胡桃楸誘導不定芽的方法
【專利摘要】本發明及一種胡桃楸誘導不定芽的方法，(1)外植體的選擇、(2)合子胚消毒、(3)合子胚預培養、(4)不定芽外植體的選擇、(5)誘導和分化。本發明簡單方便、快速有效，能在短時間內繁殖出大批的組培苗，能夠為以后培育出優良無性系植株做好基礎，有效地保護和繁殖國家瀕危樹種存在的危機狀態，為今后更進一步保護和利用該物種奠定良好基礎。
【專利說明】胡桃楸誘導不定芽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及林業生物技術中胡桃楸種苗快繁生產技術。
【背景技術】
[0002]目前,胡桃楸(Juglans mandshurica Max im.)隸屬于胡桃科核桃屬，是東北林區三大硬闊樹種之一，其材質堅硬致密，紋理通直美觀，未成熟外果皮、根(枝)皮、外殼及葉片均可入藥，用途廣泛，經濟價值極高。由于長期的過度采伐，致使其資源已近瀕危，遠遠不能滿足國內外市場經濟發展和醫學等領域的需要。常規條件下，胡桃楸種子屬于休眠性，繁殖速度緩慢，效率低，周期長。
[0003]關于胡桃楸的組織培養，由于初接種污染率高，外植體萌發較難，離體培養物褐化、退化嚴重，增殖系數低等問題一直未能得到很好解決，迄今未在生產上廣泛應用。目前，以胡桃楸的未成熟胚為外植體進行體細胞胚胎發生已成功誘導出體細胞胚(王彥清等2000;張建瑛等2010)，未見完整植株。以胡桃楸休眠枝條進行無性繁殖(周宇等2001，張建琪等2011),無性繁殖效果未見成效。

【發明內容】

[0004]本發明的目 的在于克服上述技術中存在的不足之處，提供一種通過選擇合適的外植體，再經植物生長調節劑處理，在合適的條件下培養，而誘導出胡桃楸叢生芽，叢生芽經過分株后再接種于誘導培養基上培養獲得大量不定芽。
[0005]為了達到上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0006](I)外植體的選擇
[0007]每年8-10月份采取成熟的胡桃楸種子，經清水洗滌、在陽光下晾曬將胡桃楸外表皮去除掉，放置溫度20-25°C條件下干燥、通風處備用，用錘子將外殼打碎，取胡桃楸種子尖部那端帶少量子葉的合子胚，
[0008](2)合子胚消毒
[0009]先用70%乙醇浸潤30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分鐘,用無菌水沖洗5-7次，然后在無菌水中浸泡2-4小時，備用，
[0010](3)合子胚預培養
[0011]在無菌水中浸2-7小時后，將消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接種于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培養基中培養，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度24_26°C，光照時間16h/d，光照強度20001x，培養25-30天，
[0012](4)不定芽外植體的選擇
[0013]待培養后的胡桃楸合子胚基部子葉張開，發育成帶不同個數腋芽的小植株后，將胡桃楸植株基部存在的子葉掰掉，用鑷子夾緊植株莖段，用無菌剪刀將胡桃楸植株從基部處開始剪成1.0-2.0cm左右各帶不同腋芽的莖段，作為不定芽誘導分化的外植體，
[0014](5)誘導和分化[0015]將外植體接種在不定芽誘導培養基中，培養基為DKW培養基附加激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同時附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度為25-27°C、光照時間16h/d，光照強度1000-20001 x,培養7_8天后外植體基部切口處邊緣出現綠色芽點，培養15-20天獲得不定芽。
[0016]本發明的優點是:
[0017]本發明簡單方便、快速有效，能在短時間內繁殖出大批的組培苗，能夠為以后培育出優良無性系植株做好基礎，有效地保護和繁殖國家瀕危樹種存在的危機狀態，為今后更進一步保護和利用該物種奠定良好基礎。
[0018]本發明提供了胡桃楸誘導不定芽的方法，此方法效率高，繁殖速度快，平均出芽率較高，不定芽誘導率達90.6%，增殖倍數在7.5左右。本發明證實進行胡桃楸種苗的快繁可以不必通過種子育苗法和嫁接法，從而節約了時間，解除了時間限制而且繁殖效率大大提高，可以快速為胡桃楸經濟林的建設提供充足的種苗；同時，這種高效的無性繁殖方法為胡桃楸的分子改良特別是轉基因技術提供了很好的基礎。
【具體實施方式】
[0019]下面結合對本發明的實施例作進一步詳細描述。
[0020]實施例1、
[0021](I)外植體的選擇
[0022]每年8月份采取成熟的胡桃楸種子，經清水洗滌、在陽光下晾曬將胡桃楸外表皮去除掉，放置溫度20°C條件下干燥、通風處備用，用錘子將外殼打碎，取胡桃楸種子尖部那端帶少量子葉的合子胚，
[0023](2)合子胚消毒
[0024]先用70%乙醇浸潤30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分鐘,用無菌水沖洗5次,然后在無菌水中浸泡2小時,備用，
[0025](3)合子胚預培養
[0026]在無菌水中浸2小時后，將消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接種于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培養基中培養，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度24°C，光照時間16h/d，光照強度20001x，培養25天，
[0027](4)不定芽外植體的選擇
[0028]待培養后的胡桃楸合子胚基部子葉張開，發育成帶不同個數腋芽的小植株后，將胡桃楸植株基部存在的子葉掰掉，用鑷子夾緊植株莖段，用無菌剪刀將胡桃楸植株從基部處開始剪成1.0cm左右各帶不同腋芽的莖段，作為不定芽誘導分化的外植體，
[0029](5)誘導和分化
[0030]將外植體接種在不定芽誘導培養基中，培養基為DKW培養基附加激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及I BA0.01mg/L,同時附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度為25°C、光照時間16h/d，光照強度ΙΟΟΟΙχ，培養7-8天后外植體基部切口處邊緣出現綠色芽點，培養15天獲得誘導芽，
