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關于聯邦資助的研究和開發下作出的發明的權利的聲明

本發明根據由國立癌癥研究院(National Institute of Cancer，NCI)授予的撥款號CA 127541和由國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的撥款號P30CA033572在政府資助下作出。政府享有本發明中的某些權利。

發明背景

抗代謝藥物羥基脲(HU)已用于治療多種人癌癥，包括慢性骨髓源性白血病、頭頸部癌癥和其它癌癥(1)。它的主要抗癌靶標是使核糖核苷酸還原成它們的相應脫氧形式以供給dNTP來達成DNA復制和修復的核糖核苷酸還原酶(RR)(3,4)。人RR由hRRM1和hRRM2亞單位組成(3,4)。在基因毒性刺激之后，替代性RR酶被誘導以供給dNTP來達成DNA修復，該酶由hRRM1和p53R2(hRRM2的由腫瘤抑制蛋白p53反式活化的同源物)組成(5)。在細胞內，已知HU通過淬滅自由基介導的催化(3)的氧化轉化(6)產生自由基來抑制兩種類型的RR(4)。然而，在藥理學上，HU療法因體內半衰期短暫和成問題的副作用而受損，該副作用最特別是骨髓抑制以及胃腸和皮膚病學影響(7)。

聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)和PARP2均是在腫瘤發展中具有作用的ADP核糖基轉移酶(ART)。具有PARP活性的ART成員(諸如PARP1)含有具有高度保守的活性位點序列的保守催化結構域(12-14)。在單鏈DNA斷裂之后，PARP1從β-NAD+底物合成ADP-核糖聚合物，并且將這些聚合物轉移至接受體蛋白質(其自身或其它蛋白質)的谷氨酸、賴氨酸或天冬氨酸殘基中，該聚合物隨后由聚(ADP-核糖)糖基水解酶(PARG)降解。在單鏈DNA斷裂修復(SSBR)或堿基切除修復(BER)期間，PARP1和PARP2與X射線修復互補蛋白-1(XRCC1)相互作用以將SSBR/BER因子DNA聚合酶β或DNA連接酶III募集至DNA損害位點(12-14)。在無PARP1下，在DNA復制期間持續存在單鏈斷裂將導致復制叉停滯，其解決需要BRCA1或BRCA2介導的同源性修復(HR)(15,16)。BRCA1連同BRCA2一起是與家族性乳腺癌的發作相關聯的腫瘤抑制基因(11)。在不存在BRCA1下，雙鏈斷裂因此積累，從而通過凋亡來導致細胞死亡。BRCA1/2缺陷性腫瘤可對PARP1抑制劑敏感，但可遭受對PARP1抑制劑的獲得性抗性。因此，本領域中對避免與當前療法相關的副作用和/或獲得性抗性的BRCA1/2缺陷性腫瘤治療存在需要。因此，本文提供對本領域中這些和其它問題的解決方案。

發明簡述

本文尤其公開通過施用有效量的COH29(包括其藥學上可接受的鹽)來治療BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者的癌癥的方法。也公開通過以組合協同量施用COH29(包括其藥學上可接受的鹽)和DNA損害性抗癌劑來治療受試者的癌癥的方法。

附圖簡述

圖1A-1B.BRCA1狀態影響COH29細胞毒性和抗腫瘤活性：圖1A：與COH29一起孵育72小時并被溶解的表達wt(野生型)BRCA1(OV90)或突變BRCA1(UWB1.289)的卵巢癌細胞的劑量響應曲線(細胞活力通過MTT測定來評估)，并且描繪的各點代表用誤差棒指示的三個獨立實驗的平均值；用HCC1937(圖1B)和HCC1937+BRCA1(圖1C)細胞在雌性NSG小鼠的乳腺脂肪墊中產生的腫瘤外植體的生長(如所指示用COH29或媒介物治療小鼠-結果是來自4只小鼠/組的腫瘤測量結果的平均值±標準誤差)。

圖2A-2B.患者群組中RRM2表達與PARP1的關聯。(圖2A)乳腺癌和(圖2B)卵巢癌中的從公共臨床結果數據庫提取的RRM2和PARP1表達的回歸圖。

圖3A-3B.COH29抑制BRCA1缺陷性人乳腺癌細胞中的PARP1：圖3A)：使用Materials&Methods中所述的程序，一式兩份評估COH29對表達突變或wt BRCA1(在各情況下，wt＝+BRCA1)的各對等基因乳腺(HCC1937)和卵巢(UWB1.289)癌細胞系中的PARP1活性的影響；圖3B：通過使用抗人PARP1抗體作為初級抗體進行蛋白質印跡分析來評估COH29對等基因HCC1937/HCC1937+BRCA1細胞系中的PARP1蛋白表達的影響。裝載對照是β-肌動蛋白。

圖4A-4B:.BRCA1對在用COH29和順鉑雙重處理之后的細胞可存活性的影響：圖4A：用固定濃度的COH29(12.5μΜ)加順鉑(12.5、25、50和100μΜ)處理24小時的HCC1937和HCC1937+BRCA1細胞的通過MTT測定所評估的活力(描繪的各點代表用誤差棒指示的三個獨立實驗的平均值)；圖4B：在單獨5μΜCOH29、單獨4μΜ順鉑或兩種藥物在相同濃度下的組合存在下，所指示細胞中的24小時活力的直方圖(顯示的是三個獨立實驗的平均值)。

圖5A-5D.COH29相較于HU在斑馬魚基因毒性測定中的作用：圖5A：暴露于如所指示的HU的在4dpf(受精后天數)時的野生型斑馬魚胚胎(眼和心臟發育方面的形態學變化由箭頭指示)。圖5B：一系列不同濃度的HU對斑馬魚的影響的柱狀圖(0、5、10、20、50mM，n＝50，一式三份進行)。圖5C：暴露于如所指示的COH29的在4dpf時的野生型斑馬魚胚胎。圖5D：一系列不同濃度的COH29對斑馬魚的影響的柱狀圖(0、10、20、50、100μΜ，n＝46，一式三份進行)。

