一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法
【專利摘要】本發明公開了一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法。該翹嘴鱖多倍體誘導方法的主要步驟如下：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雌魚和雄魚，分別采集成熟的卵子和精液，人工受精，受精后2～10min用39～43℃的養殖用水熱休克處理1～3min，然后在25～28℃的養殖用水中孵化，完成熱休克法的翹嘴鱖多倍體誘導。采用本發明所述的該條件進行翹嘴鱖多倍體的誘導，最佳效果可達受精率32.07%，多倍體得率可達80.64%，孵化率可達95.9%，具有良好的經濟效益和社會效益。
【專利說明】一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于魚類育種【技術領域】。更具體地，涉及一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法。

【背景技術】
[0002] 翹嘴鱖隸屬鱸形目，鯧科，鱖屬，是淡水魚類中的珍品。其肉質細嫩、厚實、少刺，且 蛋白質含量極高，營養十分豐富，味道鮮美，深受廣大消費者的喜愛，在我國已經成為經濟 價值很高、市場需求量很大的名特水產養殖品種之一。但是翹嘴鱖天然資源隨著大強度捕 撈而逐漸減少，因此翹嘴鱖的人工繁殖和苗種培育技術的研究顯得十分必要。
[0003] 從上世紀80年代以來，鱖魚人工繁殖技術的解決和完善，為翹嘴鱖的大規模養殖 創造了條件。但是所養殖的翹嘴鱖無品種可言，繁殖親本主要是來自長江等水系捕撈的野 生鱖或經過數代養殖的鱖，其子代生長速度較慢，抗病力弱，馴食能力差，種質資源退化，適 應集約化養殖能力較弱，嚴重制約著翹嘴鱖養殖產業化道路。近年來，翹嘴鱖的育種方法研 究主要集中在雜交育種和雌核發育。但是雜交育種存在期限太長的問題，雌核發育成功率 和孵化成活率較低。總之，近年來翹嘴鱖人工繁殖技術存在魚苗成活率低、生產成本高的問 題。
[0004] 多倍體系指生物體體細胞中含有超過2個染色體組的個體。相對于二倍體，多倍 體含有3個、4個或更多的染色體組，而依次被稱為三倍體、四倍體和五倍體等。多倍體育種 在魚類遺傳育種中具有重要的地位，多倍體魚類尤其是三倍體魚類對提高魚類生長速度、 延長魚類壽命、改善魚肉品質以及保護魚類種質資源等方面均有重要意義。目前，魚類多倍 體的誘導方法主要有溫度休克(包括冷休克或熱休克)、藥物處理(包括細胞松弛素 B、6_二 甲基氨基嘌呤（6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇等)、靜水壓、雜交等。其中藥物處理 法具有誘導成功率低，用于試驗處理的試驗材料(受精卵）數量受到限制，有些誘導劑毒性 較大，有致癌性，難溶于水，且價格昂貴等缺點。靜水壓法處理則需要專門設備，成本較高， 并且樣本容量有限。雜交，尤其是種間雜交的方法誘導多倍體，則周期較長、誘導率較低。溫 度休克法誘導魚類多倍體則具有操作簡單、成功率高、育種周期短的優勢。但是本領域技術 人員公知，不同魚類的育種方法和條件是不具有參考性和借鑒性的。溫度休克法并不適用 于所有的魚類，而且針對不同的魚類，采用何種溫度休克方式，處理的開始時間、持續時間 及溫度等條件是非常關鍵的，目前魚類的多倍體育種還存在許多尚未解決的難題。因此對 于特定的魚種，探索出最佳的多倍體育種方法是一個值得探索的課題。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是要解決的技術問題是克服現有翹嘴鱖育種技術的不足和缺陷，提 供一種操作簡單、成功率高、育種周期短的翹嘴鱖多倍體的誘導方法。
[0006] 本發明另一目的是提供所述方法在翹嘴鱖育種方面的應用。
[0007] 本發明上述目的通過以下技術方案實現： 本發明提供了一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法，包括如下步驟： si.獲取精卵：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子； 52. 人工受精：將精液與卵子混合，先輕輕攪拌(可用羽毛)，使精卵充分混勻后，加入生 理鹽水激活精子，進行人工受精； 53. 獲得多倍體：將受精后2?IOmin的受精卵轉移至39?43°C養殖用水中進行熱休 克處理1?3min，使染色體組加倍； 54. 將經過熱休克處理的受精卵移至養殖用水中孵化，按照普通翹嘴鱖苗種生產方法 管理，培育翹嘴鱖多倍體魚苗。
[0008] 優選地，步驟Sl所述采集精液和成熟卵子的方法為： 51. 給親魚注射催產劑后，放入25?28°C水中，效應時間為22?24h ; 52. 提早2 h開始觀察，檢查親魚發情情況，并每隔30 min檢查一次； 53. 當輕壓腹部，雌魚生殖孔中有卵粒流出時，即可進行精卵采集； 54. 采集時，分別用濕毛巾包裹雄魚和雌魚，輕壓親魚腹部，將精、卵擠入干燥潔凈的器 皿中，精、卵避免陽光直射。
[0009] 優選地，步驟S2所述生理鹽水的水溫為25?27 °C。
