香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，以香樟未成熟果實中子葉胚為建立香樟胚培苗無性系的起始外植體，以胚培苗無性系莖切段作為不定芽誘導外植體，建立高頻植株再生體系，其特征在于：建立香樟胚培苗無性系的外植體為香樟未成熟子葉胚，植株再生體系的建立選用香樟胚培苗無性系莖切段為外植體材料。本發明的方法取材方便，材料來源、數量充足，容易獲得無菌材料；本發明可在香樟的組織培養、遺傳轉化和生物技術改良中發揮重要作用。
【專利說明】香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于林業【技術領域】，具體而言，涉及一種高頻植株再生香樟無性系選育方法。
【背景技術】
[0002]香樟(CinnamomumcamphoraL.),樟科樟屬植物,是亞熱帶常綠闊葉林的代表樹種。其樹形優美，枝繁葉茂，綠蔭蔽日，氣勢雄偉，是優良的城市園林綠化常用樹種。在我國的分布大體以長江以北為界，南至兩廣及西南，以江西，浙江、福建等東南沿海省份為多，因而在栽培范圍上受到低溫的限制。近年來，隨著城市建設發展及園林綠化的新要求，為豐富北方園林的樹種組合，改善冬季園林植物景觀，不少園林工作者都在嘗試引種此樹，香樟被廣泛引種栽植到黃河流域的一些省分，用以豐富當地綠化樹種。
[0003]北方漫長而寒冷冬季往往會導致香樟正常生長受損，嚴重時樹體甚至死亡，從而造成巨大的經濟損失。因此，防治凍害就成為這一優良樹種在北方城市順利推廣及應用的一個重要問題。解決這一問題的主要方法是加強栽培管理和選育抗凍新品種，而后者是根本途徑。采用生物技術方法，通過轉基因手段進行分子育種，是一種“定向育種”，可有效縮短育種周期。生物技術改良香 樟必須以高效植株再生體系的建立為研究基礎，但目前由于采用香樟胚性愈傷組織為轉基因外植體材料，存在轉基因胚性愈傷組織再生困難，從而難獲轉基因植株等問題，制約著生物技術改良香樟的進程。
[0004]在采用轉基因技術改良香樟育種中，大多采用外植體是香樟胚性愈傷組織，胚性愈傷組織對香樟這個物種而言再生頻率較低；加之轉化外源基因后，需要在選擇配方中添加一定濃度的抗生素來篩選轉化材料，而抗生素的添加又增加了誘導轉基因胚性愈傷組織再生植株難度。這2種不利因素最終導致通過轉基因手段改良香樟很難獲得轉基因植株。
[0005]因此如何提供一種香樟高頻植株再生無性系的建立和篩選方法，對本領域的技術人員來說是亟待解決的技術問題。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種香樟高頻植株再生無性系選育方法，為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
[0007]本發明一方面涉及一種植株再生香樟無性系選育方法，其特征在于包括如下反應步驟:
[0008](I)以無菌處理的香樟未成熟子葉胚為外植體，將其置于子葉胚萌發培養基誘導其萌發；(2)將子葉胚萌發芽苗，進行擴大繁殖處理，篩選增殖系數高(大于3~5)的胚培苗單株，獲得單株無性系；(3)以來自單株無性系的香樟胚培苗莖切段為外植體，進行不定芽誘導處理,建立香樟莖切段植株再生體系，并進行高頻植株再生單株無性系篩選；(4)香樟無性系莖切段經不定芽誘導處理后，選擇誘導所得單芽進行壯苗培養；(5)壯苗處理后無根苗經生根培養，獲得完整植株。[0009]本發明提供一種香樟組織培養方法。該培養方法取材方便，材料來源、數量充足，容易獲得無菌材料；香樟胚培苗無性系的獲得及其莖切段植株再生無性系的建立和篩選，具方法簡單、步驟簡化、周期短等特點；篩選獲得高頻植株再生香樟無性系，可大大提高農桿菌介導遺傳轉化的轉基因植株獲得率，有效縮短香樟遺傳轉化周期；胚培苗無性系莖切段能替代目前使用的香樟胚性愈傷組織作為遺傳轉化的外植體。本發明可在香樟的組織培養、遺傳轉化和生物技術改良中發揮重要作用。
【具體實施方式】
[0010]下列實施例中所用方法如無特別說明為常規方法。所述百分濃度如無特別說明為質量百分濃度。
[0011]實施例1 [0012]1.1 材料
