蛹體上。

蛹蟲(chóng)草對(duì)環(huán)境的要求較低，液體發(fā)酵可形成菌絲體，人工大規(guī)模固體培養(yǎng)可獲得子座。蛹蟲(chóng)草的成分如蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草酸，與天然的冬蟲(chóng)夏草的含量相當(dāng)，有些成分的含量甚至超過(guò)冬蟲(chóng)夏草，如蟲(chóng)草素的含量是天然冬蟲(chóng)夏草的35倍以上。蛹蟲(chóng)草的有效活性成分蟲(chóng)草多糖被認(rèn)為是非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，可激活肌體的免疫細(xì)胞。與冬蟲(chóng)夏草相比，蛹蟲(chóng)草具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：蛹蟲(chóng)草作為蟲(chóng)草屬的模式種，分布廣泛，為世界各國(guó)學(xué)者所認(rèn)識(shí)和接受；蛹蟲(chóng)草已在人工條件下育成了完整子座；蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖，其獨(dú)特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。因?yàn)榫哂幸陨蟽?yōu)點(diǎn)，蛹蟲(chóng)草已經(jīng)成為蟲(chóng)草屬中藥用蟲(chóng)草菌中的佼佼者。

由于蛹蟲(chóng)草獨(dú)特的藥用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、科研價(jià)值以及潛在的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人工培育蛹蟲(chóng)草的技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。蛹蟲(chóng)草栽培是一系列復(fù)雜操作的工作程序，包括菌株選擇、母種選育與保存、菌種制備、出草管理以及市場(chǎng)銷(xiāo)售等，每個(gè)程序都必不可少且至關(guān)重要。其中育種又是這些程序中的首要內(nèi)容，沒(méi)有優(yōu)良的菌種，其他工作程序的準(zhǔn)備或優(yōu)化就沒(méi)有基礎(chǔ)，最終可能直接造成蛹蟲(chóng)草減產(chǎn)或栽培失敗。

然而現(xiàn)有的蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)多關(guān)注改進(jìn)或優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件或總體考慮各個(gè)步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，少關(guān)注菌種馴化。例如，cn1724641a公開(kāi)了一種北冬蟲(chóng)夏草液體菌種營(yíng)養(yǎng)基的制備方法及其應(yīng)用。該發(fā)明主要通過(guò)選取不同的原料，包括胡蘿卜、葡萄糖等物料，然后進(jìn)行充分混合，再加入一定量的鏈霉素后進(jìn)行發(fā)酵，制得北冬蟲(chóng)夏草液體菌種營(yíng)養(yǎng)基；然后在培育北冬蟲(chóng)夏草的過(guò)程中進(jìn)行溫度、時(shí)間的不同控制，以達(dá)到較好的培育效果。cn101463325a公開(kāi)了一種北冬蟲(chóng)夏草工廠化栽培方法，經(jīng)菌種制備、配料裝瓶、滅菌、接種、培養(yǎng)、出草采收步驟、工廠化栽培北冬蟲(chóng)夏草，采用了常見(jiàn)的人工代料作為培養(yǎng)材料，降低了生產(chǎn)成本。該發(fā)明獲得的北冬蟲(chóng)夏草質(zhì)量穩(wěn)定性好，生物轉(zhuǎn)化率高。cn104054513a公開(kāi)了一種可以代替冬蟲(chóng)夏草入藥、能代替天然冬蟲(chóng)夏草藥源的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，該技術(shù)方案包括下列步驟：(1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；(3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北冬蟲(chóng)夏草菌種的人工栽培。該發(fā)明公布的北冬蟲(chóng)夏草菌種培養(yǎng)方法，能夠增加冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)菌株篩選問(wèn)題，本發(fā)明提供一種蛹蟲(chóng)草紫外線二次誘變育種的方法。本發(fā)明提供的方法能大幅度地增加菌種的變異量，從而有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種蛹蟲(chóng)草紫外線二次誘變育種的方法，包括如下步驟：

1)準(zhǔn)備蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液；

2)第一次誘變處理；

3)第二次紫外線照射誘變處理；

4)挑菌篩選。

優(yōu)選地，所述第二次紫外線照射誘變處理的照射時(shí)間為1～2.5分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第二次紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為2分鐘。

優(yōu)選地，所述第一次誘變處理選自紫外線誘變處理、x光線誘變處理、y射線及硫酸二乙酯誘變處理、5-溴尿嘧啶誘變處理、氮芥誘變處理、n"廣甲基n"亞硝基胍誘變處理中的一種。

