以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明提供一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，包括以下步驟：香樟胚培苗無性系EL6組培苗的莖切段置于不定芽誘導培養基S1上進行預培養；將預培養后的香樟莖切段作為轉化受體材料置于農桿菌侵染液中進行侵染；將侵染后的外植體用無菌濾紙吸去多余菌液，轉入共培養培養基中進行共培養；將莖切段轉入選擇培養基，進行選擇培養，獲得轉基因陽性植物材料。本發明取材方便，材料數量充足，容易獲得再生植株；香樟胚培苗無性系莖切段遺傳轉化，具方法簡單、步驟簡化、周期短等特點；高頻植株再生香樟無性系材料的應用，大大提高農桿菌介導遺傳轉化的轉基因植株獲得率，縮短香樟遺傳轉化周期，縮短獲得轉基因香樟新種質的周期。
【專利說明】以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程【技術領域】，具體涉及一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法。

【背景技術】
[0002]香樟(Cinnamomum camphoraL.),樟科樟屬植物,是亞熱帶常綠闊葉林的代表樹種。其樹形優美，枝繁葉茂，綠蔭蔽日，氣勢雄偉，是優良的城市園林綠化常用樹種。在我國的分布大體以長江以北為界，南至兩廣及西南，以江西，浙江、福建等東南沿海省份為多，因而在栽培范圍上受到低溫的限制。近年來，隨著城市建設發展及園林綠化的新要求，為豐富北方園林的樹種組合，改善冬季園林植物景觀，不少園林工作者都在嘗試引種此樹，香樟被廣泛引種栽植到黃河流域的一些省分，用以豐富當地綠化樹種。
[0003]北方漫長而寒冷冬季往往會導致香樟正常生長受損，嚴重時樹體甚至死亡，從而造成巨大的經濟損失。因此，防治凍害就成為這一優良樹種在北方城市順利推廣及應用的一個重要問題。解決這一問題的主要方法是加強栽培管理和選育抗凍新品種，而后者是根本途徑。采用生物技術方法，通過轉基因手段進行分子育種，是一種“定向育種”，可有效縮短育種周期。生物技術改良香樟必須以高效植株再生體系的建立為研究基礎，但目前由于采用香樟胚性愈傷組織為轉基因外植體材料，存在轉基因胚性愈傷組織再生困難，從而難獲轉基因植株等問題，制約著生物技術改良香樟的進程。
[0004]目前，在轉基因技術改良香樟育種中，外植體大多采用的是香樟胚性愈傷組織，胚性愈傷組織對香樟這個物種而言再生頻率較低；轉化外源基因后，在選擇陽性轉化材料時，選擇配方中一定濃度的抗生素更增加誘導轉基因胚性愈傷組織再生植株難度。兩種不利因素疊加導致選用香樟胚性愈傷組織做為外植體進行遺傳轉化很難獲得轉基因再生植株。
[0005]南陽師范學院的專利申請“香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法”(受理號:201410188756.3)，提出以香樟子葉胚培養苗莖切段為外植體，通過直接器官發生途徑，建立高頻植株再生體系的方法，因其不具有具體遺傳轉化步驟，因此無法實現香樟品種改良。
[0006]目前，國內外沒有關于香樟通過器官發生途徑獲得轉基因植株的報道。


【發明內容】

[0007]為解決上述問題，本發明的目的是提供一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法。
[0008]本發明所采用的技術方案是，一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，包含下列步驟:
[0009]步驟1、將香樟胚培苗無性系EL6組培苗的莖切段置于不定芽誘導培養基SI上進行預培養；
[0010] 步驟2、將步驟I中預培養后的香樟莖切段作為轉化受體材料置于農桿菌侵染液中進行侵染，即進行遺傳轉化；
[0011]步驟3、將步驟2中侵染結束后的外植體用無菌濾紙吸去多余菌液，轉入共培養培養基中進行共培養；
[0012]步驟4、共培養結束后，將莖切段轉入選擇培養基，進行選擇培養，獲得轉基因陽性植物材料。
[0013]本發明的特點還在于，
[0014]不定芽誘導配方SI 為:MS+30g/L 鹿糖 +0.8 % 瓊脂粉 +2.0mg/L6_BA+0.5mg/L2, 4_D，ρΗ6.0。
[0015]步驟I中的香樟胚培苗無性系組培苗具節莖切段取自在配方SI中增殖生長2w的香樟胚培苗無性系EL6的組培苗；完全切除組培苗枝條上頂芽、側芽、腋芽，即所有具分生組織的器官和葉片；將余下莖段按節切段，即每個莖切段上具有I節，長為5~7_。
[0016]預培養條件是:預培養時間為2d，其培養條件均為光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C _26°C。
[0017]農桿菌侵染液的菌液濃度為OD6tltl = 0.4~1.0 ;侵染時間為20~50min。