[0031]實施例2、
[0032](I)外植體的選擇[0033]每年9月份采取成熟的胡桃楸種子，經清水洗滌、在陽光下晾曬將胡桃楸外表皮去除掉，放置溫度23°C條件下干燥、通風處備用，用錘子將外殼打碎，取胡桃楸種子尖部那端帶少量子葉的合子胚，
[0034](2)合子胚消毒
[0035]先用70%乙醇浸潤30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分鐘,用無菌水沖洗6次,然后在無菌水中浸泡3小時,備用，
[0036](3)合子胚預培養
[0037]在無菌水中浸4小時后，將消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接種于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培養基中培養，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度25°C，光照時間16h/d，光照強度20001x，培養27天，
[0038](4)不定芽外植體的選擇
[0039]待培養后的胡桃楸合子胚基部子葉張開，發育成帶不同個數腋芽的小植株后，將胡桃楸植 株基部存在的子葉掰掉，用鑷子夾緊植株莖段，用無菌剪刀將胡桃楸植株從基部處開始剪成1.5cm左右各帶不同腋芽的莖段，作為不定芽誘導分化的外植體，
[0040](5)誘導和分化
[0041 ] 將外植體接種在不定芽誘導培養基中，培養基為DKW培養基附加激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同時附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度為26°C、光照時間16h/d，光照強度15001X，培養8天后外植體基部切口處邊緣出現綠色芽點，培養15-20天獲得誘導芽。
[0042]實施例3、
[0043](I)外植體的選擇
[0044]每年10月份采取成熟的胡桃楸種子，經清水洗滌、在陽光下晾曬將胡桃楸外表皮去除掉，放置溫度25°C條件下干燥、通風處備用，用錘子將外殼打碎，取胡桃楸種子尖部那端帶少量子葉的合子胚，
[0045](2)合子胚消毒
[0046]先用70%乙醇浸潤30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分鐘,用無菌水沖洗7次,然后在無菌水中浸泡4小時,備用，
[0047](3)合子胚預培養
[0048]在無菌水中浸7小時后，將消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接種于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培養基中培養，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度26°C，光照時間16h/d，光照強度20001x，培養30天，
[0049](4)不定芽外植體的選擇
[0050]待培養后的胡桃楸合子胚基部子葉張開，發育成帶不同個數腋芽的小植株后，將胡桃楸植株基部存在的子葉掰掉，用鑷子夾緊植株莖段，用無菌剪刀將胡桃楸植株從基部處開始剪成2.0cm左右各帶不同腋芽的莖段，作為不定芽誘導分化的外植體，
[0051](5)誘導和分化
[0052]將外植體接種在不定芽誘導培養基中，培養基為DKW培養基附加激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同時附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度為27°C、光照時間16h/d，光照強度20001x，培養8天后外植體基部切口處邊緣出現綠色芽點，培養20天 獲得誘導芽。
【權利要求】
1.一種胡桃楸誘導不定芽的方法，其特征在于: (1)外植體的選擇 每年8-10月份采取成熟的胡桃楸種子，經清水洗滌、在陽光下晾曬將胡桃楸外表皮去除掉，放置溫度20-25°C條件下干燥、通風處備用，用錘子將外殼打碎，取胡桃楸種子尖部那端帶少量子葉的合子胚， (2)合子胚消毒 先用70%乙醇浸潤30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分鐘,用無菌水沖洗5-7次,然后在無菌水中浸泡2-4小時,備用， (3)合子胚預培養 在無菌水中浸2-7小時后，將消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接種于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培養基中培養，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度24_26°C，光照時間16h/d，光照強度20001x，培養25-30天， (4)不定芽外植體的選擇 待培養后的胡桃楸合子胚基部子葉張開，發育成帶不同個數腋芽的小植株后，將胡桃楸植株基部存在的子葉掰掉，用鑷子夾緊植株莖段，用無菌剪刀將胡桃楸植株從基部處開始剪成1.0-2.0cm左右各帶不同腋芽的莖段，作為不定芽誘導分化的外植體， (5)誘導和分化 將外植體接種在不定芽誘導培養基中，培養基為DKW培養基附加激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同時附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，培養溫度為25-27°C、光照時間16h/d，光照強度1000-20001 x,培養7_8天后外植體基部切口處邊緣出現綠色芽點，培養15-20天獲得誘導叢生芽，叢生芽經過分株后再接種于培養基上培養后獲得大量不定芽。
【文檔編號】A01H4/00GK103960130SQ201410195477
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月9日 優先權日:2014年5月9日
【發明者】張建瑛, 祁永會, 呂躍東, 劉建明, 邢亞娟, 田新華, 李京 申請人:黑龍江省林業科學研究所