[0010] 優選地，步驟S3是將受精后8min的受精卵轉移至39?41 °C養殖用水中進行熱休 克處理1?2min。
[0011] 更優選地，步驟S3是將受精后8min的受精卵轉移至41 °C養殖用水中進行熱休克 處理2min。
[0012] 優選地，步驟S4所述孵化的溫度為25?28°C。
[0013] 上述翹嘴鱖多倍體的誘導方法在翹嘴鱖育種方面的應用也在本發明的保護范圍 之內。
[0014] 溫度休克法包括冷休克和熱休克兩種截然不同的方法，大量文獻表明，一般冷水 性的魚類宜采用熱休克，溫度范圍為28?36°C;溫水性的魚類宜用冷休克，溫度范圍0°C左 右。翹嘴鱖是一種溫水性江河湖川名貴底層魚類，目前公開的利用雌核發育育種時就是利 用冷休克的方法使染色體組加倍。但是本發明為了獲得更好的誘導效果，經過大量研究和 探索，得出了本發明上述的利用熱休克法的多倍體誘導育種工藝，取得了顯著的效果。
[0015] 現有技術中，本領域人員公知，不同魚類第二極體排放時間及卵的耐受溫度和耐 受時間均不同；第二極體的排放時間也與受精水溫、卵子的成熟程度、魚類的生長環境等有 很大的關系，因此利用在利用溫度休克的方法進行多倍體育種時，各個環節及其條件都是 需要嚴格控制的，且各環節之間是一個協調統一的整體，對最終育種的成功率和孵化率都 有至關重要的影響。一般冷水性魚類的第二極體排出時間較遲，而溫水性魚類較早，在采 用溫度休克時通常要用亞致死溫度才能有效地抑制第二極體的放出，并且處理時間太短無 抑制作用，太長則會對胚體造成較大損傷，導致孵化率下降、畸形率上升而影響整體誘導效 果。而溫度的高低和處理持續時間控制不好，也會對卵子或受精卵造成很大的損傷。因此需 要大量的研究和探索，才能正確判斷第二極體排出時間和受精卵的耐受溫度和耐受時間等 條件，從而確定最佳的誘導育種條件。影響溫度休克法誘導多倍體效果的關鍵因素有：處理 的時機、持續時間和溫度的高低；受精后立刻進行溫度休克，可阻止第二極體的排出；若是 在第一次有絲分裂的中期進行休克處理，可抑制第一次卵裂。魚類溫度休克敏感性的差異 既與其遺傳背景有關，也與卵子的成熟程度有關。綜上所述，值得提出的是，針對同一種魚， 不同的人用相同的方法誘導多倍體也可能會得出不同的結果，因為誘導結果與卵子的成熟 度、誘導工藝的差異、倍性鑒定方法的不同和魚種地理種群的不同等因素都有關系。
[0016] 因此，本發明經過大量的反復驗證，嚴格控制了誘導工藝條件，包括精子、卵子的 獲取時機，熱休克處理的開始時間、溫度和持續時間，以及后續的培育條件。首先，對于精子 和卵子的獲取時機：一般在注射催產劑后，當水溫為25?28°C時，效應時間為22?24h，提 早2 h開始觀察，檢查親魚發情情況，并每隔30 min檢查一次。當輕壓腹部，雌魚生殖孔中 有卵粒流出時，即可進行精卵采集。采集時，分別用濕毛巾包裹雄魚和雌魚，輕壓親魚腹部， 將精、卵擠入干燥潔凈的器皿中，精、卵避免陽光直射。其次，對于誘導條件則如上所述：受 精后2?lOmin，將受精卵轉移至39?43°C養殖用水中進行熱休克處理1?3min，再轉移 至25?28°C的養殖用水中孵化。采用本發明所述的該條件進行翹嘴鱖多倍體的誘導，最佳 效果可達受精率32. 07%，多倍體得率可達80. 64%，孵化率可達95. 9%。
[0017] 本發明具有以下有益效果： 本發明提供了一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法，首次通過熱休克法成功誘導出翹嘴鱖多 倍體，并且精確控制了精子與卵子的采取時機，以及誘導工藝。最優選的誘導條件為：精確 選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雌魚和雄魚，在嚴格控制的合適的時機分別采集成熟的精液和 卵子，25?27°C生理鹽水中人工受精，受精后8min用41°C的養殖用水熱休克處理2min，然 后在25?28°C的養殖用水中孵化，得到多倍體翹嘴鱖。實驗結果表明，最佳效果可達受精 率為32. 07%，多倍體得率為80. 64%，孵化率為95. 9%。
[0018] 另外，本發明的方法具有操作簡單、成功率高、育種周期短的顯著優勢，具有良好 的經濟效益和社會效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1翹嘴鱖二倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方圖（DI=L 0)。
[0020] 圖2翹嘴鱖三倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方圖（DI=L 5)。
[0021] 圖3翹嘴鱖四倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方圖（DI=L 9)。
[0022] 圖4翹嘴鱖五倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方圖（DI=2. 5)。

【具體實施方式】
[0023] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試 齊U、方法和設備。