[0018]步驟3中的共培養條件為:共培養時間為3d，共培養培養基為不定芽誘導配方SI ；共培養條件暗培養，培養溫度為28°C。
[0019]步驟4中的不定芽誘導選擇培養基的配方為:含抑菌劑頭孢霉素cef和篩選劑潮霉素hyg的不定芽誘導培養基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
[0020]步驟4中的抗性芽的篩選方法具體按照以下步驟實施:將共培養結束后的莖切段轉入含頭孢霉素和潮霉素的不定芽誘導選擇培養基上，光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C -26°C，選擇培養2w后，存活并誘導出不定芽的莖切段初步標記可能的陽性材料，之后將不同外植體來源的不定芽切割分離下來，繼代入新的選擇培養基，再培養2w后篩選即得到陽性抗性芽。
[0021]本發明的有益效果是:本方法以香樟胚培苗無性系具節莖切段為受體，通過農桿菌介導的方法，以GUS基因為報告基因，對影響香樟胚培苗莖切段遺傳轉化的幾個因素進行系統研究，經外植體預培養、遺傳轉化條件優化、共培養和GUS染色最終建立香樟胚培苗莖切段遺傳轉化體系。本發明取材方便，材料數量充足，容易獲得再生植株；香樟胚培苗無性系莖切段遺傳轉化，具方法簡單、步驟簡化、周期短等特點；高頻植株再生香樟無性系材料的應用，可大大提高農桿菌介導遺傳轉化的轉基因植株獲得率，有效縮短香樟遺傳轉化周期，有效縮短獲得轉基因香樟新種質的周期；此外，通過統計GUS基因瞬間表達率對影響農桿菌介導遺傳轉化效率的各項因素進行優化，可有效提高香樟遺傳轉化效率，綜上所述，選用高頻植株再生香樟胚培苗無性系，通過優化后的農桿菌介導的各項因素中轉化，可促進香樟農桿菌介導的基因轉化的研究。本發明可在香樟遺傳轉化和生物技術改良中發揮重要作用，能夠替代香樟胚性愈傷組織作為遺傳轉化的外植體。該發明填補通過器官發生途徑實現香樟轉基因植株的生物技術改良的空白；可用于新基因功能驗證及優良轉基因育種材料的獲得，同時為其他園林樹木的生物技術改良提供重要參考價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 1是本發明香樟胚培苗莖切段潮霉素敏感性試驗圖；
[0023]圖2是本發明香樟胚培苗莖切段頭孢霉素敏感性試驗圖；
[0024]圖3是本發明香樟胚培苗莖切段⑶S基因表達染色反應圖。

【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明，下列所用方法如無特別說明為常規方法。所述百分濃度如無特別說明為質量百分濃度。
[0026]本發明提供一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，包含下列步驟:
[0027]步驟1、將香樟胚培苗無性系EL6組培苗的莖切段置于不定芽誘導培養基SI上進行預培養；
[0028]步驟2、將步驟I中預培養后的香樟莖切段作為轉化受體材料置于農桿菌侵染液中進行侵染，即進行遺傳轉化；
[0029]步驟3、將步驟2中侵染結束后的外植體用無菌濾紙吸去多余菌液，轉入共培養培養基中進行共培養；
[0030]步驟4、共培養結束后，將莖切段轉入選擇培養基，進行選擇培養，獲得轉基因陽性植物材料。
[0031]其中，不定芽誘導配方SI為:MS+30g/L蔗糖+0.8%瓊脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4_D，ρΗ6.0。
[0032]步驟I中的香樟胚培苗無性系組培苗具節莖切段取自在配方SI中增殖生長2w的香樟胚培苗無性系EL6的組培苗；完全切除組培苗枝條上頂芽、側芽、腋芽，即所有具分生組織的器官和葉片；將余下莖段按節切段，即每個莖切段上具有I節，長為5~7_。
[0033]預培養條件是:預培養時間為2d，其培養條件均為光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C _26°C。
[0034]農桿菌侵染液的菌液濃度為OD6tltl = 0.4~1.0 ;侵染時間為20~50min。
[0035]步驟4中的不定芽誘導選擇培養基的配方為:含抑菌劑頭孢霉素cef和篩選劑潮霉素hyg的不定芽誘導培養基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
[0036]步驟4中的抗性芽的篩選方法具體按照以下步驟實施:將共培養結束后的莖切段轉入含頭孢霉素和潮霉素的不定芽誘導選擇培養基上，光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C -26°C，選擇培養2w后，存活并誘導出不定芽的莖切段初步標記可能的陽性材料，之后將不同外植體來源的不定芽切割分離下來，繼代入新的選擇培養基，再培養2w后篩選即得到陽性抗性芽。
[0037]1.1 材料