圖6.COH29處理使DNA損害檢查點活化。COH29處理對表達wt p53(MCF-7)或p53缺陷性(MCF-7p53-/-)的人乳腺癌細胞中以及三重陰性乳腺癌細胞(MDA-MB-468)中的DNA損害檢查點蛋白質的影響，通過蛋白質印跡所評估。

圖7A-7D.在BRCA1野生型人肺癌細胞中，COH29活化DDR，并且抑制RAD51表達。圖7A：通過蛋白質印跡分析來評估COH29對細胞質和核中的DDR相關蛋白質的影響，其中用COH29在指示的劑量下處理細胞48小時，并且使用指示的抗體，使細胞溶解產物經受免疫印跡(FOXO3活性由它的下游靶標p27Kip1的水平指示，并且β-微管蛋白和核纖層蛋白A/C代表細胞質和核提取物的分級分離和裝載對照)；圖7B-7D：通過間接免疫熒光測定來評估COH29對DDR相關蛋白質磷酸ATM(圖7B)、γ-Η2ΑΧ(圖7C)和磷酸p53(圖7D)與foxo3在核中共定位的影響。對于各蛋白質，分析平均300個染色細胞，并且直方圖顯示具有陽性核(≥5個灶)的細胞的百分比(％)，其中生物學重復實驗的數目是3，誤差棒代表標準偏差(SD)，并且P值(配對t檢驗)如所指示。

圖8A-8B.COH29對NHEJ DNA修復的影響。在所示劑量下的單獨或與順鉑組合的COH29的活性，通過在使細胞暴露于藥物24小時之后對EJ2(圖8A)(替代性NHEJ路徑)或EJ5(圖8B)(NHEJ路徑)細胞進行FACS分析所評估。

圖9A-9B.COH29抑制人肺癌細胞中的RAD51：圖9A：使用抗人RAD51抗體作為初級抗體，通過間接免疫熒光測定來評估COH29對RAD51蛋白的作用。圖9B：使用抗人RAD51抗體作為用于分析的初級抗體(裝載對照是β-肌動蛋白)，通過蛋白質印跡分析來評估COH29對RAD51蛋白的作用；用COH29在指示的劑量下處理A549肺癌細胞24小時，并且在COH-29處理之后的γ-Η2ΑΧ表達樣式也類似地分析于圖9A和9B中。

發明詳述

定義

“患者”、“受試者”、“有需要的患者”和“有需要的受試者”在本文中可互換使用，并且是指罹患或易患可通過施用COH29或COH29與如本文討論的其它抗癌劑組合來治療的疾病或病狀的活生物體。在實施方案中，疾病或病狀是癌癥。受試者的非限制性實例包括人、其它哺乳動物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、綿羊、母牛、鹿和其它非哺乳動物動物。在實施方案中，患者是人。

如本文所用的“癌癥受試者”是指患有如本文所述的癌癥的受試者。癌癥受試者可患有至少一種本文所述的癌癥。因此，舉例來說，癌癥受試者可指“乳腺癌受試者”(例如患有乳腺癌的受試者)或“卵巢癌受試者”(例如患有卵巢癌的受試者)。癌癥受試者可患有展現特定基因型或表型特征(例如缺陷性基因產物或對特定抗癌劑的抗性)的癌癥。因此，癌癥受試者可為“BRCA1缺陷性受試者”，其中BRCA1缺陷性受試者是患有包括BRCA1缺陷性基因或BRCA1缺陷性蛋白(例如“BRCA1缺陷”)的癌的受試者。在實施方案中，“BRCA1缺陷性受試者”是指至少部分地直接或間接導致受試者的癌癥的BRCA1基因非表達(例如相對于對照或健康受試者，表達降低)，在受試者中不存在功能性BRCA1(例如相對于對照或健康受試者，數量降低)，或BRCA1表達降低。在實施方案中，BRCA1缺陷性受試者顯示BRCA1基因非表達，在受試者中不存在功能性BRCA1。癌癥受試者可為“PARP1抑制劑抗性受試者”，其中PARP1抑制劑抗性受試者是患有對至少一種如本領域中已知的PARP1抑制劑具有抗性的癌癥的受試者。癌癥受試者可為“DNA損害性抗癌劑抗性受試者”，其中此受試者患有對至少一種如本領域中已知的DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。癌癥受試者可患有展現超過一種基因型或表型特征的癌癥(例如乳腺癌受試者可患有具有BRCA1缺陷和對至少一種PARP1抑制劑的抗性的癌癥)。

“COH29”是指具有式(N-(4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羥基苯甲酰胺)的化合物：

COH29和它的合成描述于整體并入本文的美國專利號：7,956,076；8,372,983以及國際申請號：PCT/US 13/24490中。

可向本文所述的癌癥受試者，包括例如乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者施用COH29。施用可在如本文闡述的治療有效量下。

“BRCA1”是根據它的常見普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質及其功能性片段和同源物。該術語包括重組或天然存在形式的BRCA1(例如乳腺癌1，早期發作；GI編號：1698399)或其維持BRCA1活性的變體(例如相較于BRCA1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內)。

“γ-Η2ΑΧ”是根據它的常見普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質及其功能性片段和同源物。該術語包括任何重組或天然存在形式的γ-Η2ΑΧ(例如γ組蛋白H2AX；GI編號：4504253)或其維持γ-Η2ΑΧ活性的變體(例如相較于γ-Η2ΑΧ，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內)。

“Rad51”是根據它的常見普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質及其功能性片段和同源物。該術語包括任何重組或天然存在形式的Rad51(例如GI編號：49168602)或其維持Rad51活性的變體(例如相較于Rad51，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內)。

“PARP1”是根據它的常見普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質及其功能性片段和同源物。該術語包括任何重組或天然存在形式的PARP1(例如聚[ADP-核糖]聚合酶1；GI編號：156523968)或其維持PARP1活性的變體(例如相較于PARP1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內)?！癙ARP1抑制劑”是抑制PARP1(NAD⁺ADP-核糖基轉移酶1)的活性的組合物(例如化合物、肽、蛋白質、核酸或抗體)。

