專利名稱：雪蓮多倍體的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種雪蓮多倍體的誘導方法背景技術新疆雪蓮Saussurea involucrata Kar et Kir.系菊科鳳毛菊屬的高山草本植物，又名天山雪蓮，雪蓮花，雪荷花，主要分布于新疆天山和阿爾泰山一帶以及俄羅斯，蒙古，哈薩克斯坦等地，在天山，它主要生長在海拔2400-4100m的高山草甸，流石灘石隙等處，生存的條件惡劣。現代藥理研究表明雪蓮具有抗炎鎮痛、抗癌、擴張血管、降血壓、清除自由基、抗疲勞、終止妊娠和收縮子宮等作用。雪蓮次生代謝產物成分復雜，具有藥用活性的化合物主要集中在黃酮、生物堿和多糖類，是我國中藥中的珍稀名貴藥材。由于雪蓮的藥用和保健作用被廣泛認識，雪蓮的市場需求量大增，因此野生雪蓮亂采濫挖現象十分嚴重，加之人工栽培困難，雪蓮已被列為國家2級瀕危物種而受到保護！！雪蓮的組織培養雖然已有不少報道，但是在誘導多倍體方面未見報道。本方法結合組織培養技術，通過多倍體的研究為獲得藥用成分含量高，耐候性好的的雪蓮多倍體新品種提供技術。
多倍體植物在自然界中是普遍存在的，它們在生理上較二倍體有更強的適應性和遺傳上有較大的可塑性。四倍體植株與二倍體植株相比，莖略粗，葉片色澤較深，葉脈明顯，花較大，葉型較寬短，營養成分含量顯著提高，器官加大，藥用活性成分的含量增加！！同時增強了多倍體植株的生態適應性及對逆境的抗逆性！形成多倍體的細胞學機制細胞分裂是從核開始的，當核內染色體正在分裂，而整個細胞還沒有開始分裂時，外界條件發生劇烈變化，造成細胞質分裂暫時終止，抑制紡錘絲的形成，核內的染色體則照常進行復制，但不能拉向兩極，使全部子染色體包括在同一細胞中，當外界條件影響消失后，細胞再繼續分裂時，核內的染色體已增加了一倍，形成了多倍性細胞。
多倍體誘導中，誘導材料的選擇主要有愈傷組織，不定芽，莖尖，種子，子葉和葉片，根部等。
多倍體的主要特征(1)巨大性體現在葉寬，莖粗大，花朵大等器官增大的特征；(2)多倍體植株的生長發育一般比二倍體慢；(3)多倍體植株的不育性；(4)次生代謝成分增加。
多倍體的鑒定(1)形態鑒定法多倍體植株的巨大性為其早期形態學鑒定的依據；(2)氣孔鑒定法氣孔隨染色體數量的加倍而增加體積，單位面積內氣孔的數量隨著染色體數量的加倍而減小。例如四倍體氣孔長度明顯大于二部體氣孔長度，氣孔增大，而單位面積氣孔數量減少；(3)花粉粒鑒定法花粉粒大小與染色體的數量成正比；(4)染色體數目鑒定可以通過檢查花粉母細胞或根尖，莖尖細胞內染色體是否加倍，這是最基本也是最可靠的鑒定方法；(5)流式細胞儀鑒定流式細胞儀分析法可迅速測定細胞核內DNA的含量和細胞核大小，是大范圍實驗中鑒定倍性的快速有效的方法。
目前人工誘導多倍體的方法分為物理方法，生物技術方法和化學方法。
物理方法可以誘導多倍體的物理方法有溫度的激變、機械創傷、離心力、紫外線、x射線和滲透壓的改變，但這些方法的普遍缺陷就是嵌合率高，危害性大(射線)，誘導率低，誘變率僅在0.1％-1％之間。化學藥劑的使用完全取代了利用物理手段來獲得多倍體，上述方法已不常使用。
生物技術方法包括體細胞融合和遠緣雜交獲得多倍體，生物技術誘導多倍體，尚處于初步的探索階段，技術還不夠成熟，但前景廣闊。
化學方法可以誘導多倍體的化學藥劑很多，如秋水仙素、吲哚乙酸、萘駢乙烷、芫荽腦、苯及其衍生物、有機砷制劑、磺胺劑、藜蘆堿及其它植物堿、麻醉劑和生長素等不下二百種，但使用最多，最有效的為秋水仙素。
化學誘導的方法可分為原位誘導法和離體誘導法。
原位誘導法是也叫活體誘導法，即把供試植物的種子、正在生長的幼苗、莖尖等在非離體條件下用不同濃度的誘變劑處理，從而誘導染色體加倍。這是早期采用的一種多倍體誘導的方法，取得了一定的成效，現在仍然在一些植物上使用。原位誘導法包括浸漬法、注射法、瓊脂法、滴液法等。例如浸根法就是將植株從土壤中拔出來，洗凈根部泥土.然后將根浸泡在一定濃度秋水仙素溶液中一定時間.流水洗凈根部的藥液后，再把植株栽到土中；浸種法就是運用秋水素溶液直接浸泡種子；瓊脂法為在莖尖，子葉等處用含有秋水仙素的瓊脂做誘導處理。
離體誘導法是通過組織培養，在離體水平上誘導細胞內染色體加倍，然后獲得再生多倍體植株。選用的誘變材料通常有離體的莖尖、葉片、愈傷組織、胚狀體、原生質體、子房等，具有誘導率高、重復性強、實驗條件易于控制、獲得的多倍體嵌合率低等優勢，但受植物再生頻率低的限制。離體培養較之原位培養具有下面的四點最突出優點(1).效率高(2).鑒定方便(3).減少嵌合體(4).試驗條件易控制。因此目前離體培養在多倍體誘導中普遍采用。
多倍體誘導中有待解決的問題(1)秋水仙素的毒害作用秋水仙素有劇毒，對外植體有毒害作用.秋水仙素的毒害作用主要體現在誘導材料死亡，抑制根的生長和種子的萌發，抑制不定芽分化，再生植株生長緩慢或者生長停滯。目前可通過縮短繼代時間，增加繼代次數，使得外植體釋放體內積累的秋水仙素。(2)嵌合體現象這種現象的產生是由于在處理過程中，并不是全部分生細胞的染色體數都同樣的加倍，有可能是某些細胞加倍了，而有的細胞沒加倍。目前國內有報告采用不定芽技術，對多倍體進行穩定，從而大大提高了多倍體細胞的比率，如鄭思鄉等(1995)采用不定芽誘導技術對苧麻多倍體進行穩定，穩定效果很好，獲得的四倍體細胞高達94％。這是因為不定芽一般由一個或幾個表皮細胞發育而來，若這部分細胞是多倍體，則形成的不定芽即為完全多倍體。
目前國內多種藥用植物通過各種方法都得到了多倍體植株，但雪蓮多倍體的誘導未見報道。本方法針對雪蓮特殊的生理特性，結合組織培養技術，在多倍體誘導方面，對誘導材料的選擇，處理，加以改進促進多倍體的誘導率得到提高，從而得到了雪蓮多倍體植株。

