一種防治褐飛虱的混合配方制劑制備方法
【專利摘要】本發明涉及生物防治【技術領域】，特別是涉及一種臍孢木霉菌（Trichodermabrevicompactum）0248代謝產物和吡蟲啉混合配方制劑。本發明所述的臍孢木霉菌，定名為臍孢木霉菌0248。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCCNo.6985。本發明所述的臍孢木霉菌0248，經發酵提取可獲得對褐飛虱類酵母共生菌具有抑制作用的代謝產物。本發明最顯著的特征是將臍孢木霉菌0248代謝產物和常規殺蟲劑吡蟲啉按照一定的比例混合制備成新的配方，用這混合配方防治褐飛虱可以明顯減少殺蟲劑的使用量，有效提高褐飛虱的防治效果，延緩褐飛虱抗藥性的發展。
【專利說明】一種防治褐飛虱的混合配方制劑制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物防治【技術領域】，特別是涉及臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方制劑的應用。
【背景技術】
[0002]褐飛風lugens StU)是水稻的重要害蟲之一,主要以刺吸韌皮部汁液和傳播水稻病毒的方式為害水稻植株。蟲害大發生時會出現大面積的稻株枯死倒伏，造成糧食減產，甚至絕收。生產上，化學農藥是防治褐飛虱的主要手段。但是，由于化學殺蟲劑的大量頻繁使用，褐飛虱對許多化學殺蟲劑產生了抗藥性，導致防治效果明顯下降。因此，研究和應用減少水稻褐飛虱發生和為害的新手段已迫在眉睫。
[0003]昆蟲與微生物的共生是一種普遍存在的現象，在進化過程中兩者形成了密不可分的關系。昆蟲為共生菌提供了穩定的小生境和營養，而昆蟲依靠共生菌合成食物中缺乏的某些重要營養成分，同時共生菌對昆蟲的代謝解毒也有一定作用，如為昆蟲合成重要的營養成分，參與氮素循環，降解昆蟲體內外源物質等。缺失共生菌會直接造成昆蟲生長繁殖受阻、死亡率上升等。研究表明，褐飛虱體內腹部脂肪體中也存在多種類酵母共生菌，類酵母菌屬子囊菌亞門焊,核菌綱(Pyrenomycetes) ,Candida屬。褐飛風類酵母共生菌可為寄主合成提供必需氨基酸、固醇類物質以及蛋白質等多種營養成分，彌補了褐飛虱取食營養結構的不平衡，保證了褐飛虱的正常生長和繁殖；酵母類共生菌缺失會導致褐飛虱生長受阻、發育停滯、甚至死亡。既然褐飛虱與類酵母共生菌在生長繁殖中關系如此緊密，通過“抑制類酵母共生菌從而間接防治褐飛虱”的手段來控制褐飛虱發生以及減少其為害必將是今后防治褐飛 虱的一種重要手段。因為抑制褐飛虱體內的共生菌不但可直接或間接的達到控制褐飛虱的目的，而且還可有效提高目前殺蟲劑的防治效果、延緩褐飛虱抗藥性的發展。

【發明內容】

[0004]本發明將胳抱木霉菌brevicompacturn) 0248代謝產物和常規殺蟲劑吡蟲啉按照一定的比例混合制備成新的配方，并研究了該配方對褐飛虱體內類酵母共生菌的抑制作用和對褐飛虱的殺蟲效果。該發明為水稻褐飛虱的有效防治提供了新的方法。
[0005]本發明的目的是針對褐飛虱對常規化學殺蟲劑產生抗藥性，導致化學防治效果明顯下降的不足，提供一種利用臍孢木霉菌0248代謝產物抑制褐飛虱體內類酵母共生菌生長，進而引起褐飛虱死亡的新思路；本發明的另一目的是提供了一種防治褐飛虱的新方法和新藥劑。
[0006]本發明臍孢木霉菌定名為臍孢木霉菌0248。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC N0.6985。
[0007]本發明所述的臍孢木霉菌0248，經發酵可獲得對褐飛虱類酵母共生菌具有抑制作用的代謝產物。
[0008]本發明目的通過以下技術方案來實現:
臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方制劑在防治褐飛虱中的應用，按以下步驟進行:
(O菌種的活化培養:將分離保存的臍孢木霉菌0248菌種移至馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)平板上，在28°C ± 1°C條件下，培養至培養皿長滿綠色孢子，加入IOml無菌水，用涂布棒輕輕刮，洗下的孢子液用無菌濾紙過濾，得到孢子懸液，并用血細胞技術板計數使孢子懸液濃度為1.0X IO6個/ml ；
(2)發酵培養:發酵培養液為每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶裝發酵培養液60ml ;配制后立即1211:滅菌201^11，待冷卻至401:在無菌條件下接種濃度為1.0X IO6個/ml的孢子懸液lml，在28°C ±2°C條件下，培養3天；
(3)發酵代謝產物收集:發酵完畢，離心，棄菌絲體，收集發酵液，此發酵液即為臍孢木霉菌0248代謝產物；
(4)藥液配制:將步驟(4)獲得的臍孢木霉菌0248代謝產物和常規殺蟲劑配比，用于褐飛虱的防治。
[0009]本發明的有益效果:本發明提供了一種利用臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方防治褐飛虱的新方法。
【具體實施方式】
[0010]實施例1:(臍孢木霉菌0248代謝產物的制備)
按以下步驟進行:
(O菌種的活化培養:將分離保存的臍孢木霉菌0248菌種移至馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)平板上，在28°C ±1°C條件下，培養96h，至培養皿長滿綠色孢子，加入IOml無菌水，用涂布棒輕輕刮，洗下的孢子液用無菌濾紙過濾，得到無菌絲體孢子懸液，并用血細胞技術板計數使孢子懸液濃度為1.0X IO6個/ml ；
(3)發酵培養:發酵培養液為每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶裝發酵培養液60ml ;配制后立即1211:滅菌201^11，待冷卻至401:在無菌條件下接種濃度為1.0X IO6個/ml的孢子懸液lml，在28°C ±2°C條件下，培養3天；
(4)發酵物代謝產物收集:發酵完畢,收集發酵液,此發酵液即為臍孢木霉菌0248代謝產物；
實施例2:(臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方的制備)
吡蟲啉水分散粒劑(有效成分質量百分比為70 %)由拜耳公司生產，將吡蟲啉水分散粒劑用自來水溶解，配成濃度為0.01g/L吡蟲啉藥液，而后與臍孢木霉菌0248代謝產物等體積混合,制備成吡蟲啉和臍孢木霉菌0248代謝產物混合配方(以下內容中稱“產品A”)。濃度為0.01g/L吡蟲啉藥液與臍孢木霉菌0248代謝產物以1:2體積比混合，制備成另一種吡蟲啉和臍孢木霉菌0248代謝產物混合配方(以下內容中稱“產品B”)。
[0011]實施例3:(臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方在防治褐飛虱若蟲中的應用)
按以下步驟進行:(O分蘗拔節期TNl水稻，清除部分根和基部葉鞘后洗凈，自然晾干；
(2)以清水作對照，分別噴施實施例2制備的“產品A”和“產品B”，要求藥液霧滴分布均勻，覆蓋率高，藥液量適當，以濕潤目標物表面不產生流失為宜，自然晾干；
(3)經步驟(2)處理后的稻苗放入事先注入20ml水稻培養液的大試管中，每管3根稻苗，接入3齡褐飛虱若蟲30頭，以噴施清水后的水稻苗處理作為陰性對照，噴施0.04g/L吡蟲啉藥液處理為陽性對照，每個處理3次重復；
