一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，該方法采用將山葵種子消毒后，依次用5-氨基尿嘧啶和丙二醇、胺磺靈和戊炔草胺、秋水仙素和富民隆的混合溶液進行培養，可使所得到的多倍體種子培育的多倍體幼苗的回復突變率有效降低，本發明為山葵優良品種的快速培育提供了一條新途徑。
【專利說明】一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種山葵植物的組織培養方法，特別是涉及一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法。
【背景技術】
[0002]山葵(Wasabi japonica Matsum)又名山箭菜，為十字花科多年生草本半陰生植物。
[0003]山葵植物的繁殖多采用分株繁殖和種子繁殖。分株繁殖不僅存在多代營養繁殖后品種退化嚴重的問題，而且還存在繁殖系數低、種苗帶菌嚴重等問題，極易導致病害大面積發生。目前山葵資源十分稀少，遠遠不能滿足市場需求，所以有必要培育出優質的山葵新品種。多倍體植物具有器官巨大性的特點，并且由于細胞染色體加倍，染色體上基因調控有效化學成分含量也往往較正常二倍體高，因此開展山葵植物多倍體誘導對于提高其產量和質量具有重要的作用。
[0004]從現有多倍體誘導研究中發現，多倍體誘導過程中易出現嵌合體，嵌合體植物主要是由二倍體和多倍體細胞組成，由于嵌合體植物隨著培養時間的增長，其植物多倍體“巨大性”特征極不穩定，常表現出不同程度的回復突變情況。這主要是由于未加倍的二倍體細胞分裂速度比誘導后的多倍體細胞分裂速度快，因此在嵌合體植物生長過程中，二倍體細胞最終可能會把多倍體細胞“淹沒”，從而出現誘導的多倍體植物又回復變成二倍體，最終導致植物多倍體誘導的失敗。
[0005]針對上述問題，有必要提出一種能有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，由此引出了本發明方案。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法。
[0007]本發明提供的可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法包括如下步驟:
[0008](I)取山葵種子，先用0.01%~0.07%的過氧乙酸消毒10~30min，再用無菌水清洗后，置于3~10°C的條件下保存10~15天；
[0009](2)將經低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養10~24h，培養溫度為5~9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為
0.5~2.5mmol.T的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.T的丙二醇溶液按體積比 1: (0.95 ~1.05)配制；
[0010](3)將培養后的山葵種子用無菌水清洗后，置于12~18°C的條件下培養5~9h，再轉放在浸有胺磺靈和戊炔草胺混合溶液的濾紙上培養3~10h，培養溫度為4~10°C，光照強度為2000~30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~IOOumol.T的胺磺靈溶液和濃度為20~50umo`l.T的戊炔草胺溶液按體積比1: (0.95~1.05)配制；[0011](4)將步驟(3)培養的種子用無菌水清洗后，轉放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4~15°C的條件下進行誘導培養，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制；
[0012](5)將誘導培養2~5天的種子轉放在只有無菌水的濾紙上，在溫度為8~18°C、光照強度為25001x~30001x、光照8~12h的條件下使其萌發生長；
[0013](6)選取已萌發出胚根的多倍體種子，將其置于育苗盤中進行25~35天的多倍體幼苗的培育生長，統計山葵多倍體幼苗的回復突變率。
[0014]進一步地，步驟(2)中所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~
2.5mmol.l-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:1配制。
[0015]進一步地，步驟(3)中所述胺磺靈和戍炔草胺混合溶液由濃度為50~lOOumol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制。
[0016]進一步地，步驟(4)中所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:1配制。
[0017]本發明能有效地降低山葵植物在多倍體誘導中的回復突變率，可確保誘導的山葵多倍體植物的遺傳物質的穩定性，為山葵優良品種的快速培育提供了一條新途徑。
[0018]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020](I)選取當年生飽滿的山葵種子，先用0.01%的過氧乙酸消毒lOmin，再用無菌水清洗2次，然后置于3°C的低溫條件下保存10天；
[0021](2)將經低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養10h，培養溫度為5°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:0.95配制；
[0022](3)將培養后的山葵種子用無菌水清洗2次后，置于12°C的條件下用無菌水進行恢復培養5h,再轉放在浸有胺磺靈溶液和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養3h,培養溫度為4°C，光照強度為20001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50umol.L-1的胺磺靈溶液和濃度為20umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:0.95配制；
[0023](4)將步驟(3)培養的種子用無菌水清洗清洗2次后，轉放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4°C的條件下誘導培養2~5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2%的秋水仙素溶液和濃度為0.03%的富民隆溶液按體積比1:0.95配制；
[0024](5)將經誘導培養的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發生長，培養條件為:溫度8°C、光照強度25001x、光照8h ；
[0025](6)選取步驟(5)中已萌發出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強度為25001x的條件下培養25天，觀察到山葵多倍體幼苗生長健康，統計山葵多倍體幼苗的回復突變率為31.54%。[0026]實施例2
[0027](1)選取當年生飽滿的山葵種子，先用0.04%的過氧乙酸消毒20min，再用無菌水清洗3次，然后置于6°C的低溫條件下保存12天；
[0028](2)將經低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養18h，培養溫度為8°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為1.5mmol.L—1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.5mol.L_1的丙二醇溶液按體積比1:1配制；