發明內容
本發明的目的是通過雪蓮種子萌發產生無菌苗，然后將無菌苗根部、葉片切除，莖干部分接種于添加有二甲基亞砜和秋水仙素的出芽誘導培養基上進行誘導后，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的出芽誘導培養基上進行誘導出芽，然后對無菌苗的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性，從而得到了雪蓮多倍體植株。
本發明所述的雪蓮多倍體的誘導方法按下列步驟進行a、將雪蓮種子先用75％乙醇表面消毒20sec-50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min-15min，接著用15％H2O2溶液消毒30min-50min，將消毒后的種子用滅菌水漂洗4-7次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10-15粒種子，7-10天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；b、選擇生長30d-50d的無菌苗，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；c、將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加有二甲基亞砜2％-5％，秋水仙素濃度為100-500mg·L-1的出芽誘導培養基上，誘導2d～4d，出芽誘導培養基配方為MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1；d、無菌苗莖干誘導2d-4d后，轉移到不含秋水仙素與二甲基亞砜的出芽誘導培養基MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素處理的無菌苗莖干部分抽出新生芽，植株外觀與對照苗差異顯著，然后對新生芽的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性；e、染色體的檢測切取新生芽莖尖生長點，先置蒸餾水中于0-4℃冰箱處理12hr-24hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理6hr-12hr，接著用卡諾氏固定液為(乙醇∶冰乙酸＝3∶1)室溫下固定12-24hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理10min-15min，再用45％乙酸軟化5min-15min，之后再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色10min-30min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察即可。
本發明所述的雪蓮多倍體的誘導方法，與傳統的秋水仙素處理莖尖生長點不同，傳統方法一類是采用秋水仙素點滴，涂抹莖尖生長點，但由于雪蓮無菌苗的莖尖生長點深埋于莖干下部，難以用這些方法處理，且這些方法也不利于與組織培養相結合，使得在獲得多倍體苗后，通過組織培養方法進行擴繁；另一類是采用將莖段直接插入培養基中，但是基本上要保留葉片，或者保留根部。本發明對由種子產生的無菌苗采取根葉完全切除，僅保留莖干的處理，抑制原有葉片與根部的生長，同時在細胞分裂素的作用下，能夠充分刺激莖尖生長點的分裂，促進直接出芽，并且在二甲基亞砜(DMSO)的滲透作用下，更有利于秋水仙素作用于旺盛分裂的莖尖生長點細胞，提高四倍體細胞比例與多倍體植株的獲得率。本方法苗的誘導成活率高，植株體現出顯著的多倍體特征，并經過染色體檢測證明了該方法獲得了多倍體雪蓮苗，莖尖生長點細胞的染色體數量由2n＝2x＝32(圖7)轉變為2n＝4x＝64(圖8)，多倍體雪蓮的誘導率(誘導率＝多倍體植株株數/處理的雪蓮苗株數)最高達到33％。


參見附1為本發明雪蓮無菌苗處理圖，其中A生長30-50天的雪蓮無菌苗，B根葉完全切除后，保留下來的莖干部分。
圖2為本發明沒有加入秋水仙素的對照圖。
圖3為本發明加入秋水仙素100mg·L-1處理2d后得到多倍體植株圖。
圖4為本發明加入秋水仙素300mg·L-1處理3d后得到多倍體植株圖。
圖5為本發明加入秋水仙素400mg·L-1處理3d后得到多倍體植株圖。
圖6為本發明加入秋水仙素500mg·L-1處理4d后得到多倍體植株圖。
圖7為本發明二倍體雪蓮染色體數目為32條圖2n＝2x＝32圖8為本發明四倍體雪蓮染色體數目為64條圖2n＝4x＝具體實施方式
實施例1將雪蓮(S.involucrata)種子先用75％乙醇表面消毒20sec，然后用0.1％-HgCl2溶液消毒7min，接著用15％H2O2溶液消毒30min，將消毒后的種子用滅菌水漂洗4次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10粒種子，7天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；選擇生長30d的無菌苗30株，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加有二甲基亞砜(DMSO)為2％，秋水仙素濃度為100mg·L-1的出芽誘導固體培養基上，誘導2d，出芽誘導固體培養基配方為MS+6-BA 0.1mg·L-1+TDZ0.3mg·L-1；無菌苗莖干誘導3d后，轉移到不含秋水仙素的出芽誘導固體培養基MS+6-BA 