“PARP1抑制劑”是通過抑制PARP1的活性或表達來有效治療癌癥的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。PARP1抑制劑的非限制性實例包括奧拉帕尼(olaparib)、維利帕尼(veliparib)、依尼帕尼(iniparib)和尼拉帕尼(niraparib)。

“DNA損害性抗癌劑”是通過損害DNA來有效治療癌癥的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。DNA損害性抗癌劑可為化學治療劑。在實施方案中，DNA損害劑包括輻照(例如γ輻照)。DNA損害性抗癌劑的相互作用可直接的(例如與DNA自身結合或相互作用)或間接的(例如與和DNA相互作用的其它分子結合或相互作用)。在本文中，DNA損害性抗癌劑包括例如烷基化劑(例如氮丙啶、甲基蜜胺、亞硝基脲、氮芥、白消安、環磷酰胺和甲基芐肼)、抗代謝劑、蒽環霉素、基于鉑的藥劑、紫杉烷、激酶抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(HDAC)、拓撲異構酶抑制劑和核苷酸類似物。在實施方案中，DNA損害性抗癌劑包括插入在DNA堿基對之間或結合在DNA的小溝或大溝中的組合物。在實施方案中，DNA損害性抗癌劑是拓撲異構酶I藥劑、喜樹堿、伊立替康、拓撲替康、拓撲異構酶II藥劑、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素(adriamycin)(例如阿霉素(doxorubicin))、依托泊苷、單鏈斷裂劑(例如BCNU(卡莫司汀)、CCNU(洛莫司汀))、DTIC(達卡巴嗪)、癌得星(Cytoxan)(環磷酰胺)、異環磷酰胺、博萊霉素和絲裂霉素C。

“化學治療”或“化學治療劑”是根據它的平常普通含義使用，并且是指具有抗贅生性質或抑制細胞生長或增殖的能力的化學組合物或化合物。

抗癌藥物順鉑已用于治療各種人癌癥，包括例如卵巢癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、小細胞肺癌、淋巴瘤、頭頸部癌和膀胱癌。在本文中，“基于鉑的化合物”或“含有鉑的藥劑”是指含有由有機和/或無機官能基圍繞的中心鉑原子的化合物，其包括重金屬絡合物。包括在基于鉑的化合物內的是基于鉑的藥物?；阢K的化合物的非限制性實例包括順鉑、卡鉑、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑、賽特鉑(satraplatin)、三鉑(triplatin)、四硝酸鹽、其藥學上可接受的鹽、其立體異構體、其衍生物、其類似物及其組合。術語“順鉑”包括衍生物和類似物，諸如以引用的方式整體并入本文的美國專利號4,177,263、4,584,316、5,648,362和5,399,694中所述的那些。

順鉑抗癌活性主要源于靶標細胞中的DNA交聯，此需要涉及順鉑氯離子與親核試劑基團的交換反應。順鉑通過與d(GpG)或d(ApG)序列形成鏈內加合物來在DNA中導致二齒損傷。順鉑也能夠產生可干擾DNA復制的鏈間交聯。損傷使DNA損害檢查點活化，從而導致細胞周期進展阻滯?；颊咧行纬衫^發性腫瘤代表與順鉑療法相關的一個主要問題。順鉑的其它副作用可包括腎毒性、神經毒性、惡心、耳毒性、骨髓毒性和電解質不平衡。順鉑抗性也見于癌癥患者中。

術語“治療(treating/treatment)”是指在治療或改善損傷、疾病、病變或病狀方面的任何成功跡象，包括任何客觀或主觀參數，諸如減輕；緩解；減弱癥狀或使得損傷、病變或病狀更可為患者耐受；減緩退化或衰退速率；使得退化終點的致虛弱性較??；改進患者的身體或精神健康狀態。對癥狀的治療或改善可基于客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神病學測驗和/或精神病學評估的結果。術語“治療”及其變化形式包括預防損傷、病變、病狀或疾病。

如本文所用，術語“癌癥”是指見于哺乳動物中的所有類型的癌癥、贅瘤、惡性或良性腫瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、腎癌和胰腺癌。額外實例包括白血病(例如急性骨髓性白血病(“AML”)或慢性骨髓源性白血病(“CML”))、腦癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、肉瘤和前列腺癌、子宮頸癌、胃癌、頭頸部癌、子宮癌、間皮瘤、轉移性骨癌、神經管母細胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多、原發性巨球蛋白血病、原發性腦腫瘤、惡性胰腺胰島瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、惡變前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、內分泌和外分泌胰腺贅瘤。

術語“白血病”廣泛指代形成血液的器官的進行性惡性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白細胞和它們的前體的增殖和發育不正常。白血病通?；谝韵录右耘R床分類：(1)疾病的持續時間和特性-急性或慢性；(2)涉及的細胞的類型-骨髓性(骨髓源性)、淋巴性(淋巴源性)或單核細胞性；以及(3)血液中的異常細胞的數目增加或不增加-白血病性或非白血性(亞白血病性)。鼠類白血病模型被廣泛接受為可預測體內抗白血病活性。據信無論所治療的白血病的類型如何，在P388細胞測定中測試為陽性的化合物都將通常展現一定抗白血病活性水平。因此，本發明包括一種治療白血病的方法，包括治療急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜堿粒細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性粒細胞性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、嗜酸性粒細胞性白血病、格羅斯白血病(Gross'leukemia)、毛細胞白血病、血母細胞性白血病、造血母細胞性白血病、組織細胞性白血病、干細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、白細胞減少性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴母細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴肉瘤細胞性白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞白血病、小髓母細胞性白血病、單核細胞性白血病、髓母細胞白血病、骨髓性白血癥、骨髓性粒細胞性白血病、髓單核細胞性白血病、內格利白血病、漿細胞白血病、多發性骨髓瘤、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、里德爾細胞白血病、席林氏白血病(Schilling's leukemia)、干細胞性白血病、亞白血病性白血病和未分化細胞性血病。

