一種文冠果的組織培養快繁方法
【專利摘要】本發明公開了一種文冠果的組織培養快繁方法，即通過植物細胞工程技術解決文冠果（ Xanthocerassorbifolia Bunge）發芽率低、嫁接成活率低和扦插生根困難的問題，在短時間內獲得具有人們所需要的優良性狀的文冠果試管苗。本發明以文冠果種胚為外植體，通過愈傷組織誘導、繼代培養、不定芽分化、生根培養以及試管苗馴化移栽等階段實現了文冠果的組織培養快速繁殖。為大力發展文冠果大規模種植提供大量優質茁壯的種苗，同時也為文冠果的遺傳轉化等基因工程研究提供實驗材料。
【專利說明】 一種文冠果的組織培養快繁方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種文冠果的組織培養快繁方法。

【背景技術】
[0002]文冠果Uanthoceras sorbifolia^unge)屬無患子科文冠果屬的一種落葉灌木或者是小喬木，是我國極其珍貴的木本藥用、油用植物。文冠果的樹干和樹枝叫文冠木，味甘、性涼，具有祛風濕，消腫止痛，斂干黃水等療效，是治療類風濕性關節炎、風濕性心瓣膜病和淋巴結腫大的傳統藥物。另外，文冠果油的脂肪酸種類非常豐富，脂肪酸的含量接近60%，有的品種含量更高，且不飽和脂肪酸的含量達90%以上，因此文冠果是一種優質的能源植物。
[0003]文冠果作為一種木本植物，在組織培養過程中出現很多問題，如愈傷誘導率低、褐變、生根困難等，其研究仍處于初期階段，尚未建立完整的離體快繁體系，因此有必需建立文冠果的組織培養快繁技術，為文冠果規模化種植提供大量優質茁壯的文冠果種苗。


【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種文冠果的組織培養快繁方法，本發明以文冠果種胚為外植體，通過愈傷組織誘導、繼代培養、不定芽分化、生根培養以及試管苗馴化移栽等階段實現了文冠果的組織培養快速繁殖。從而在人工控制的條件實現文冠果種苗的快速繁殖，獲得大量試管苗，進而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種文冠果的組織培養快繁方法，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選擇文冠果成熟種胚為外植體，置于60?80°C溫水中自然晾卻至室溫浸泡5?8h，然后用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?1min,無菌水沖洗3?5次，剝去種皮后置于75?80%乙醇溶液中浸泡20?60s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?5min，無菌水沖洗3?5次后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導:將消毒好的種胚切成大約3?5mm3的組織塊，并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養20?30天，然后置于每天光照10?11小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織。
[0007](3)繼代培養:愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至繼代培養基中進行繼代培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，25?30天繼代一次。
[0008](4)不定芽誘導:將培養至30?40天的長勢良好的愈傷組織轉接至芽誘導培養基中進行不定芽誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養10?15天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽。
[0009](5)生根培養:將分化出的芽長至3?5cm接種至生根培養基中進行根誘導，接種后先在25?28°C條件下全暗培養5?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至長出根。
[0010](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中。
[0011]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+ L O?2.0mg/L2, 4-D+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的繼代培養基為:MS+0.1?1.0mg/L 2，4-D+0.5?2.0mg/LΝΑΑ+0.5 ?1.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的芽誘導培養基為:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?3.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(5 )所述的生根培養基為:1/2MS+1?3mg/L ΙΒΑ+0.1?0.5mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0015]本發明解決文冠果(ZafliAocera1S sorbifolia^mge)發芽率低、嫁接成活率低和扦插生根困難的問題，在短時間內獲得具有人們所需要的優良性狀的文冠果試管苗。

