一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，具體步驟如下：1)以連翹屬的連翹為母本，以六道木葉屬的翅果連翹為父本，進行屬間人工雜交，收取雜交后的種子；2)種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進行形態學觀察統計，并采用AFLP分子標記進行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。本發明利用連翹屬連翹與六道木葉屬翅果連翹進行遠緣雜交，實現了連翹屬與六道木葉屬屬間基因交流，獲得了屬間雜交新種質。在本發明基礎上，可豐富連翹屬植物的遺傳信息，為利用屬間雜交進行連翹新品種培育成為可能，同時可進行近緣屬親緣關系研究。
【專利說明】-種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物育種領域，具體涉及一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方 法。

【背景技術】
[0002] 連翅屬（Forsythia)植物均為早春觀花落葉灌木，先葉或同葉開放，花黃色，鐘 狀，花柱二型，蒴果（中國植物志，1992)。
[0003] 19世紀，西方國家從東方引進連翹屬植物，進行了廣泛的選擇育種，培育出一批 品種，由于抗逆性強和早春花朵繁密，這些品種在溫帶地區獲得廣泛栽培應用（Rosati et al. ,2007)。德國G0ttin.gen植物園發現自然雜交種金鐘連翅（ForsythiaXintermedia)， 成為現代連翹品種的主要親本，新品種大量出現（Wyman，1961)。連翹常規雜交和自然突變 選擇育種工程主要集中于美國、加拿大、波蘭和德國等國家。主要目標性狀集中在抗寒性 (用卵葉連翹和東北連翹作為育種親本）、株型和花部性狀的改良等方面。
[0004] 作為觀賞植物，連翹屬植物自身也存在一些不足，如：花期集中于4月到5月，群體 花期僅25天左右；花色單一，僅有黃色系品種；花無香味等。傳統的連翹屬內雜交育種無 法解決這些問題。六道木葉屬翅果連翅（Abeliophyllum distichum)花白色或粉色，淡香 (Suk-Pyo Hong&Mae-Ja Han，2002)，與連翹花色差異明顯，與連翹親緣關系相對較近。采用 翅果連翹與連翹進行屬間雜交，有望豐富連翹的花色、花期等性狀。同時對探討連翹與近緣 屬遠緣雜交親和性、基因交流機制具有重要的意義。


【發明內容】

[0005] 針對目前連翹屬植物花色單一、花期集中的現狀，本發明的目的是提供一種獲得 連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，以改良連翹屬植物觀賞特性。
[0006] 本發明提供的一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，具體步驟如下：
[0007] 1)選長花柱的連翹屬的連翹為母本，選短花柱的六道木葉屬的翅果連翹為父本， 進行屬間人工雜交，收取雜交后的種子；
[0008] 2)種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進行形態學觀察統計，并采用 AFLP分子標記進行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。
[0009] 六道木葉屬的翅果連翹為異型花柱，選取短花柱的植株作為本發明的母本。同樣 連翹屬的連翹也為異型花柱，選取長花柱的植株作為本發明的父本。
[0010] 其中，步驟1)所述屬間人工雜交，包括如下步驟：
[0011] a采集短花柱的六道木葉屬翅果連翹的鮮花粉；
[0012] b將長花柱的連翹屬連翹去雄；
[0013] c將步驟a采集的花粉授粉到步驟b連翹屬連翹的柱頭上并套袋；
[0014] d種子發育成熟后采收。
[0015] 其中，步驟c所述授粉的時間為上午11-12時，每天1次，重復3次。
[0016] 其中，步驟c所述套袋，授粉后套硫酸紙袋，花柱萎蔫后換成網袋。
[0017] 其中，步驟d所述采收，為待種子發育成熟后采摘、陰干。采收到的種子室溫干燥 條件保存。
[0018] 其中，步驟2)所述種植種子，具體步驟如下：
[0019] 種子采用l〇〇mg/L赤霉素浸種處理6h后，點播于裝有泥炭的穴盤內，覆膜，置于溫 室，萌發后獲得雜交后代材料。
[0020] 其中，步驟2)所述進行形態學觀察統計，為連續3年進行表型觀察統計。
[0021] 其中，步驟2)所述進行形態學觀察統計，針對莖、葉、枝條、花的表型。
[0022] 其中，步驟2)所述采用AFLP分子標記進行雜種鑒定，所用的引物對為：
[0023] E38/M47
[0024] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0025] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0026] E38/M55
[0027] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0028] 下游引物 Μ55 :5, -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0029] E40/M52
[0030] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0031] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0032] 和 / 或 E44/M49
[0033] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0034] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0035] 其中，步驟2)所述選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的標準為：形態學的表型特 征介于父母本之間，并出現父母本不具有的新性狀，具有父母本的特有AFLP條帶。
[0036] 本發明還提供所述獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法在育種中的應用。
[0037] 本發明還提供用于連翹屬與六道木葉屬屬間雜種AFLP分子標記鑒定的引物對， 其為：
[0038] E38/M47
[0039] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0040] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0041] E38/M55
[0042] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0043] 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0044] E40/M52
[0045] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0046] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0047] 和 / 或 E44/M49
[0048] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0049] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0050] 本發明提供的利用雜交授粉獲得連翹與翅果連翹屬間雜種的方法，有如下優點和 有益效果：
[0051] (1)本發明利用連翹屬連翹與六道木葉屬翅果連翹進行遠緣雜交，實現了連翹屬 與六道木葉屬屬間基因交流，獲得了屬間雜交新種質。
[0052] (2)在本發明基礎上，可豐富連翹屬植物的遺傳信息，為利用屬間雜交進行連翹新 品種培育成為可能，同時可進行近緣屬親緣關系研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為本發明實施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）當年生枝條的對 比照片。
[0054] 圖2為本發明實施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）葉片的對比照 片。
[0055] 圖3為本發明實施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）二年生枝條的對 比照片。
[0056] 圖4為引物E38/M47在親本及子代中的分離檢測（70-110bp)。
[0057] 圖5為引物E38/M55在親本及子代中的分離檢測（80_130bp)。
[0058] 圖6為引物E40/M52在親本及子代中的分離檢測（70-120bp)。
[0059] 圖7為引物E44/M49在親本及子代中的分離檢測（45-80bp)。