術語“肉瘤”通常是指由如同胚性結締組織的物質構成的腫瘤，并且通常由包埋在原纖維或均質物質中的緊密堆積的細胞組成?？捎每官樕虼冀Y合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、腺泡狀軟組織肉瘤、釉母細胞性肉瘤、葡萄樣肉瘤、綠色瘤肉瘤、絨毛膜癌、胚性肉瘤、韋爾姆斯氏腫瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宮內膜肉瘤、基質肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纖維母細胞性肉瘤、巨細胞肉瘤、粒細胞性肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特發性多發性色素沉著出血性肉瘤、B細胞的免疫母細胞性肉瘤、淋巴瘤、T細胞的免疫母細胞性肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤、庫普弗細胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間質瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、網織紅細胞性肉瘤、勞斯肉瘤、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛細管擴張性肉瘤。

術語“黑素瘤”用于意指由皮膚和其它器官的黑素細胞系統產生的腫瘤?？捎每官樕虼冀Y合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的黑素瘤包括例如肢端雀斑黑素瘤、無黑色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克勞德曼氏黑素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑素瘤、哈丁-帕西黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑素瘤、惡性小痣黑素瘤、惡性黑素瘤、結節性黑素瘤、甲下黑素瘤和淺表擴散性黑素瘤。

術語“癌瘤”是指由傾向于浸潤周圍組織并導致轉移的上皮細胞構成的惡性新生物。可用抗贅生硫醇結合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的示例性癌瘤包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺癌、腎上腺皮質癌、肺泡癌、肺泡細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌、基底細胞樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管源性癌、髓樣癌(cerebriform carcinoma)、肝小膽管癌、絨膜癌、膠樣癌、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、皮膚癌、柱狀癌、柱狀細胞癌、導管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚性癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、凝膠樣癌(gelatinifomi carcinoma)、凝膠狀癌、巨細胞癌(giant cell carcinoma)、巨細胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺性癌、粒層細胞癌、毛發基質癌(hair-matrix carcinoma)、血樣癌、肝細胞癌、許特萊細胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌、腎上腺樣癌、嬰兒胚性癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、克龍派切爾氏癌(Krompecher's carcinoma)、庫爾契茨基細胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌、豆狀癌(lenticular carcinoma)、豆狀癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤性癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液細胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌、骨樣癌、乳頭狀癌、門靜脈周圍癌、侵襲前癌、棘細胞癌、髓樣癌(pultaceous carcinoma)、腎臟腎細胞癌、貯備細胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤樣癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭形細胞癌、海綿樣癌、鱗狀癌、鱗狀細胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴張性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管擴張性癌(carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、結節性癌(carcinoma tuberosum)、結節性癌(tuberous carcinoma)、疣狀癌(verrucous carcinoma)和絨毛狀癌。

“癌癥模型生物體”是展現指示癌癥的表型或在生物體內展現致癌要素的活性的生物體(例如癌細胞系)。癌癥模型生物體可展現如本文所述的癌癥的表型。因此，癌癥模型生物體可為例如對PARP1抑制劑具有抗性，或對DNA損害性抗癌劑具有抗性的缺乏BRCA1的癌細胞系。廣泛多種生物體可充當癌癥模型生物體，并且包括例如癌細胞和哺乳動物生物體，諸如嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)和靈長類動物(諸如人)。癌細胞系被本領域技術人員廣泛理解為與體內癌展現類似表型或基因型的細胞。如本文所用的癌細胞系包括來自動物(例如小鼠)以及來自人的細胞系。

“抗癌劑”是根據它的平常普通含義使用，并且是指具有抗贅生性質或抑制細胞生長或增殖的能力的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。在一些實施方案中，抗癌劑是化學治療劑。在一些實施方案中，抗癌劑是本文鑒定的在治療癌癥的方法中具有效用的藥劑。在一些實施方案中，a抗癌劑是由FDA或除美國以外的國家的類似管理機構核準用于治療癌癥的藥劑。抗癌劑可對某些癌癥或某些組織具有選擇性。

如本文所用，術語“施用”意指口服施用，以栓劑形式施用，經表面接觸，靜脈內、胃腸外、腹膜內、肌肉內、病變內、鞘內、鼻內或皮下施用，或向受試者中植入緩慢釋放裝置，例如小型滲透泵。施用是通過任何途徑來達成，包括胃腸外和經粘膜(例如經頰、舌下、經腭、經齒齦、經鼻、經陰道、經直腸或經皮)。胃腸外施用包括例如靜脈內、肌肉內、小動脈內、皮內、皮下、腹膜內、室內和顱內。其它遞送模式包括但不限于使用脂質體制劑、靜脈內輸注、經皮貼片等。

就“共同施用”來說，其意指在施用一種或多種額外療法的同時，就在此舉之前或就在此舉之后施用本文所述的組合物。舉例來說，可向患者單獨施用COH29，或可向患者共同施用COH29。共同施用意圖包括個別地或以組合形式(超過一種化合物或藥劑)同時或依序施用化合物。因此，當需要時，也可使制劑與其它活性物質組合(例如以降低代謝降解)。

本文公開的組合物可配制成涂敷棒、溶液劑、混懸劑、乳液、凝膠劑、乳膏劑、軟膏劑、糊劑、膠狀物、涂劑、粉劑和氣霧劑，通過經表面途徑來經皮遞送?？诜苿┌ㄟm于由患者攝取的片劑、丸劑、粉劑、糖衣片、膠囊、液體、糖錠、扁囊劑、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸液等。固體形式制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和可分散顆粒劑。液體形式制劑包括溶液、混懸液和乳液，例如水溶液或水/丙二醇溶液。本發明的組合物可另外包括用以提供持續釋放和/或舒適性的組分。所述組分包括高分子量陰離子擬粘液聚合物、膠凝性多糖和精細分散的藥物載體基質。這些組分更加詳細討論于美國專利號4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中。這些專利的整個內容出于所有目的以引用的方式整體并入本文。本文公開的組合物也可以微球體形式遞送以達成在體內緩慢釋放。舉例來說，微球體可通過皮內注射在皮下緩慢釋放的含有藥物的微球體(參見Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；以可生物降解和可注射的凝膠制劑形式(參見例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)；或以用于口服施用的微球體形式(參見例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)來施用。在另一實施方案中，本發明的組合物的制劑可通過使用與細胞膜融合或被胞吞的脂質體來遞送，即通過采用連接于脂質體的結合細胞的表面膜蛋白受體，從而導致胞吞作用的受體配體。通過使用脂質體，特別是當脂質體表面攜帶對靶標細胞具有特異性，或另外優先針對特定器官的受體配體時，可使本發明的組合物的遞送在體內集中至靶標細胞中。(參見例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。組合物也可以納米粒子形式遞送。