0.1mg·L-1+TDZ0.3mg·L-1上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素誘導的無菌苗莖干部分長出新生芽，與對照株相比，葉片短小，植株矮小，生長緩慢，然后對新生芽的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性；染色體的檢測切取新生芽莖尖生長點，先置蒸餾水中于0℃冰箱處理12hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理6hr，接著用卡諾氏固定液(乙醇∶冰乙酸為3∶1)室溫下固定12hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理10min，再用45％乙酸軟化5min，再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色10min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察，無菌苗經過100 mg·L-1的秋水仙素處理2d后，多倍體的誘導率達到33％(誘導率＝多倍體植株株數/30)。
實施例2將雪蓮種子先用75％乙醇表面消毒30sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，接著用15％H2O2溶液消毒40min，將消毒的種子用滅菌水漂洗5次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種12粒種子，8天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；選擇生長35d的無菌苗30株，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于二甲基亞砜3％，秋水仙素濃度為300mg·L-1的出芽誘導培養基上，誘導3d，出芽誘導固體培養基配方為MS+6-BA 0.3mg·L-1+TDZ0.6mg·L-1；無菌苗莖干誘導3d后，轉移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.3mg·L-1+TDZ0.6mg·L-1出芽誘導固體培養基上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素誘導的無菌苗莖干部分長出新生葉，與對照株相比，葉片短小，植株矮小，生長緩慢，然后對新生葉的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性；染色體的檢測切取新生葉莖尖生長點，先置蒸餾水中于1℃冰箱處理15hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理8hr，接著用卡諾氏固定液(乙醇∶冰乙酸為3∶1)室溫下固定15hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理12min，再用45％乙酸軟化10min，再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色15min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察，無菌苗經過300mg·L-1的秋水仙素處理3d后，多倍體的誘導率達到7％(誘導率＝多倍體植株株數/30)。
實施例3雪蓮(S.involucrata)種子先用75％乙醇表面消毒35sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，接著用15％H2O2溶液消毒45min，將消毒的種子用滅菌水漂洗6次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種13粒種子，9天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；選擇生長40d的無菌苗30株，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加二甲基亞砜4％，秋水仙素濃度為400 mg·L-1的出芽誘導培養基上，誘導3d，出芽誘導固體培養基配方為MS+6-BA 0.6mg·L-1+TDZ0.8mg·L-1；無菌苗莖干誘導3d后，轉移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.6mg·L-1+TDZ0.8 mg·L-1出芽誘導固體培養基上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素誘導的無菌苗莖干部分長出新生芽，與對照株相比，葉片短小，木質化程度高，植株矮小，生長緩慢，然后對新生芽的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性；染色體的檢測切取新生芽莖尖生長點，先置蒸餾水中于2℃冰箱處理20hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理10hr，接著用卡諾氏固定液(乙醇∶冰乙酸為3∶1)室溫下固定20hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理14min，再用45％乙酸軟化12min，再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色20min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察，無菌苗經過400mg·L-1的秋水仙素處理3d后，多倍體的誘導率達到10％(誘導率＝多倍體植株株數/30)。