【具體實施方式】
[0060] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0061] 實施例1
[0062] 1、連翹與六道木葉屬屬間雜交后代材料的獲得
[0063] 1. 1材料選擇
[0064] 選擇連翹屬的連翹和近緣屬六道木葉屬的翅果連翹。
[0065] 1. 2雜交方法及雜種獲得
[0066] 2011年春，在國家花卉工程中心小湯山苗圃，以長花柱連翹為母本進行人工去雄 并套袋隔離，采集短花柱翅果連翹的新鮮花粉，于上午11-12時授粉，每天一次，授粉3次； 雜交后待柱頭萎蔫后，換成網袋。種子自然成熟后采集，陰干，干燥室溫條件下保存。
[0067] 種子用100mg/L赤霉素水溶液浸種處理6h后點播于裝有泥炭的穴盤內，覆膜，萌 發后獲得屬間雜交后代植株。
[0068] 2、連翹與翅果連翹雜種的鑒定
[0069] 表型鑒定：將雜交父母本及雜交后代于7月份露地定植，進行常規養護管理。翌年 春，對父母本及后代進行形態學測定與統計，連續進行3年。
[0070] 結果見圖1-3,表明：雜交后代的株型、冠幅、株高、枝條、葉等形態特征介于雙 親之間，具有父母本綜合性狀。連翹（母本）：連翹生長勢強、當年生枝中空，節間長 5. 4cm±0. 01cm、葉片長卵圓形，粗鋸齒、多三裂葉，葉片大小6. 05cmX4. 04cm ;翅果連翹 (父本）：生長勢弱、當年生枝髓實心，節間長3. 42cm±0. 02cm、葉片闊卵圓形，全緣，無三裂 葉，葉片大小5. 14cmX3. 56cm ;雜交后代：生長勢居中、當年生枝中空、老枝具片狀髓，當年 生枝節間長3. 46cm±0. 01cm、葉片卵圓形，粗鋸齒，多三裂葉，葉片大小5. 36cmX 3. 86cm。
[0071] AFLP分子鑒定：設計了 4對多態性良好的引物對：E38/M47、E38/M55、E40/M52、 E44/M49 (引物序列參見表1，2)，對親本及子代進行選擇性擴增，并對特異性條帶進行統計 分析。
[0072] 表1 AFLP分析所用接頭和引物序列
[0073]

【權利要求】
1. 一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 選長花柱的連翹屬的連翹為母本，選短花柱的六道木葉屬的翅果連翹為父本，進行 屬間人工雜交，收取雜交后的種子； 2) 種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進行形態學觀察統計，并采用AFLP分 子標記進行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述屬間人工雜交，包括如下步驟： a采集短花柱的六道木葉屬翅果連翹的鮮花粉； b將長花柱的連翹屬連翹去雄； c將步驟a采集的花粉授粉到步驟b連翹屬連翹的柱頭上并套袋； d種子發育成熟后米收。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c所述授粉的時間為上午11-12時，每 天1次，重復3次。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c所述套袋，授粉后套硫酸紙袋，花柱萎 蔫后換成網袋。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d所述采收，為待種子發育成熟后采摘、 陰干。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述種植種子，具體步驟如下： 種子采用l〇〇mg/L赤霉素浸種處理6h后，點播于裝有泥炭的穴盤內，覆膜，置于溫室， 萌發后獲得雜交后代材料。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟2)所述進行形態學觀察統計，針 對莖、葉、枝條、花的表型。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述采用AFLP分子標記進行雜種鑒 定，所用的引物對為： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物M47:5'-gatgagtcctgagtaacaa-3'（如SEQIDNo·4所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 Μ52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
9. 權利要求1-8所述獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法在育種中的應用。
10. 用于連翹屬與六道木葉屬屬間雜種AFLP分子標記鑒定的引物對，其為： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M47 :5' -gatgagtcctgagtaacaa-3'（如 SEQ ID No. 4 所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 M52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5' -gactgcgtaccaattcatc-3'（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
【文檔編號】A01H1/04GK104145807SQ201410366170
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】潘會堂, 申建雙, 張啟翔, 石超, 程堂仁, 王佳, 孫明 申請人:北京林業大學