“有效量”是相對于在不存在化合物下，所述化合物的足以實現陳述的目的的量(例如實現它被施用所用于達成的效應，治療疾病，降低酶活性，增加酶活性，減弱信號傳導路徑，或減輕疾病或病狀的一種或多種癥狀)?！爸委熡行Я俊钡囊粚嵗亲阋源龠M對疾病的一種或多種癥狀的治療、預防或減輕的量，其也可被稱為“治療有效量”?！皽p輕”一種或多種癥狀(以及這個短語的語法等效形式)意指降低所述癥狀的嚴重性或發生次數，或消除所述癥狀。精確量將取決于治療目的，并且將可由本領域技術人員使用已知技術確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro編,Lippincott,Williams&Wilkins)。

向哺乳動物施用的劑量和頻率(單次或多次劑量)可視多種因素而變化，例如所述哺乳動物是否罹患另一疾病以及它的施用途徑；接受者的身材、年齡、性別、健康狀況、體重、身體質量指數和膳食；所治療的疾病的癥狀的性質和程度、并行治療的種類、由所治療的疾病所致的并發癥或其它健康相關問題。其它治療方案或藥劑可與申請人的本發明的方法和化合物聯合使用。調整和操作確立的劑量(例如頻率和持續時間)完全屬于本領域技術人員的能力。

本文所述的治療有效量可最初由細胞培養測定加以確定。靶標濃度將為活性化合物的能夠實現本文所述的方法的那些濃度，如使用本文所述或本領域中已知的方法所測量。

如本領域中所熟知，用于人中的治療有效量也可由動物模型確定。舉例來說，可配制用于人的劑量以實現已被發現在動物中有效的濃度。如上所述，可通過監測化合物有效性以及向上或向下調整劑量來調整人中的劑量?；谏鲜龇椒ê推渌椒ㄕ{整劑量以在人中實現最大功效完全屬于普通熟練技術人員的能力。

劑量可視患者的需求和所采用的化合物而變化。在本發明的情形下，向患者施用的劑量應足以隨時間在患者中實現有益治療響應。劑量的大小也將由任何不利副作用的存在性、性質和程度決定。確定適于特定情況的劑量屬于從業者的技能。通常，治療以小于化合物的最優劑量的較小劑量啟始。此后，以小增量增加劑量直至達到在各情況下的最優效應。劑量和間隔可個別地加以調整以提供施用化合物的對所治療的特定臨床適應癥有效的水平。這將提供與個體的疾病狀態的嚴重性相稱的治療方案。

如本文所定義，關于蛋白質-抑制劑相互作用的術語“抑制(inhibition/inhibit/inhibiting)”等意指相對于在不存在抑制劑下蛋白質的活性或功能，負性影響(例如降低)蛋白質的活性或功能。當關于抑制某一基因使用時，“抑制”意指相對于在不存在抑制劑下所述基因的活性或表達，負性影響(例如降低)所述基因的活性或表達。在一些實施方案中，抑制是指減輕疾病或疾病的癥狀。在一些實施方案中，抑制是指降低特定蛋白質或核酸靶標的活性。因此，抑制至少部分地包括部分或完全阻斷刺激，降低、阻止或延遲活化，或使信號轉導或酶活性或蛋白質的量失活、脫敏或下調。

術語“協同”、“協同作用”、“協同的”、“組合協同量”和“協同治療作用”在本文中可互換使用，并且是指組合施用的化合物的測量作用，其中所述測量作用大于單獨施用的各化合物的個別作用的總和。

方法

在第一方面的是一種治療有需要的受試者的癌癥的方法。所述方法包括向受試者施用有效量的COH29。受試者是如本文闡述的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者。因此，在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者。受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個。因此，受試者可為BRCA1缺陷性受試者以及PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(即癌癥具有BRCA1缺陷和對PARP1抑制劑或DNA損害性抗癌劑中的至少一個的抗性)。

在實施方案中，受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者、胰腺癌受試者、黑素瘤受試者、白血病受試者或肉瘤受試者。

受試者可為乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。受試者可為乳腺癌受試者。受試者可為卵巢癌受試者。受試者可為結腸癌受試者。受試者可為肝癌受試者。受試者可為腎癌受試者。受試者可為肺癌受試者或非小細胞肺癌受試者。受試者可為腦癌受試者。受試者可為前列腺癌受試者。受試者可為胰腺癌受試者。受試者可為黑素瘤受試者。受試者可為白血病受試者。受試者可為肉瘤受試者。

癌癥受試者(例如乳腺、卵巢、肺、前列腺或胰腺癌受試者)也可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個。因此，在實施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者。在實施方案中，癌癥受試者是PARP1抑制劑抗性受試者。在實施方案中，癌癥受試者是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。在實施方案中，癌癥受試者是PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

因此，在實施方案中，受試者是患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者。BRCA1缺陷性受試者可患有乳腺癌。BRCA1缺陷性受試者可患有卵巢癌。

在實施方案中，受試者是患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者。PARP1抑制劑抗性受試者可患有乳腺癌。PARP1抑制劑抗性受試者可患有卵巢癌。

在實施方案中，受試者是患有特征在于對至少一種包括但不限于順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、VP16、CPT11或喜樹堿的DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實施方案中，受試者是患有乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。