[0013]7月底，采集健壯、成年香樟樹上未成熟果實，將無菌處理后的果實切開，取出未成熟子葉胚作為研究材料。
[0014]1.2 方法
[0015]1.2.1香樟果實的消毒和子葉胚接種
[0016]處理方式如下:將香樟未成熟果實(直徑約Icm)先用洗潔精溶液浸泡30min，再用自來水流水沖洗30min ;后將其放置在超凈工作臺上，75%酒精浸泡30s后，0.1%升汞浸泡8min，最后用無菌水沖洗3次；香樟果實經消毒處理后，切開果實，取出未成熟子葉胚作為研究材料，接種在子葉胚萌發誘導培養基上。
[0017]1.2.2培養方法及條件
[0018]除香樟子葉胚萌發處理為暗培養，胚培苗擴大繁殖處理、莖切段不定芽誘導處理、單芽伸長壯苗處理以及無菌苗生根處理等香樟培養材料均為光照培養，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為2000~3000Lx ;培養溫度均為24±2°C。
[0019]1.2.3香樟子葉胚萌發處理
[0020]將香樟子葉胚接種于含萌發誘導培養基的培養皿中(SI:MS+BA2.0mg/L+2, 4-D0.5mg/L+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉，pH6.0);暗培養處理4w后，切除萌發材料基部褐化子葉和冗余的愈傷組織，收集萌發的香樟胚培芽苗，將其轉入同樣配方的三角瓶中，光照培養，2w后繼代一次，之后進入胚培苗無性系初選。
[0021]1.2.4香樟胚培苗無性系初篩及擴大增殖處理
[0022]選擇增殖系數高(單株無菌苗生成叢枝數大于3~5枝)的胚培苗單株，進行擴大增殖處理，并將來自不同單株的胚培苗繁殖所得無性系命名為EL系列；胚培苗擴大增殖方法如下:取香樟胚培苗，用解剖刀先將胚培苗基部冗余愈傷組織增生和褐化變黑的組織剔除干凈，然后將胚培苗叢生枝條，2~3枝一組分割開來，之后在每叢枝的中下部下刀，將叢生枝切成留有大約5mm枝條的叢枝基部，轉入裝有SI培養基的三角瓶中，用于胚培苗擴大增殖處理。此后香樟胚培苗無性系的繼代繁殖均采用上述方法，每2w繼代一次。
[0023]1.2.5香樟胚培苗莖切段植株再生體系的建立
[0024]將香樟胚培苗無性系EL6莖切段置于不同不定芽誘導培養基中，研究不同誘導配方對香樟胚培苗莖切段不定芽誘導的影響，用以建立香樟莖切段植株再生體系；其中胚培苗莖切段，按以下方法獲得:取胚培苗無性系組培苗，用解剖刀先將胚培苗基部多余愈傷組織增生和褐化變黑的組織剔除干凈，然后將無性系組培苗叢生枝，按2~3枝一組從基部分割開來，之后在每叢枝的中下部下刀，將叢生枝條分成2部分，一部分是留有大約5mm枝條的叢枝基部，轉入裝有SI培養基的三角瓶中，用于胚培苗無性系繼代；另一部分是零散的枝條，完全切除枝條上頂芽、側芽(切下來的芽可做胚培苗繼代外植體，也可直接丟棄)和葉片；將余下的枝條，按節切段(即每個莖切段上具有I~2節)，長約5~7mm，作為外植體接入各種誘導培養基中進行不定芽誘導培養；不定芽誘導培養采用光照培養，每一處理接種外植體數30個，2w后統計不定芽誘導率和分化系數。
[0025]1.2.6香樟胚培苗單株無性系再生能力比較(香樟高頻植株再生無性系篩選)
[0026]將不同來源單株無性系胚培苗莖切段置于同一不定芽誘導培養基SI中，光照培養，2w后統計不定芽誘導率和分化系數，并進行高頻植株再生無性系的篩選。
[0027]1.2.7香樟莖切段所得不定芽壯苗處理
[0028]香樟莖切段誘導所得不定芽，切除多余側芽，選取具單芽0.5~Icm左右的小枝，置于不同壯苗培養基中，進行壯苗處理，接種2w后進行數據統計。
[0029]1.2.8香樟無根苗生根處理
[0030]壯苗培養后，選取1.5cm以上無根苗，切除基部多余側芽或不定芽，將其置于不同生根培養基中，進行生根 處理，2w后統計生根率。
[0031]以上培養基無特殊說明均采用MS作為基本培養基，添加瓊脂粉8g/L，蔗糖30g/L以及不同濃度的植物激素，培養基PH均調至6.0后，保持121°C滅菌20min。
[0032]1.2.9數據計算和處理