[0024] 除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0025] 實施例1 1、步驟如下： si.獲取精卵：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子； 52. 人工受精：將精液與卵子混合，輕輕拌均后加入25?27°C的生理鹽水進行人工受 精； 53. 獲得多倍體：將受精后8min的受精卵轉移至39°C養殖用水中進行熱休克處理 2min，使染色體組加倍； S4.將經過熱休克處理的受精卵移至25?28°C的養殖用水中孵化，按照普通翹嘴鱖苗 種生產方法管理，培育翹嘴鱖多倍體魚苗。
[0026] 2、實驗結果表明，受精率為34. 5%，三倍體得率為12%，孵化率為74. 29%。
[0027] 實施例2 1、步驟如下： si.獲取精卵：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子； 52. 人工受精：將精液與卵子混合，輕輕拌均后加入25?27°C的生理鹽水進行人工受 精； 53. 獲得多倍體：將受精后Smin的受精卵轉移至41°C養殖用水中進行熱休克處理 lmin，使染色體組加倍； 54. 將經過熱休克處理的受精卵移至25?28°C的養殖用水中孵化，按照普通翹嘴鱖苗 種生產方法管理，培育翹嘴鱖多倍體魚苗。
[0028] 2、實驗結果表明，受精率為33. 67%，多倍體得率為6. 67%，孵化率為96. 72%。
[0029] 實施例3 1、步驟如下： si.獲取精卵：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子； 52. 人工受精：將精液與卵子混合，輕輕拌均后加入25?27°C的生理鹽水進行人工受 精； 53. 獲得多倍體：將受精后Smin的受精卵轉移至41°C養殖用水中進行熱休克處理 2min，使染色體組加倍； 54. 將經過熱休克處理的受精卵移至25?28°C的養殖用水中孵化，按照普通翹嘴鱖苗 種生產方法管理，培育翹嘴鱖多倍體魚苗。
[0030] 2、實驗結果表明，受精率為32. 07%，多倍體得率為80. 64%，孵化率為95. 9%。
[0031] 實施例4 1、本實施例對熱休克條件進行優化，誘導步驟參照實施例1。
[0032] 2、結果如表1和表2所示 表1

【權利要求】
1. 一種翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，包括如下步驟：
51. 獲取精卵：選取性腺發育成熟的翹嘴鱖雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子；
52. 人工受精：將精液與卵子混合，輕輕攪拌使精卵充分混勻后，加入生理鹽水激活精 子，進行人工受精；
53. 獲得多倍體：將受精后2?IOmin的受精卵轉移至39?43°C養殖用水中進行熱休 克處理1?3min，使染色體組加倍；
54. 將經過熱休克處理的受精卵移至養殖用水中孵化，按照普通翹嘴鱖苗種生產方法 管理，培育翹嘴鱖多倍體魚苗。
2. 根據權利要求1所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，步驟Sl所述采集精液 和成熟卵子的方法為：
51. 給親魚注射催產劑后，放入25?28°C水中，效應時間為22?24h ;
52. 提早2 h開始觀察，檢查親魚發情情況，并每隔30 min檢查一次；
53. 當輕壓腹部，雌魚生殖孔中有卵粒流出時，即可進行精卵采集；
54. 采集時，分別用濕毛巾包裹雄魚和雌魚，輕壓親魚腹部，將精、卵擠入干燥潔凈的器 皿中，精、卵避免陽光直射。
3. 根據權利要求1所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，步驟S2所述生理鹽水 的水溫為25?27 °C。
4. 根據權利要求1所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，步驟S3是將受精后 8min的受精卵轉移至39?41°C養殖用水中進行熱休克處理1?2min。
5. 根據權利要求4所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，步驟S3是將受精后 8min的受精卵轉移至41°C養殖用水中進行熱休克處理2min。
6. 根據權利要求1所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法，其特征在于，步驟S4所述孵化的溫 度為25?28°C。
7. 權利要求1所述翹嘴鱖多倍體的誘導方法在翹嘴鱖育種方面的應用。
【文檔編號】A01K67/027GK104322408SQ201410551805
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月17日 優先權日:2014年10月17日
【發明者】李桂峰, 胥鵬, 古勇明, 盧薛, 曾爽, 唐琴冬, 王鵬飛 申請人:中山大學, 佛山市南海百容水產良種有限公司