在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實施方案中，受試者是PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者和BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個。因此，在實施方案中，乳腺癌受試者也是BRCA1缺陷性受試者。在實施方案中，乳腺癌受試者也是PARP1抑制劑抗性受試者。在實施方案中，乳腺癌受試者也是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對PARP1抑制劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有對PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。

在實施方案中，癌癥受試者是卵巢癌受試者和BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個。因此，在實施方案中，卵巢癌受試者也是BRCA1缺陷性受試者。在實施方案中，卵巢癌受試者也是PARP1抑制劑抗性受試者。在實施方案中，卵巢癌受試者也是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對PARP1抑制劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有對PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。

在實施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者、胰腺癌受試者、黑素瘤受試者、白血病受試者或肉瘤受試者。在實施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。在實施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者。在實施方案中，癌癥受試者是卵巢癌受試者。

受試者可患有如本文所述的癌癥，其中所述癌癥展現BRCA1缺陷、對PARP1抑制劑的抗性或對DNA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個。癌癥可為乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌癥可為一種上文提及的具有BRCA1缺陷的癌癥。癌癥可為一種上文提及的對PARP1抑制劑具有抗性的癌癥。癌癥可為一種上文提及的對DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。

在實施方案中，癌癥具有BRCA1缺陷以及對PARP1抑制劑的抗性或對DNA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個。在實施方案中，癌癥對PARP1抑制劑具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或對DNA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個。在實施方案中，癌癥對DNA損害性抗癌劑具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或對PARP1抑制劑的抗性中的至少一個。

癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。癌癥可為乳腺癌。癌癥可為卵巢癌。癌癥可為結腸癌。癌癥可為肝癌。癌癥可為腎癌。癌癥可為肺癌或非小細胞肺癌。癌癥可為腦癌。癌癥可為前列腺癌。癌癥可為胰腺癌。癌癥可為黑素瘤。癌癥可為白血病。癌癥可為肉瘤。

在實施方案中，施用COH29使癌癥受試者(例如BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者)中特定蛋白質的活性或表達降低。抑制可由COH-29結合靶標蛋白質所致，此可通過蛋白酶體募集來誘導蛋白質的降解。蛋白質水平變化轉而可調節相應基因的表達樣式。在實施方案中，COH29抑制受試者中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表達?？蛇M行分析(例如微陣列分析)以鑒定由于COH29治療而差異性表達的基因。因此，施用COH29可降低受試者中BRCA1蛋白活性或表達。施用COH29可降低受試者中PARP1蛋白活性或表達。施用COH29可降低受試者中Rad51蛋白活性或表達。受試者可為如本文所述的癌癥受試者，包括其實施方案。在實施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者或胰腺癌受試者。癌癥受試者可為乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

在實施方案中，可將COH29治療的BRCA1缺陷性受試者的RNA表達譜與COH29治療的BRCA1+(例如完整BRCA1)癌癥受試者的RNA表達譜進行比較。因此，在實施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制蛋白質的活性或表達。因此，在實施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制Rad51。在實施方案中，COH29通過合成致死性(synthetic lethality)來治療BRCA1缺陷性受試者。BRCA1缺陷性受試者如本文所述，包括其實施方案。在實施方案中，BRCA1缺陷性受試者也是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

在實施方案中，施用COH29使癌(例如是BRCA1缺陷性或對PARP1抑制劑或DNA損害性抗癌劑中的任一者或兩者具有抗性的癌)中特定蛋白質的活性或表達降低。抑制可由COH-29結合靶標蛋白質所致，此可通過蛋白酶體募集來誘導蛋白質的降解。蛋白質水平變化轉而可調節相應基因的表達樣式。在實施方案中，COH29抑制癌中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表達?？蛇M行分析(例如微陣列分析)以鑒定由于COH29治療而差異性表達的基因。因此，施用COH29可降低癌中BRCA1蛋白活性或表達。施用COH29可降低癌中PARP1蛋白活性或表達。施用COH29可降低癌中Rad51蛋白活性或表達。癌癥可為如本文所述的癌癥，包括其實施方案。在實施方案中，癌癥是乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、腦癌、前列腺癌或胰腺癌。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。

在實施方案中，可將用COH29治療的BRCA1缺陷性癌的RNA表達譜與用COH29治療的BRCA1+癌的RNA表達譜進行比較。因此，在實施方案中，COH29在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制蛋白質的活性或表達。COH29可在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制Rad51。在實施方案中，COH29通過合成致死性來治療BRCA1缺陷性癌癥。癌癥可為如本文所述的癌癥，包括其實施方案。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。

COH29可通過合成致死性來展現對BRCA1缺陷性人癌癥的特異性。因此，在實施方案中，COH29治療BRCA1缺陷性受試者，包括其實施方案。在實施方案中，合成致死性由抑制BRCA1缺陷性癌中的第二蛋白質引起。第二蛋白質可為PARP1。可將具有BRCA1缺陷的癌的表達譜與BRCA1+癌細胞進行比較。在實施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1活性降低約10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，在實施方案中，相比于BRCA1+癌細胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌細胞中的PARP1活性。在實施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1表達降低約5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。因此，在實施方案中，相比于BRCA1+癌細胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌細胞中的PARP1表達。

施用COH29可抑制受試者中的DNA修復。施用COH29可抑制堿基切除修復(BER)(例如通過例如使用特定糖苷酶移除受損害的堿基以修正由于氧化、烷基化、脫氨和脫嘌呤/脫嘧啶損害而產生的堿基損傷來修復受損害的DNA)。施用COH29可抑制核苷酸切除修復(NER)(例如通過移除短單鏈DNA區段來修正產生龐大DNA加合物的DNA損害，諸如由UV暴露所致的損害)。施用COH29可抑制受試者中的雙鏈DNA斷裂修復(例如使用非同源性末端接合(NHEJ路徑)、微同源介導的末端接合(MMEJ)路徑，或通過同源性重組(HR))。施用COH29可抑制受試者中的堿基切除修復、核苷酸切除修復或雙鏈DNA斷裂修復。