[0033]不定芽誘導率=誘導出芽的外植體數/接種外植體總數X 100% (不定芽長度大于3~5mm,記錄一個有效芽)
[0034]分化系數=誘導出芽總數/誘導出芽的外植體總數X 100%
[0035]壯苗率=長大伸長芽總數/接種外植體總數X 100% (葉片舒展，枝條長達1.5cm及以上，記錄為壯苗)
[0036]生根率=誘導出不定根的無菌苗數/接種無菌苗總數X 100%
[0037]2結果與分析
[0038]2.1香樟胚培苗莖切段植株再生體系的建立
[0039]表1不同誘導配方對香樟胚培苗莖切段不定芽誘導的影響
[0040]
【權利要求】
1.香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，以香樟未成熟果實中子葉胚為建立香樟胚培苗無性系的起始外植體，以胚培苗無性系莖切段作為不定芽誘導外植體，建立高頻植株再生體系，其特征在于:建立香樟胚培苗無性系的外植體為香樟未成熟子葉胚，植株再生體系的建立選用香樟胚培苗無性系莖切段為外植體材料。
2.香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，其特征在于:子葉胚來源于7月底香樟未成熟果實，果實直徑約Icm ;香樟植株再生體系外植體為胚培苗莖切段其特征在于:將胚培苗枝條上頂芽、側芽和葉片徹底切除，余下莖段，按節切段(即每個切段上具有I~2節)，長約5~7mm。
3.香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，包括以下步驟: (1)將香樟無菌未成熟子葉胚接種于含萌發誘導培養基的培養皿誘導其萌發，所述誘導培養基為:S1:MS+BA2.0mg/L+2, 4-D0.5mg/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂粉，pH6.0 ;暗培養處理4w ； (2)將萌發香樟胚培芽苗，轉入含同樣SI配方的三角瓶中，光照培養，2w后繼代一次，之后進入胚培苗無性系初選； (3)初步選擇增殖系數高(單株無菌苗生成叢枝數大于3~5枝)的胚培苗單株，轉入配方SI進行擴大增殖處理，并將來自不同單株的胚培苗繁殖所得無性系命名為EL系列。
4.根據權利要求3所述香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，其特征在于:取香樟胚培苗，用解剖刀先將胚培苗基部冗余愈傷組織增生和褐化變黑的組織剔除干凈，然后將胚培苗叢生枝條，2~3枝一組分割開來，之后在每叢枝的中下部下刀，將叢生枝切成留有大約5mm枝條的叢枝基部，轉入裝有SI培養基的三角瓶中，用于胚培苗擴大增殖處理。
5.根據權利要求3所述香樟胚培苗莖切段高頻植株再生無性系選育方法，包括以下步驟: (1)將香樟胚培苗莖切段置于含Si配方的培養基誘導其不定芽生成； (2)香樟莖切段誘導所得不定芽，切除多余側芽，選取具單芽0.5~Icm左右的小枝，置于壯苗培養基S5進行壯苗處理，所述壯苗配方為MS+BA1.0mg/L+2, 4-D0.lmg/L+CH1000mg/L+30g/L 鹿糖 +8g/L 瓊脂粉，ρΗ6.0 ； (3)壯苗培養后，選取1.5cm以上無菌苗，切除基部多余側芽或不定芽，將其置于生根培養基R5進行生根處理，所述生根配方為1/2MS+IBA1.0mg/L+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉，pH6.0.
6.香樟胚培苗莖切段植株再生體系的建立和高頻植株再生無性系篩選，其特征在于:采用權利要求3所述方法對香樟子葉胚進行組織培養，對初選所得香樟胚培苗單株無性系進行擴繁，再以擴繁所得無性系植株的莖切段為外植體用權利要求5的方法進行組織培養，經篩選獲得誘導率達90%以上、分化系數達5以上的高頻植株再生無性系。
【文檔編號】A01H4/00GK103947555SQ201410188756
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】杜麗, 姚瑤, 李勇鵬 申請人:南陽師范學院