[0038]南陽師范學院申請“香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法”專利(受理號)，篩選獲得具有高頻植株再生能力的胚培苗無性系無菌苗作為香樟遺傳轉化受體材料的供體來源。不定芽誘導配方SI (MS+30g/L蔗糖+0.8%瓊脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D，pH6.0)(參見發明專利:香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，受理號:201410188756.3)作為莖切段預培養培養基、共培養培養基和不定芽誘導選擇培養基(Sl+cef+hyg)。
[0039]1.2 方法
[0040]1.2.1香樟胚培苗無性系組培苗莖切段的獲得
[0041]處理方式如下:莖切段取自在配方SI中增殖生長2w的香樟胚培苗無性系的組培苗；完全切除組培苗枝條上頂芽、側芽、腋芽(即，所有具分生組織的器官)和葉片；將余下莖段按節切段(即每個莖切段上具有I節)，長約5~7mm。
[0042]1.2.2培養方法及條件
[0043]除香樟莖切段共培養為暗培養，培養溫度為28°C ;其余莖切段抗生素敏感性試驗、受體材料預培養、不定芽誘導選擇培養等香樟培養材料培養均采用光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx ;培養溫度均為24±2°C。
[0044]1.2.3香樟莖切段預培養
[0045]以香樟胚培苗無性系組培苗(見專利:201410188756.3)莖切段為外植體，將所述的外植體接種于不定芽誘導配方SI (見專利:201410188756.3)進行預處理，預處理時間為2d。
[0046]1.2.4香樟莖切段對篩選劑潮霉素和抑菌劑頭孢霉素的敏感性試驗
[0047]1.香樟莖切段對篩選劑潮霉素的敏感性試驗
[0048]將預處理后的莖切段接種于附加不同濃度(0、5、15、25、35mg/L)潮霉素(hyg)的培養基SI上，3w后比較不同濃度抗生素對外植體生長的抑制作用，以確定合適的選擇壓力。試驗的潮霉素濃度梯度為0、5、15、25、35mg/L。每處理試驗外植體數不少于30個，接種3w后，進行數據統計。
[0049]2.香樟莖切段對抑菌劑頭孢霉素的敏感性試驗
[0050]將預處理后的莖切段接種于附加不同濃度頭孢霉素的培養基SI上，3w后比較不同濃度抗生素對外植體不定芽生長的抑制作用，以確定合適的選擇壓力。所試頭孢霉素(cef)濃度梯度為0、200、300、400、1000mg/L。每處理試驗外植體數不少于30個，接種3w后，進行數據統計。
[0051]1.2.5農桿菌介導的遺傳轉化條件的優化
[0052]1.農桿菌菌液活化及侵染液制備
[0053]從-80°C冰箱中取出含質粒pCAMBIA1301的農桿菌EHA105菌種，用接種環在含有100mg/LKm(卡那霉素)和50mg/LRif (利福平)的LB固體培養基上劃線，平板倒置，暗培養在28°C下直至單菌落產生；挑取單菌落接種于含有100mg/LKm的LB液體培養基中，28°C恒溫搖床振蕩培養(180~200r/min)過夜；后將菌液4000rpm離心10min，棄上清，用無菌液體MS培養基重懸菌體，調整至各種0D_，備用。
[0054]2.農桿菌的侵染與共培養
[0055] 將預培養2d的香樟莖切段取出，置于不同OD6tltl (0.4~1.0)農桿菌菌液中浸泡一段時間后，取出并用無菌濾紙吸去表面多余的菌液，完成侵染過程；將侵染后香樟莖切段轉回原來預處理使用培養基中(即預處理培養基和共培養培養基相同)，將上述培養物置于28°C恒溫培養箱，黑暗條件下培養I~4d，進行共培養；共培養結束后通常情況下，可轉入選擇培養基進行選擇培養，如果采用報告基因優化轉化條件，則共培養結束之后，直接進行報告基因瞬間表達的檢測。
[0056]3.轉化條件的優化
[0057]本研究試驗了根癌農桿菌EHA105/pCAMBIA1301的菌液濃度(OD6tltl = 0.4,0.6、0.8、1.0)，共培養天數(l、2、3、4d)，侵染時間(10、20、30、40、5011^11)，對遺傳轉化的影響。
檢測其中的某個因素時，其它因素采用括號中加粗標記的那個水平，共培養結束后用外植體⑶S的瞬間表達量的多少確定轉化條件的適宜程度，每個處理的外植體數不少于30個，其中未侵染的材料作為陰性對照。
[0058]4.⑶S染色檢測報告基因瞬時表達
[0059]I)染色:將待測樣品裝入EP管中，加入適量⑶S染液，完全浸沒樣品，將離心管置于37 °C水浴鍋過夜。
[0060]2)漂洗脫色:先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗樣品(除去葉綠素)，每次搖床震蕩脫色20min，直至陰性對照材料成白色為止。
[0061]3)觀察:肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的蘭小點即為Gus基因表達的位點。