【具體實施方式】
[0016]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0017]實施例1
1、外植體的處理:選擇文冠果成熟種胚為外植體，置于60°C溫水中自然晾卻至室溫浸泡5h，然后用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒2min，無菌水沖洗5次，剝去種皮后置于75%乙醇溶液中浸泡20s，無菌水沖洗5次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒2min，無菌水沖洗5次后接種，成功率達65%。
[0018]2、愈傷組織誘導:將消毒好的種胚切成大約3?5mm3的組織塊，并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25°C條件下全暗培養20天，然后置于每天光照10小時，光照強度為1500X，培養溫度為25°C的條件下培養直至形成愈傷組織，所述的誘導培養基為:MS+ 1.0mg/L2, 4-D+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8，愈傷組織誘導率達87%以上。
[0019]3、繼代培養:愈傷組織生長至15天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至繼代培養基中進行繼代培養，接種后先在25°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養，26天繼代一次，所述的繼代培養基為:MS+0.lmg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5%% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05%% 活性炭，pH值為5.8。
[0020]4、不定芽誘導:將培養至30天的長勢良好的愈傷組織轉接至芽誘導培養基中進行不定芽誘導培養，接種后先在25°C條件下全暗培養10天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養直至形成不定芽，所述的芽誘導培養基為:MS+0.lmg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0021]5、生根培養:將分化出的芽長至3?5cm接種至生根培養基中進行根誘導，接種后先在25°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照12小時，光照強度為2000χ，培養溫度為25°C的條件下培養35天后長出根，所述的生根培養基為l/2MS+lmg/L IBA+0.lmg/LNAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值 5.8。
[0022]6、試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中，成活達89%。
[0023]實施例2
1、外植體的處理:選擇文冠果成熟種胚為外植體，置于70°C溫水中自然晾卻至室溫浸泡5h，然后用含有0.03%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min，無菌水沖洗3次，剝去種皮后置于78%乙醇溶液中浸泡25s，無菌水沖洗5次，再用含有0.03%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min，無菌水沖洗5次后接種，成功率達73%。
[0024]2、愈傷組織誘導:將消毒好的種胚切成大約3?5mm3的組織塊，并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在28°C條件下全暗培養23天，然后置于每天光照11小時，光照強度為1500x，培養溫度為28°C的條件下培養直至形成愈傷組織，所述的誘導培養基為:MS+ 1.5mg/L2, 4-D+2.8%蔗糖+0.38%瓊脂+0.07%活性炭，pH值為5.8，愈傷組織誘導率達88%以上。
[0025]3、繼代培養:愈傷組織生長至20天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至繼代培養基中進行繼代培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，培養溫度為28°C的條件下培養，30天繼代一次，所述的繼代培養基為:MS+0.6mg/L 2，4_D+2mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA+2.5%% 蔗糖 +0.35%% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH值為5.8。
[0026]4、不定芽誘導:將培養至32天的長勢良好的愈傷組織轉接至芽誘導培養基中進行不定芽誘導培養，接種后先在28°C條件下全暗培養10天，然后置于每天光照13小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養直至形成不定芽，所述的芽誘導培養基為:MS+0.3mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0027]5、生根培養:將分化出的芽長至3?5cm接種至生根培養基中進行根誘導，接種后先在25°C條件下全暗培養6天，然后置于每天光照12小時，光照強度為2000χ，培養溫度為25°C的條件下培養35天后長出根，所述的生根培養基為1/2MS+1.2mg/L IBA+0.4mg/LNAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值 5.8。
[0028]6、試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中，成活達90%。
【權利要求】
1.一種文冠果的組織培養快繁方法，其特征在于包括以下工藝步驟: (1)外植體的處理:選擇文冠果成熟種胚為外植體，置于60?80°C溫水中自然晾卻至室溫浸泡5?8h，然后用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?1min,無菌水沖洗3?5次，剝去種皮后置于75?80%乙醇溶液中浸泡20?60s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?5min，無菌水沖洗3?5次后備用； (2)愈傷組織誘導:將消毒好的種胚切成大約3?5mm3的組織塊，并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養20?30天，然后置于每天光照10?11小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織； (3)繼代培養:愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至繼代培養基中進行繼代培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，25?30天繼代一次； (4)不定芽誘導:將培養至30?40天的長勢良好的愈傷組織轉接至芽誘導培養基中進行不定芽誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養10?15天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽； (5)生根培養:將分化出的芽長至3?5cm接種至生根培養基中進行根誘導，接種后先在25?28°C條件下全暗培養5?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至長出根； (6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中。
2.根據權利要求1所述的一種文冠果的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+ 1.0?2.0mg/L2, 4-D+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據權利要求1所述的一種文冠果的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(3)所述的繼代培養基為:MS+0.1 ?1.0mg/L 2，4-D+0.5 ?2.0mg/L ΝΑΑ+0.5 ?1.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
4.根據權利要求1所述的一種文冠果的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(4)所述的芽誘導培養基為:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?3.0mg/L 6-BA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
5.根據權利要求1所述的一種文冠果的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(5)所述的生根培養基為:1/2MS+1 ?3mg/L ΙΒΑ+0.1 ?0.5mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?.0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK104285816SQ201410607808
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】楊業容 申請人:楊業容