榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質及獲取方法
【專利摘要】本發明公開了一種榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質及獲取方法，填補了缺少蕓薹屬三基因組異源六倍體蔬菜種質的空白；本發明利用蕓薹屬蔬菜種質榨菜和紫甘藍進行雜交，授粉后7天摘取子房，利用胚拯救獲得成熟的種子，種子萌發后經過繼代、擴繁獲得大量的有性后代，經過雜種確定后，利用添加秋水仙素的液體培養基對單倍體進行加倍處理獲得多基因組異源六倍體蔬菜種質。本發明可操作性強，簡單實用，節省獲得多基因組多倍體材料的時間，可以廣泛應用于十字花科蕓薹屬蔬菜類種質的種間雜交的胚搶救，對于特殊植物新品種的培育和育種具有重要的意義。
【專利說明】榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質及獲取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質及獲取方法，涉及【技術領域】為人工合成多基因組多倍體新種質的方法。
【背景技術】
[0002]多倍體在植物中普遍存在，在植物的多樣化過程中起著重要的作用。多倍體常使植株帶來一些形態和生理上的變化，具有巨大性、代謝物增多、產量增加以及抗逆性加強等特點。鑒于其優良的特點，多倍體的創制具有重要的生產利用價值。目前對于多倍體植株的獲得大都是通過人工合成的方法。人工合成多倍體新種質及其結構和功能演化的深入研究，是各國科學家競相探索并研發應用的熱點領域，也是我國具有競爭優勢的基礎性研究方向。隨著人們對農產品要求的日益提高，利用自然界中已有的豐富遺傳資源，通過各種遠緣雜交獲得多基因組多倍體，以及對多基因組多倍體的遠緣雜種進行進一步利用，是培養“綠色、超級”農作物新種質的重要手段。因此多基因組多倍體材料具有重要的基礎和應用價值。
[0003]我國對主要農作物多基因組多倍體超級新種質的創制技術及其育種應用有迫切的需求。其中十字花科蕓薹屬是重要農作物(油料作物的油菜、蔬菜類的白菜、甘藍、芥菜等)，重要模式 植物(擬南芥、薺菜等)和重要野生資源(鹽芥、高山南芥等)的寶庫。多倍體和種間雜交對十字花科植物基因組進化、系統發育、物種合成與品種培育均具重要的影響和作用。其中蕓薹屬包含ABC全部三基因組六倍體AABBCC新復合種的獲得，對于后續研究與未來技術發展具有重要的作用。但是種間的遠緣雜交通常具有生殖障礙，進而很難獲得多基因組多倍體材料，阻礙了人們對于種質創新、基因組進化以及系統發育的研究。因此創制一種多基因組多倍體的材料以及其采用的方法至關重要。
[0004]前期對于蕓薹屬多基因組多倍體的材料合成多集中于油料作物，如埃塞俄比亞芥菜與白菜型油菜雜交、芥菜型油菜與羽衣甘藍雜交；同時也有關于油用芥菜與花椰菜雜交的報道，其雖然能夠在自然條件下獲得成熟的種子，但是獲得真雜種的幾率非常的低。在芥菜與花椰菜雜交的實驗中，獲得了 793粒種子，但是其中只有四粒種子為真雜種，雜種率僅有0.5%。目前除了直接利用兩種材料直接進行雜交之外，還有研究報道通過多個種間材料多年進行多次雜交獲得三基因組多倍體材料，但是這種方法加大了育種時間、人力物力的消耗。然而目前，對于蕓薹屬食用蔬菜類種質的三基因組多倍體創制及研究還是空白，從而阻礙了人們對于多基因組多倍體蔬菜新種質的研究及生產實際應用。本發明中采用蕓薹屬中的蔬菜類種質榨菜(基因組=AABB)和紫甘藍(基因組:CC)作為研究材料，榨菜作為我國的特有蔬菜，富含功能性成分芥子硫苷，具有膨大的瘤狀莖，具有重要的食用價值；而紫甘藍所具有的紫色性狀在抗蟲害、保健功能等方面具有優勢，因此通過這兩種材料合成多基因組多倍體蔬菜新種質在抗性、保健功能及食用價值上具有重要的意義。研究發現榨菜和甘藍的自然雜交不能獲得后代，對于榨菜與紫甘藍種間雜交獲得多基因組多倍體蔬菜新種質還未見報道，并且還沒有一種方法能夠快速、有效地合成蕓薹屬多基因組多倍體蔬菜新種質。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質及獲取方法。
[0006]為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是:
[0007]—種榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質，包含兩雜交親本榨菜和紫甘藍全部的基因組DNA，其染色體DNA相對含量等于榨菜與紫甘藍DNA相對含量之和，并同時具有榨菜和紫甘藍的多態性擴增產物；并且其形態學與兩雜交親本相比較，表現出特有的植物學特征，表現為莖色為淡紫色、莖的著生方式為短縮莖，葉片呈卵圓形、較厚，表面無刺毛、無蠟質層，葉緣呈波狀。
[0008]上述榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質的獲取方法，包括如下步驟:
[0009](1)蕓薹屬榨菜作為母本，蕓薹屬紫甘藍作為父本進行有性雜交，授粉7天后摘取子房；所述授粉為連續兩天重復授粉兩次；
[0010](2)將子房消毒并沖洗；