(4)分別在處理后I天，2天和4天測定褐飛虱體內共生菌數量，并統計褐飛虱死亡率。其中褐飛虱體內共生菌數量測定方法為:分別取各處理中存活的褐飛虱3頭，用75%的酒精消毒，無菌水漂洗，去掉翅膀、頭部和胸部，將腹部放入1.5ml離心管中，加入0.9%的生理鹽水50 μ 1， 勻漿，然后取2 μ I勻漿液滴于血細胞計數板上，蓋上蓋破片，在顯微鏡(16X40)下統計共生菌數量。
[0012]實施例4:(臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合配方在防治褐飛虱雌成蟲中的應用)
按以下步驟進行:
(1)分蘗拔節期TNl水稻，清除部分根和基部葉鞘后洗凈，自然晾干；
(2)以清水作對照，分別噴施實施例2制備的“產品Α”和“產品B”，，要求藥液霧滴分布均勻，覆蓋率高， 藥液量適當，以濕潤目標物表面不產生流失為宜，自然晾干；
(3)經步驟(2)處理后的稻苗放入事先注入20ml水稻培養液的大試管中，每管4根稻苗，接入剛羽化的短翅雌成蟲30頭，以噴施清水后的水稻苗處理作為陰性對照，噴施
0.08g/L吡蟲啉藥液處理為陽性對照，每個處理3次重復；
(4)分別在處理后I天，2天和4天測定短翅雌蟲褐飛虱體內共生菌數量，并統計褐飛虱死亡率。其中褐飛虱體內共生菌數量測定方法為:分別取各處理中存活的短翅雌蟲3頭，用75%的酒精消毒，無菌水漂洗，去掉翅膀、頭部和胸部，將腹部放入1.5ml離心管中，加入
0.9%的生理鹽水50μ 1，勻衆，然后取2μ I勻漿液滴于血細胞計數板上，蓋上蓋破片，在顯微鏡(16 X 40 )下統計共生菌數量。
[0013]試驗例:(本發明的產品與常規農藥防治效果對比試驗)
試驗結果見表1和表2。從表1和表2看出，利用產品A和產品B均明顯抑制了褐飛虱體內共生菌的數量,從而引起褐飛虱死亡率上升。
[0014]表1臍孢木霉菌0248代謝產物和吡蟲啉混合藥液對褐飛虱若蟲的防治效果
【權利要求】
1.一種防治褐飛虱的混合配方制劑制備方法，這種混合配方制劑包含臍孢木霉菌 0248代謝產物和吡蟲啉。
2.權利要求1所述的混合配方制劑，其中所述的臍孢木霉菌0248代謝產物由菌種活化培養、發酵培養、發酵代謝產物收集方法制得。
3.權利要求1所述的混合配方制劑，其中所述的臍孢木霉菌0248代謝產物和0.01g/L吡蟲啉藥液的體積比為1:1-2:1。
4.權利要求1所述的混合配方制劑，由以下方法獲得: (O菌種的活化培養:將分離保存的臍孢木霉菌0248菌種移至馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)平板上，在28°C ±1°C條件下，活化培養至培養皿長滿綠色孢子，加入IOml無菌水，用涂布棒輕輕刮，洗下的孢子液用無菌濾紙過濾，得到孢子懸液，并用血細胞技術板計數使孢子懸液濃度為1.0X IO6個/ml，所述的臍孢木霉菌0248已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC N0.6985 ； (2)發酵培養:發酵培養液為每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶裝發酵培養液60ml ;配制后立即121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下接種濃度為1.0X IO6個/ml的孢子懸液lml，在28°C ±2°C條件下，培養3天； (3)發酵代謝產物收集:發酵完畢，離心，棄菌絲體，收集發酵液，此發酵液即為臍孢木霉菌0248代謝產物； (4)藥液配制:將步驟(4)獲得的臍孢木霉菌0248代謝產物和常規殺蟲劑配比，用于褐飛虱的防治。
【文檔編號】A01N63/04GK103975957SQ201410191331
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】俞曉平, 申屠旭萍, 李丹婷, 郝培應, 許益鵬, 馬正, 王正亮 申請人:中國計量學院