[0062]4)統計數據:香樟莖切段反應后可直接觀察，⑶S基因瞬間表達呈陽性者可在肉眼下觀察到藍色反應，然后統計⑶S基因瞬間表達率，每次反應觀測外植體總數不少于30粒。
[0063]5)⑶S 染色配制:10mmol/LEDTA 二鈉鹽，0.1 % TritonX-100, 500 μ g/mLX-Gluc,
0.1mMK4Fe (CN)6,0.1mMMK3Fe (CN)6,100 μ g/mL氯霉素(CM)，20% 甲醇，以 50mmol/L磷酸緩沖液PH7.0配制。
[0064]1.2.6數據計算和處理
[0065]不定芽誘導率=誘導出芽的外植體數/接種外植體總數X 100% (不定芽長度大于Imm,記錄一個有效芽)
[0066]分化系數=誘導出芽總數/誘導出芽的外植體總數X 100%
[0067]愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體總數X 100%
[0068]存活率=存活外植體數/接種外植體總數X 100% (外植體全長9成變褐，記錄外植體死亡)
[0069]⑶S瞬間表達率=有藍色反應的外植體數/外植體總數X 100%
[0070]2結果與分析
[0071]2.1香樟莖切段對篩選劑潮霉素和抑菌劑頭孢霉素的敏感性試驗
[0072]表1不同濃度的潮霉素對香樟胚培苗莖切段生長的影響
[0073]

【權利要求】
1.一種以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，包含下列步驟: 步驟1、將香樟胚培苗無性系EL6組培苗的莖切段置于不定芽誘導培養基SI上進行預培養； 步驟2、將步驟I中預培養后的香樟莖切段作為轉化受體材料置于農桿菌侵染液中進行侵染，即進行遺傳轉化； 步驟3、將步驟2中侵染結束后的外植體用無菌濾紙吸去多余菌液，轉入共培養培養基中進行共培養； 步驟4、共培養結束后，將莖切段轉入選擇培養基，進行選擇培養，獲得轉基因陽性植物材料。
2.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述不定芽誘導配方SI為:MS+30g/L蔗糖+0.8 %瓊脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D, pH6.0。
3.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟I中的香樟胚培苗無性系組培苗具節莖切段取自在配方Si中增殖生長2W的香樟胚培苗無性系EL6的組培苗；完全切除組培苗枝條上頂芽、側芽、腋芽，即所有具分生組織的器官和葉片；將余下莖段按節切段，即每個莖切段上具有I節，長為5~7_。
4.根據權利要 求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述預培養條件是:預培養時間為2d，其培養條件均為光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C _26°C。
5.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述農桿菌侵染液的菌液濃度為OD_ = 0.4~1.0 ;侵染時間為20~50min。
6.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟3中的共培養條件為:共培養時間為3d，共培養培養基為不定芽誘導配方SI ;共培養條件暗培養，培養溫度為28°C。
7.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟4中的不定芽誘導選擇培養基的配方為:含抑菌劑頭孢霉素cef和篩選劑潮霉素hyg的不定芽誘導培養基SI,即:Sl+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。
8.根據權利要求1所述的以香樟胚培苗莖切段為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟4中的抗性芽的篩選方法具體按照以下步驟實施:將共培養結束后的莖切段轉入含頭孢霉素和潮霉素的不定芽誘導選擇培養基上，光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx，培養溫度為22°C -26°C，選擇培養2w后，存活并誘導出不定芽的莖切段初步標記可能的陽性材料，之后將不同外植體來源的不定芽切割分離下來，繼代入新的選擇培養基，再培養2w后篩選即得到陽性抗性芽。
【文檔編號】A01H5/00GK104131031SQ201410347163
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】杜麗, 黃蕊, 李勇鵬, 姚瑤, 張力維 申請人:南陽師范學院