[0011](3)將子房置于鋪有用濃度為0.03g/mL的蔗糖溶液充分浸泡過的濾紙的培養皿上，剖開子房一端后沿腹縫線撕開，將胚珠連同胚柄及與胚柄相連的子房壁組織一同切下并接種到發 育培養基上；于25±2°C黑暗條件下培養24h，再光照條件下培養40天，光照強度為40μmο1.m-2 光照時間為12小時/天；所述發育培養基由MS(Murashige&Skoog)、蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭和水組成，蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭的質量濃度分別為
0.03g/mL、0.008g/mL、0.0004g/mL、0.002g/mL,余量為水，pH 為 5.8
[0012](4)將成熟種子摘下接種于發芽培養基上于25±2°C黑暗條件下培養；所述發芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-芐氨基嘌呤(6-BA)和水組成，蔗糖、瓊脂、6-芐氨基嘌呤的質量濃度分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量為水，pH為5.8 ;
[0013](5)在種子萌發后30天將幼苗先轉移到繼代培養基、擴繁培養基上繼代擴繁，培養條件為溫度為25±2°C、光照強度為SOymol.m-2 ^1、光照時間為12小時/天；所述繼代培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂和水組成，蔗糖、瓊脂的質量含量分別為0.03g/mL、0.008g/mL,余量為水，pH為5.8 ;繼代所采用的外植體為帶2枚真葉的單芽莖段；所述擴繁培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA和水組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量濃度分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量為水，pH為5.8 ;擴繁所采用的外植體為附帶腋芽的莖段；
[0014](6)組培幼苗具有4片真葉時，對其幼嫩葉片進行RAPD (隨機擴增的多態性DNA)多態性分析及流式細胞鑒定，獲得榨菜與紫甘藍種間真雜種；
[0015](7)對鑒定為真雜種的幼苗進行加倍處理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液體培養基對單倍體莖段進行振蕩培養，28°C，150rpm振蕩培養兩天；所述的加倍液體培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸(NAA)和水組成，蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸的質量濃度分別為0.03g/mL、0.008g/mL、2mg/L、0.lmg/L，余量為水，pH為5.8 ;秋水仙素終濃度為100mg/L ；
[0016](8)處理完畢后的外植體用無菌水沖洗干凈后轉移到不含秋水仙素的誘導芽培養基上培養誘導腋芽的產生，腋芽生長20天后切下轉移到1/2MS培養基上生長，幼苗具有4片真葉時利用流式細胞術進行倍性的鑒定；所述誘導芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA和水組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量濃度分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量為水，pH 為 5.8
[0017](9)將加倍成功的幼苗移到生根培養基上進行生根培養，將生根后的幼苗取出，移栽至裝有基質的營養缽中煉苗，煉苗時，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗3天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應外界環境；最終獲得蕓薹屬三基因組異源六倍體蔬菜新種質；所述生根培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、NAA和水組成，蔗糖、瓊脂、NAA的質量體積比分別為0.03g/mL、
0.008g/mL、0.lmg/L，余量為水，pH 為 5.8。
[0018]本發明的有益效果是:本發明采用食用蔬菜種質榨菜與紫甘藍作為雜交親本材料，利用人工培養基對雜交胚珠進行培養使胚珠成熟為種子，種子萌發后再經過繼代、擴繁及加倍，可在短期內獲得大量的三基因組異源多倍體蔬菜新種質。該方法可操作性強，簡單實用，節省獲得多基因組多倍體材料的時間，可以廣泛應用于十字花科蕓薹屬蔬菜類種質的種間雜交的胚搶救，對于特殊植物新品種的培育和育種具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是榨菜、紫甘藍及雜種RAPD檢測圖，圖中，a、b、c是引物I的擴增產物，d、e、f是引物2的擴增產物，g、h、i是引物3的擴增產物，j、k、I是引物4的擴增產物，m、η、ο是引物5的擴增產物，模板分別為榨菜，紫甘藍，雜種；
[0020]圖2是榨菜染色體DNA相對含量分析圖；
[0021]圖3是紫甘藍染色體DNA相對含量分析圖；
[0022]圖4是雜種染色體·DNA相對含量分析圖；
[0023]圖5是異源六倍體蔬菜種質染色體DNA相對含量分析圖；
[0024]圖6是榨菜苗期植株形態學特征照片；
[0025]圖7是紫甘藍苗期植株形態學特征照片；