優(yōu)選地，所述第一次誘變處理為紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為0.8～1.5分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次誘變處理為紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為1分鐘。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，在第二次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開(kāi)啟20～60分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在第二次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開(kāi)啟20分鐘。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，在第一次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開(kāi)啟20～60分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在第一次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開(kāi)啟20分鐘。

制備蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液選用無(wú)菌生理鹽水或磷酸緩沖液均可。

紫外照射誘變誘變處理應(yīng)在黑暗處進(jìn)行，優(yōu)選黑暗無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處。誘變處理時(shí)應(yīng)先開(kāi)燈20～60分鐘，使紫外燈波長(zhǎng)穩(wěn)定，然后將蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，打開(kāi)皿蓋，照射數(shù)分鐘。

當(dāng)蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液每毫升所含的活孢子數(shù)約在106～113個(gè)時(shí)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，為得到單個(gè)菌落，孢子懸浮液稀釋倍數(shù)范圍可以是1000-10萬(wàn)倍。

本發(fā)明取得了以下技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的方法能大幅度地增加蛹蟲(chóng)草孢子的變異量，從而有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株，進(jìn)而篩選出蟲(chóng)草素、腺苷、多糖或蛹蟲(chóng)草產(chǎn)量高的優(yōu)良菌株，以提高蛹蟲(chóng)草的藥用/食用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

具體實(shí)施方式

為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的理解，以下將參考某些實(shí)施方式，并且將使用特定語(yǔ)言來(lái)描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些具體實(shí)施方式不意圖限制本發(fā)明的范圍。所描述的實(shí)施方式中的任何改變和進(jìn)一步的修改，以及本發(fā)明的任何進(jìn)一步應(yīng)用，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會(huì)想到的。

實(shí)施例1蛹蟲(chóng)草紫外線二次誘變育種的方法

包括四個(gè)步驟：

1)準(zhǔn)備蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液

出發(fā)菌株：蛹蟲(chóng)草品種ycc-01。

將新鮮的無(wú)菌孢子移入5ml無(wú)菌生理鹽水中，搖勻后即成孢子懸浮液。孢子懸浮液的終濃度為每毫升含孢子108～115個(gè)。

2)第一次誘變處理

在黑暗超凈工作臺(tái)進(jìn)行，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處，誘變處理時(shí)應(yīng)先開(kāi)燈20分鐘，使波長(zhǎng)穩(wěn)定，然后將蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液倒入直徑為6厘米的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，打開(kāi)皿蓋，照射1分鐘。

經(jīng)檢測(cè)，照射后的蛹蟲(chóng)草孢子懸浮液每毫升所含的活孢子數(shù)約在106～113個(gè)。

因此為得到單個(gè)菌落，先用無(wú)菌水將照射后的孢子懸浮液稀釋10萬(wàn)倍、100萬(wàn)倍、1000萬(wàn)倍，然后分別取釋釋液0.3ml涂布于裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，在22℃下培養(yǎng)4～6天直到每個(gè)平板上得到單菌落。

3)第二次紫外線照射誘變處理

在黑暗超凈工作臺(tái)進(jìn)行，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處，誘變處理時(shí)應(yīng)先開(kāi)燈20分鐘，使波長(zhǎng)穩(wěn)定，然后將第一次誘變處理得到的蛹蟲(chóng)草單菌落平板打開(kāi)皿蓋，照射2分鐘。選純正、健壯的單個(gè)菌落移入斜面試管內(nèi)，供下一步挑菌篩選。

4)挑菌篩選

選純正、發(fā)育健全的單個(gè)菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長(zhǎng)好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營(yíng)養(yǎng)液中，然后分級(jí)進(jìn)行栽培試驗(yàn)，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法檢測(cè)蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素的含量以評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草的變異量。