在實施方案中，可通過檢測例如像ATM、foxo3、γ-Η2ΑΧ、p53或Rad51的蛋白質的經調節活性或表達來評估COH29的基因毒性概況以及因此它活化DNA損害檢查點和誘導DNA損害的能力。

調節可為蛋白質的活性或表達增加或蛋白質的活性或表達降低。因此，在實施方案中，施用COH29使受試者中的γ-Η2ΑΧ活性或表達增加。在實施方案中，施用COH29使受試者中的γ-H2AX活性或表達增加。施用COH29可使受試者中的γ-H2AX活性或表達增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。γ-Η2ΑΧ活性或表達增加可指示對DNA損害檢查點的活化和對DNA損害的誘導。在實施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其實施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表達增加。在實施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其實施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表達增加。在實施方案中，施用COH29使三重陰性乳腺癌中的γ-Η2ΑΧ活性或表達增加。因此，在實施方案中，施用有效量的COH29治療三重陰性乳腺癌。

COH29可抑制DNA雙鏈斷裂(DSB)修復。DSB可通過例如同源性重組(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路徑來修復。在實施方案中，COH29抑制HR。在實施方案中，COH29抑制NHEJ路徑?？赏ㄟ^抑制HR修復中涉及的蛋白質(例如像BRCA1和Rad51)的蛋白質水平來延長DNA損害響應。在實施方案中，施用COH29使受試者中或癌中的Rad51活性或表達降低。在實施方案中，施用COH29使受試者中或癌中的BRCA1活性或表達降低。在實施方案中，受試者中或癌中的BRCA1或Rad51的表達得以降低。在實施方案中，受試者中或癌中的BRCA1和Rad51的表達得以降低。

在另一方面的是一種治療有需要的受試者的癌癥的方法。所述方法包括以組合協同量施用COH29和DNA損害性抗癌劑。在實施方案中，受試者如本文所述，包括其實施方案。因此，在某些實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者或PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為BRCA1缺陷性受試者。受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者。

癌癥可為乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。因此，在實施方案中，受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。受試者可為乳腺癌受試者。受試者可為卵巢癌受試者。受試者也可展現一種或多種如本文所述的表型或基因型，包括其實施方案(例如乳腺癌受試者也可為BRCA1缺陷性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者)。在實施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可患有對DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。本文方法可通過共同施用有效量的COH29來提供對癌癥的治療，所述癌癥對至少一種DNA損害性抗癌劑具有抗性。

在實施方案中，DNA損害性抗癌劑是化學治療性DNA損害劑。DNA損害性抗癌劑可為烷基化劑。DNA損害性抗癌劑可為如本文所述的抗代謝劑，包括其實施方案。DNA損害性抗癌劑可為蒽環霉素。DNA損害性抗癌劑可為基于鉑的藥劑。DNA損害性抗癌劑可為紫杉烷。DNA損害性抗癌劑可為激酶抑制劑。DNA損害性抗癌劑可為組蛋白脫乙?；敢种苿?。DNA損害性抗癌劑可為拓撲異構酶抑制劑。DNA損害性抗癌劑可為核苷酸類似物。在實施方案中，在DNA損害性癌癥藥劑和COH29存在下，對癌癥的抑制得以協同增加。

在實施方案中，治療方法包括以合成致死性抑制至少兩種蛋白質。至少一種蛋白質可為BRCA1。至少一種蛋白質可為Rad51。至少一種蛋白質可為PARP1。在實施方案中，對PARP1的抑制可在BRCA1缺陷性受試者中。在實施方案中，在DNA損害性抗癌劑和COH29存在下，對PARP1的抑制得以協同增加。DNA損害性抗癌劑可為吉西他濱、γ輻照或順鉑，包括它的如本文闡述的衍生物。

DNA損害性抗癌劑可為順鉑，包括它的如本文所述的衍生物。在實施方案中，施用COH29使順鉑的細胞毒性增加至大于順鉑在單獨施用時的細胞毒性的水平(例如以組合協同量一起施用COH29和順鉑)。順鉑是一種廣泛使用的化學治療劑，其抗癌活性主要歸因于靶標細胞中的DNA交聯。因此，在實施方案中，共同施用COH29和順鉑導致的癌細胞可存活性降低大于在單獨施用COH29或順鉑時的癌細胞可存活性降低(例如以組合協同量一起施用COH29和順鉑)。

DNA損害性抗癌劑可為吉西他濱。在實施方案中，共同施用COH29和吉西他濱導致的癌細胞可存活性降低大于在單獨施用COH29或吉西他濱時的癌細胞可存活性降低(例如以組合協同量一起施用COH29和吉西他濱)。DNA損害性抗癌劑可為γ輻照。在實施方案中，施用COH29以及用γ輻照治療導致的癌細胞可存活性降低大于在單獨施用COH29或γ輻照時的癌細胞可存活性降低。COH29可在用γ輻照治療之前、期間或之后施用。

實施例

DNA損害性藥物的功效受細胞DNA修復能力高度影響和調節(9)。實際上，小分子DNA修復抑制劑已在臨床前研究中與常規化學療法藥物組合(18)，從而指示DNA修復機構是新型癌癥治療的有前途靶標。此外，PARP抑制劑已在臨床試驗中與鉑化學療法組合(19,20)。與這些報道一致，尤其發現COH29增強細胞對順鉑的敏感性，尤其在BRCA1缺乏性細胞中。這表明COH29合成致死性依賴于HR缺乏性細胞中的NER或BER。因此，在不受任何特定理論束縛下，我們提出COH29干擾若干DNA修復路徑(NER、BER和HR)會促進在存在或不存在順鉑下在BRCA1缺乏性細胞中觀察的細胞毒性。因此，COH29可作為有效力的DNA修復抑制劑加以利用。