[0026]圖8是異源六倍體蔬菜種質苗期植株形態學特征照片。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0028]實施例1:
[0029]材料:本實例以十字花科蕓薹屬紫甘藍(Brassica oleracea)和榨菜(B.juncea)的多年自交純系為材料。
[0030]步驟(1):取材
[0031]以榨菜作為母本，紫甘藍作為父本于4-5月進行蕾期人工授粉，連續涂抹2天，避免出現受精前雜交不親和，隨后取授粉后7d的子房，避免子房發生敗育。同時自然狀態下發育的子房作為對照，無法得到成熟的種子。
[0032]步驟(2):材料消毒
[0033]將摘取的子房先用蒸餾水清洗干凈，或浸泡在蒸餾水中，避免種莢失水干癟。隨后在超凈工作臺上，用75%的酒精消毒30秒，無菌水沖洗3次，再用5%的次氯酸鈉溶液浸泡15分鐘，其間搖動幾次以徹底消毒。然后在超凈工作臺上用無菌蒸餾水沖洗3遍。[0034]步驟(3):胚珠的剝離和接種
[0035]將沖洗后的子房置于鋪有用濃度為0.03g/mL的蔗糖溶液充分浸泡過的濾紙的培養皿上，用手術刀剖開一端，然后用兩把鑷子緩慢地將子房沿腹縫線撕開，這種操作方法簡單易行，可有效地減少刀切，在避免對胚珠的操作損傷方面有顯著效果。
[0036]步驟(4):胚珠的接種
[0037]選取子房內呈淡綠色且有光澤的胚珠，將其與胚柄及與胚珠相連的子房壁組織一同切下，接種到發育培養基上，胚珠不直接接觸培養基。發育培養基由MS、蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭組成，蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.0004g/mL、0.002g/mL，pH為5.8。接種后的胚珠先于25±2°C、黑暗條件下培養24小時，再光照條件下培養40天，光照強度為40 μ mol.πL2.s_\光照時間為12小時/天。 [0038]步驟(5):種子的成熟和萌發
[0039]種子成熟，統計胚珠發育成種子數，種子得率為3.33%。將成熟的種子接種于發芽培養基上，發芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，pH為5.8，培養條件:溫度為25±2°C，黑暗。待種子萌發后，幼苗成活率為50%。
[0040]步驟(5):幼苗繼代、擴繁和雜種檢測
[0041]種子萌發長出真葉后生長30天利用帶有2枚真葉的單芽莖段進行繼代，繼代培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂組成，蔗糖、瓊脂的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL,pH為5.8 ;利用附帶腋芽的莖段進行擴繁，擴繁培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L, pH為5.8。利用擴繁得到的幼苗進行雜種檢測，組培幼苗具有4片真葉時，采用RAPD多態性擴增以及流式細胞進行檢測(圖1，圖2，圖3，圖4，圖5)。
[0042]步驟(6):單倍體雜種加倍
[0043]將檢測為單倍體真雜種的幼苗利用添加秋水仙素的液體培養基進行加倍。以雜種的莖段作為外植體，液體培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、α -萘乙酸(NAA)組成，蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、ΝΑΑ 的質量體積比分別為 0.03g/mL,0.008g/mL、2mg/L，0.lmg/L，pH為 5.8 ;秋水仙素終濃度為100mg/L。在28°C，150rpm條件下振蕩培養兩天。處理12個外植體，處理完畢后的外植體用無菌水沖洗干凈后轉移到不含秋水仙素的培養基上培養誘導芽，誘芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，pH為5.8。共獲得11個腋芽，腋芽生長20天后切下轉移到1/2MS培養基上生長，幼苗具有4片真葉時利用流式細胞術進行倍性的鑒定利用流式細胞術檢測加倍效果，獲得2株加倍成功的材料(圖4，圖5)。
[0044]步驟(7):幼苗的生根和移栽
[0045]待長出4~5片葉子時轉移至生根培養基上生根，生根培養基由1/2MS、蔗糖、瓊月旨、NAA組成，蔗糖、瓊脂、NAA的質量體積比分別為0.03g/mL、0.008g/mL、0.lmg/L, pH為
5.8。當生根后的幼苗的平均根長大于2厘米時，幼苗的根系已經足夠健壯，此時將其從培養瓶中取出，輕輕沖洗掉根部的培養基并移栽至營養缽中，可在幼苗上方覆蓋薄膜并適當遮蔭以保持濕度，3天后開始逐漸揭開薄膜使幼苗適應外界環境。
[0046]步驟(8):蕓薹屬三基因組異源六倍體蔬菜新種質的分子、細胞及形態特征[0047]三基因組異源六倍體蔬菜種質包含兩雜交親本榨菜和紫甘藍全部的基因組DNA，其染色體DNA相對含量等于榨菜與紫甘藍DNA相對含量之和，并同時具有榨菜和紫甘藍的DNA多態性擴增產物。并且其形態學與兩雜交親本相比較，表現出特有的植物學特征，表現為莖色為淡紫色、莖的著生方式為短縮莖，葉片呈卵圓形、較厚，表面無刺毛、無蠟質層，葉緣呈波狀(圖6，圖7，圖8，表1)。
[0048]表1:異源六倍體及其親本的植物形態學比較
[0049]
【權利要求】