實施例4雪蓮種子先用75％乙醇表面消毒50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒15min，接著用15％H2O2溶液消毒50min，將消毒的種子用滅菌水漂洗7次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種15粒種子，10天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；選擇生長50d的無菌苗30株，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加二甲基亞砜5％，秋水仙素濃度為500mg·L-1的出芽誘導固體培養基上，誘導4d，出芽誘導固體培養基配方為MS+6-BA 0.9mg·L-1+TDZ1.1mg·L-1；無菌苗莖干誘導4d后，轉移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.9mg·L-1+TDZ1.1mg·L-1出芽誘導固體培養基上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素誘導的莖干部分長出新生芽，與對照株相比，葉片短小，植株矮小，生長緩慢，然后對新生芽的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性。
染色體的檢測切取新生芽莖尖生長點，先置蒸餾水中于4℃冰箱處理24hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理12hr，接著用卡諾氏固定液(乙醇∶冰乙酸為3∶1)室溫下固定24hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理15min，再用45％乙酸軟化15min，之后再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色30min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察，顯微鏡下觀察發現，無菌苗經過500mg·L-1的秋水仙素處理4d后，多倍體的誘導率達到7％(誘導率＝多倍體植株株數/30)。
權利要求
1.一種雪蓮多倍體的誘導方法，其特征在于該方法按下列步驟進行a、將雪蓮種子先用75％乙醇表面消毒20sec-50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min-15min，接著用15％H2O2溶液消毒15min-50min，將消毒后的種子用滅菌水漂洗4-7次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10-15粒種子，7-10天后雪蓮種子萌發產生無菌苗；b、選擇生長30d-50d的無菌苗，將其根部、葉片完全切除，僅保留莖干部分；c、將切割后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加有二甲基亞砜2％-5％，秋水仙素濃度為100-500mg·L-1的出芽誘導培養基上，誘導2d～4d，出芽誘導培養基配方為MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1；d、無菌苗莖干誘導2d-4d后，轉移到不含秋水仙素與二甲基亞砜的出芽誘導培養基MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1上誘導出芽，20天后，經過秋水仙素處理后的無菌苗莖干部分抽出新生芽，植株外觀與對照苗差異顯著，然后對新生芽的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性；e、染色體的檢測切取新生芽莖尖生長點，先置蒸餾水中于0-4℃冰箱處理12hr-24hr，然后轉移到0.002mol·L-18-羥基喹啉溶液處理6hr-12hr，接著用卡諾氏固定液為乙醇∶冰乙酸＝3∶1室溫下固定12-24hr，用蒸餾水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解離處理10min-15min，再用45％乙酸軟化5min-15min，之后再用蒸餾水洗凈，將其置于改良苯酚品紅溶液中染色10min-30min，壓片，最后在顯微鏡下鏡檢觀察即可。
全文摘要
本發明涉及一種雪蓮多倍體的誘導方法，該方法是針對雪蓮特殊的生理特性，通過雪蓮種子萌發產生無菌苗，然后將切除根葉后保留下來的無菌苗莖干部分接種于添加有二甲基亞砜和秋水仙素的出芽誘導培養基上進行誘導后，再轉移到不含二甲基亞砜和秋水仙素的出芽誘導培養基上進行誘導出芽，經過秋水仙素處理的無菌苗抽出新芽，植株外觀與對照苗差異顯著，然后對無菌苗的莖尖生長點做染色體檢測以確定染色體的倍性，從而得到了雪蓮多倍體植株。
文檔編號C12Q1/68GK101019508SQ20071008925
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月19日 優先權日2007年3月19日
發明者張蜀敏, 王曉軍, 郝秀英, 徐琴 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所