實(shí)施例2蟲(chóng)草素的含量檢測(cè)方法

參考cn102060898b實(shí)施例5公開(kāi)的方法。

稱(chēng)取150g的干燥人工培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體，用力壓碎后，加入到行星球磨機(jī)的250ml球磨灌中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500r/min，氧化鋁球個(gè)數(shù)為20(10大球和10小球)，采用正反交替研磨，交替時(shí)間5min，處理總時(shí)間為30min，得到蛹蟲(chóng)草子實(shí)體粉末。將150g粉末加入到1500ml的蒸餾水中，用0.1mol/lhcl調(diào)整ph為2.5，溫度為45℃，用頻率為30khz超聲波處理1h，處理完后離心(3000r/min，10min)，收集上清液，在上清液中加入45g活性炭吸附色素，再過(guò)濾，在濾液中再加入45g活性炭吸附色素，重復(fù)操作，直到上清液沒(méi)有顏色為止，將此上清液先用300ml的乙酸乙酯在空化混懸萃取裝置中萃取，棄去乙酸乙酯層，剩余液體再用300ml的氯仿在空化混懸萃取裝置中萃取，棄去氯仿層，剩余液體上d101層析柱，先用蒸餾水洗脫至流出液無(wú)色，再用ph為5.5的體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇水溶液以1ml/min速度洗脫，收集洗脫液，真空干燥即得蟲(chóng)草素晶體，稱(chēng)量得到每150g的干燥人工培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體蟲(chóng)草素含量。

實(shí)施例3菌種變異量檢測(cè)

以蟲(chóng)草素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)價(jià)誘變處理后蛹蟲(chóng)草的變異量。

待檢測(cè)樣品：

樣品1：實(shí)施例1第一次誘變處理后得到的單菌落選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長(zhǎng)好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營(yíng)養(yǎng)液中，分級(jí)進(jìn)行栽培。分別測(cè)定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量。

樣品2：實(shí)施例1第二次紫外線照射誘變處理后得到的單菌落選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長(zhǎng)好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營(yíng)養(yǎng)液中，分級(jí)進(jìn)行栽培。分別測(cè)定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量。

對(duì)照樣品1：未做誘變處理的蛹蟲(chóng)草品種ycc-01無(wú)菌孢子移入5ml無(wú)菌生理鹽水或磷酸緩沖液中，搖勻后即成孢子懸浮液。孢子懸浮液的終濃度為每毫升含孢子108～115個(gè)。取釋釋液0.3ml涂布于裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，在22℃下培養(yǎng)4～6天直到每個(gè)平板上得到單菌落。選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長(zhǎng)好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營(yíng)養(yǎng)液中，分級(jí)進(jìn)行栽培。分別測(cè)定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量。

對(duì)照樣品2：按照實(shí)施例1第一次誘變處理的方法處理蛹蟲(chóng)草孢子，處理時(shí)間為3分鐘。選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長(zhǎng)好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營(yíng)養(yǎng)液中，分級(jí)進(jìn)行栽培。分別測(cè)定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量。

蛹蟲(chóng)草栽培方法：

1)采用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，水1000ml配方按常規(guī)繁育生產(chǎn)用液體菌種。

2)采用750ml的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70ml，1.05公斤/平方厘米壓力滅菌75分鐘，冷卻接種。

3)菌瓶先放于20℃避光培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入光暗交叉培養(yǎng)，每天白天以1000勒克斯強(qiáng)度光照，晚上暗培養(yǎng)，環(huán)境濕度85％，每天通風(fēng)3次。

4)整個(gè)生產(chǎn)周期55天，子實(shí)體長(zhǎng)度控制在8～12厘米，其它按常規(guī)操作，每批采樣后抽樣測(cè)定蟲(chóng)草素含量。

試驗(yàn)結(jié)果：

檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照樣品1相比，樣品1中有20％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量變化值在50％以上；樣品2中有80％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量變化值在50％以上；對(duì)照樣品2中有40％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲(chóng)草素含量變化值在50％以上。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第二次紫外線照射誘變處理能大幅度地增加菌種的變異量，且所述誘變效果(變異量)大于單純延長(zhǎng)紫外線照射處理時(shí)間的變異量。本發(fā)明公布的蛹蟲(chóng)草紫外線二次誘變育種的方法將有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株。

本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(例如，“比如、諸如”)的使用僅旨在更好地說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，除非另有要求。說(shuō)明書(shū)中的語(yǔ)言不應(yīng)被解釋為指示任何未要求保護(hù)的元件對(duì)于實(shí)施本發(fā)明是必要的。

本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地指明通過(guò)引用并入。此外，本文所述的任何理論、機(jī)制、證明或發(fā)現(xiàn)旨在進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的理解，并且不意圖以任何方式將本發(fā)明限制到這樣的理論、機(jī)制、證明或發(fā)現(xiàn)。盡管已經(jīng)在前面的描述中詳細(xì)地示出和描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而不是限制性的。