1.一種榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質，其特征在于，三基因組異源六倍體蔬菜種質包含兩雜交親本榨菜和紫甘藍全部的基因組DNA，其染色體DNA相對含量等于榨菜與紫甘藍DNA相對含量之和，并同時具有榨菜和紫甘藍的多態性擴增產物；并且其形態學與兩雜交親本相比較，表現出特有的植物學特征，表現為莖色為淡紫色、莖的著生方式為短縮莖，葉片呈卵圓形、較厚，表面無刺毛、無蠟質層，葉緣呈波狀。
2.—種上述榨菜與紫甘藍三基因組異源六倍體蔬菜種質的獲取方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)蕓薹屬榨菜作為母本，蕓薹屬紫甘藍作為父本進行有性雜交，授粉7天后摘取子房；所述授粉為連續兩天重復授粉兩次； (2)將子房消毒并沖洗； (3)將子房置于鋪有用濃度為0.03 g/mL的蔗糖溶液充分浸泡過的濾紙的培養皿上，剖開子房一端后沿腹縫線撕開，將胚珠連同胚柄及與胚柄相連的子房壁組織一同切下并接種到發育培養基上；于25±2° C黑暗條件下培養24h，再光照條件下培養40天，光照強度為.40 μ mo I.π2 光照時間為12小時/天；所述發育培養基由MS (Murashige & Skoog)、蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭和水組成，蔗糖、瓊脂、谷氨酰胺、活性炭的質量濃度分別為.0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.0004 g/mL、0.002g/mL,余量為水，pH 為 5.8 (4)將成熟種子摘下接種于發芽培養基上于25±2°C黑暗條件下培養；所述發芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-芐氨基嘌呤(6-ΒΑ)和水組成，蔗糖、瓊脂、6-芐氨基嘌呤的質量濃度分別為 0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量為水，pH 為 5.8 ; (5)在種子萌發后30天將幼苗先轉移到繼代培養基、擴繁培養基上繼代擴繁，培養條件為溫度為25 土 2。C、光照強度為80 1111101*111_2*8_1、光照時間為12小時/天；所述繼代培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂和水組成，蔗糖、瓊脂的質量含量分別為0.03 g/mL,0.008 g/mL，余量為水，pH為5.8 ;繼代所采用的外植體為帶2枚真葉的單芽莖段；所述擴繁培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA和水組成，蔗糖、瓊脂、6-BA的質量濃度分別為0.03 g/mL,0.008g/mL,0.2 mg/L，余量為水，pH為5.8 ;擴繁所采用的外植體為附帶腋芽的莖段； (6)組培幼苗具有4片真葉時，對其幼嫩葉片進行RAPD(隨機擴增的多態性DNA)多態性分析及流式細胞鑒定，獲得榨菜與紫甘藍種間真雜種； (7)對鑒定為真雜種的幼苗進行加倍處理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液體培養基對單倍體莖段進行振蕩培養，28° C，150 rpm振蕩培養兩天；所述的加倍液體培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸(NAA)和水組成，蔗糖、瓊脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸的質量濃度分別為0.03 g/mL,0.008 g/mL,2 mg/L、0.I mg/L，余量為水，pH為5.8 ;秋水仙素終濃度為100 mg/L ； (8)處理完畢后的外植體用無菌水沖洗干凈后轉移到不含秋水仙素的誘導芽培養基上培養誘導腋芽的產生，腋芽生長20天后切下轉移到1/2MS培養基上生長，幼苗具有4片真葉時利用流式細胞術進行倍性的鑒定；所述誘導芽培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、6-BA和水組成，鹿糖、瓊脂、6-BA的質量濃度分別為0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L,余量為水,pH為5.8 (9)將加倍成功的幼苗移到生根培養基上進行生根培養，將生根后的幼苗取出，移栽至裝有基質的營養缽中煉苗，煉苗時，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗3天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應外界環境；最終獲得蕓薹屬三基因組異源六倍體蔬菜新種質；所述生根培養基由1/2MS、蔗糖、瓊脂、NAA和水組成，蔗糖、瓊脂、NAA的質量體積比分別為0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.1 mg/L，余量 為水，pH 為 5.8。
【文檔編號】A01H1/08GK103651111SQ201310688744
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】陳利萍, 李俊星, 饒琳莉 申請人:浙江大學