[0029](3)將培養后的山葵種子用無菌水清洗3次后，置于15°C的條件下用無菌水進行恢復培養7h,再轉放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養7h,培養溫度為6°C,光照強度為25001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為70umol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為40umol.L_1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制；
[0030](4)將步驟(3)培養的種子用無菌水清洗清洗4次后，轉放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和8°C的條件下誘導培養4天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.6%的秋水仙素溶液和濃度為0.05%的富民隆溶液按體積比1:1配制；
[0031](5)將誘導培養后的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發生長，培養條件為:溫度15°C、光照強度28001x、光照IOh ；
[0032](6)選取步驟(5)中已萌發出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強度為25001x的條件下培養25天，觀察到山葵多倍體幼苗生長健康， 統計山葵多倍體幼苗的回復突變率為15.54%。
[0033]實施例3
[0034](I)選取當年生飽滿的山葵種子，先用0.07%的過氧乙酸消毒30min，再用無菌水清洗5次，然后置于10°C的低溫條件下保存15天；
[0035](2)將經低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養24h，培養溫度為9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為2.5mmol.L_1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.7mol.L_1的丙二醇溶液按體積比1: 1.05配制；
[0036](3)將培養后的山葵種子用無菌水清洗5次后，置于18°C的條件下用無菌水進行恢復培養9h,再轉放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養IOh,培養溫度為10°C，光照強度為30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為lOOumol.L_1的胺磺靈溶液和濃度為50umol.L_1的戊炔草胺溶液按體積比1: 1.05配制；
[0037](4)將步驟(3)培養的種子用無菌水清洗清洗3次后，轉放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和15°C的條件下誘導培養5天，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.08%的富民隆溶液按體積比1: 1.05配制；
[0038](5)將誘導培養后的種子取出，放在只有無菌水的濾紙上萌發生長，培養條件為:溫度18°C、光照強度30001x、光照12h ；
[0039](6)選取步驟(5)中已萌發出胚根的多倍體種子，將其播種于育苗盤中，每穴3粒種子，在溫度為20°C、每天光照12h和光照強度為25001x的條件下培養32天，統計山葵多倍體幼苗的回復突變率為12.16%，但觀察發現山葵多倍體幼苗生長緩慢。
[0040]實施例4
[0041]將實施例2步驟(3)中所述胺磺靈溶液的濃度改為50umol.L—1，其它步驟同實施例2，培養后統計恢復突變率為22.43%。
[0042]實施例6
[0043]將實施例2步驟(4)中秋水仙素的濃度改為0.3%，富民隆溶液的濃度改為0.04%,其它步驟同實施例2，培養后統計恢復突變率為26.17%。
[0044]比較實施例1
[0045]取消實施例2的步驟(2)，其它步驟同實施例2，培養后統計回復突變率為49.15%。
[0046]比較實施例2[0047]取消實施例2的步驟(3)，其它步驟同實施例2，培養后統計回復突變率為53.01%。
[0048]比較實施例3
[0049]在實施例2步驟(4)中，改為只采用濃度為0.6%的秋水仙素溶液，不用富民隆溶液，其它步驟同實施例(2)，培養后統計回復突變率為40.23%。
[0050]比較實施例4
[0051]取消實施例2的步驟(2)和步驟(3)，其它步驟同實施例2，培養后統計回復突變率為 78%ο
【權利要求】
1.一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取山葵種子，先用0.01%~0.07%的過氧乙酸消毒10~30min，再用無菌水清洗后，置于3~10°C的條件下保存10~15天； (2)將經低溫保存的山葵種子，放在浸有5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液的濾紙上培養10~24h，培養溫度為5~9°C，所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~2.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制； (3)將培養后的山葵種子用無菌水清洗后，置于12~18°C的條件下培養5~9h，再轉放在浸有胺磺靈和戍炔草胺混合溶液的濾紙上培養3~IOh,培養溫度為4~10°C,光照強度為2000~30001x，所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~IOOumol.1/1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1: (0.95~1.05)配制； (4)將步驟(3)培養的種子用無菌水清洗后，轉放在浸有秋水仙素和富民隆混合溶液的濾紙上，在無光照和4~15°C的條件下進行誘導培養，所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:(0.95 ~1.05)配制； (5)將誘導培養2~5天的種子轉放在只有無菌水的濾紙上，在溫度為8~18°C、光照強度為25001x~30001x、光照8~12h的條件下使其萌發生長； (6)選取已萌發出胚根的多倍體種子，將其置于育苗盤中進行25~35天的多倍體幼苗的培育生長，統計山葵多倍體幼苗的回復突變率。
2.根據權利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，其特征在于:步驟(2)中所述5-氨基尿嘧啶和丙二醇混合溶液由濃度為0.5~2.5mmol.L-1的5-氨基尿嘧啶溶液和濃度為0.3~0.7mol.L-1的丙二醇溶液按體積比1:1配制。
3.根據權利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，其特征在于:步驟(3)中所述胺磺靈和戊炔草胺混合溶液由濃度為50~lOOumol.L—1的胺磺靈溶液和濃度為20~50umol.L-1的戊炔草胺溶液按體積比1:1配制。
4.根據權利要求1所述的一種可有效降低山葵多倍體植物回復突變率的培養方法，其特征在于:步驟(4)中所述秋水仙素和富民隆混合溶液由濃度為0.2~0.8%的秋水仙素溶液和濃度為0.03~0.08%的富民隆溶液按體積比1:1配制。
【文檔編號】A01H4/00GK103704137SQ201310722658
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】王躍華, 孫雁霞, 段茂華, 任三軍, 陳傳鳳, 彭雙, 嚴幸林, 梅英, 徐恩琴, 唐鳳如, 宋超, 劉銀花, 唐川 申請人:成都大學