所有細胞系都從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA,USA)獲得。將細胞在37℃下于5％CO₂中維持在具有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺以及每毫升培養基100U青霉素和100μg鏈霉素(Sigma)的RPMI 1640培養基(Mediatech)中。為分離HCC1937+BRCA1細胞，用表達全長BRCA1cDNA的pcDNA3.1質粒轉染親本HCC1937細胞。選擇穩定轉染子克隆，并且用于藥物敏感性測定。對于穩定轉染，根據制造商說明書，使用6轉染試劑(Roche Molecular Biochemical,Monza,Italy)使在30-40％匯合下的細胞與2mg質粒DNA一起孵育過夜。接著在嘌呤霉素(1μg/ml)(Invitrogen Life Technologies,La Jolla,CA,USA)中選擇細胞。在20至30天之后，擴增并篩選由HCC1937轉染獲得的有活力的嘌呤霉素抗性菌落。通過蛋白質印跡分析來測定穩定表達嘌呤霉素，并且保留生長潛力的克隆的BRCA1表達。通過蛋白質印跡分析，我們評估BRCA1表達在嘌呤霉素抗性cDNA/轉染子細胞中的恢復。這些經轉染細胞顯示BRCA1蛋白表達增加，從而表明蛋白質表達的有效恢復。

在City of Hope合成和純化COH29。γ-Η2AX購自cell signaling(Danvers,MA,USA)。Rad51購自Novus(Littleton,CO,USA)。β-肌動蛋白來自Millipore(Billerica,MA,USA)。對FOXO3(H-144和N-16，1:1000)、磷酸H2AX絲氨酸-139(γ-Η2ΑΧ，1:1,000)、磷酸p53絲氨酸-15(p53-pS15，1:1,000)、Rad51(1:1000)、β-微管蛋白(1:1000)、核纖層蛋白A/C(1:2000稀釋度)、PARP具有特異性的抗體以及抗小鼠和抗兔IgG從Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)獲得。針對FOXO3(1:1,000)和磷酸ATM絲氨酸-1981(ATM-pS1981，1:1,000稀釋度)的Ab分別從Epitomics(Burlingame,CA)和Millipore(Billerica,MA)獲得。針對p53-pS15的Ab購自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)?？筽27Kip1Ab購自BD PharMingen(San Diego,CA)。Alexa 488(綠色)和Alexa 594(紅色)綴合的二級Ab從Molecular Probes(Eugene,OR)獲得?？雇肐gG(完整分子)-FITC抗體購自Sigma(St.Louis,MO,USA)。RHODAMINE RED-X^TM山羊抗小鼠IgG購自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。

如先前所述進行免疫熒光實驗(21,22)。具體來說，使A549細胞在玻璃蓋片上生長。在用COH29(1或10μΜ)處理24或48小時之后，用4％多聚甲醛固定細胞10分鐘，并且用TRITON^TM X-100(0.5％)進行可滲透化處理。蓋片用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并且用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻斷，與對FOXO3或ATM-pS1981或γ-Η2ΑΧ或p53-pS15具有特異性的Ab(1:50-1:200稀釋度)一起孵育，隨后與Alexa 488綴合的抗兔或抗小鼠(1:200)、Alexa 594綴合的抗山羊(1:100)二級Ab(Molecular Probes)一起孵育。使細胞與4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)一起孵育以使核染色。觀察特異性染色，并且用Leica SP2AOBS共焦激光掃描顯微鏡捕集圖像。為測量灶陽性細胞，我們使用約300個通過共焦顯微術隨機捕集的細胞。由含有至少5個灶的細胞計算視為灶陽性細胞的百分比。呈現的各誤差棒是標準偏差的平均值。

對于亞細胞分級分離，用胰蛋白酶處理細胞，并且用冷PBS溶液洗滌兩次。在1,200g下離心5分鐘之后，在冰上于補充有蛋白酶抑制劑(各自5μg/ml的抑肽素(pepstatin)、亮肽素(leupeptin)和抑蛋白酶肽(aprotinin))和磷酸酶抑制劑，含有0.2％NONIDET^TM P-40(NP-40)的緩沖液(50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA)中孵育細胞5分鐘。在1,000g下離心5分鐘之后，收集上清液(即細胞質部分)，并且用相同緩沖液洗滌集結塊兩次。在冰上用含有0.5％NP-40的分級分離緩沖液提取洗滌樣品達40分鐘以獲得核部分。所有樣品都加以超聲處理，并且通過在16,000g下離心15分鐘來澄清化。所有部分的蛋白質濃度都用Bio-Rad蛋白質測定(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)加以測定。如先前所述進行免疫印跡(21,22)。簡要來說，使等量的煮沸蛋白質樣品經受SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，并且轉移于硝化纖維素膜(Bio-Rad Laboratories)上。將膜在含3％BSA的含有0.05％吐溫20(Tween 20)的Tris緩沖鹽水(TBST)中阻斷1小時，并且與在含有1％BSA的TBST中稀釋的初級抗體(1:500或1:1000)一起孵育1小時。在用TBST洗滌2次之后，使膜與辣根過氧化物酶綴合的二級Ab(1:3000稀釋度)一起在室溫下孵育1小時。用West-Q化學發光試劑盒(GenDEPOT,Barker,TX)觀察膠片上的免疫印跡。

通過與MTT一起孵育以及用微板讀取器在560nm的波長下監測由活細胞形成的MTT甲臜來進行MTT細胞毒性測定；使用下式確定存活率：

(A_測試–A_空白)/(A_對照–A_空白)x 100％。使用半自動基于熒光的數字成像顯微術系統(DIMSCAN)在96孔板中測定細胞毒性。DIMSCAN使用數字成像顯微術來定量選擇性積累FDA(二乙酸熒光素；Alfa Aesar,Ward Hill,MA)的活細胞。DIMSCAN能夠在通過數字定限和曙紅Y(eosin Y)(Mallinckrodt Baker,Center Valley,PA)淬滅來消除本底熒光之后，通過定量每孔總熒光(其與活細胞的數目成比例)來歷經4對數動態范圍測量細胞毒性。視細胞系生長速率而定，將細胞于100μL完全培養基中在每孔2,000至5,000個細胞下接種至96孔板中。在過夜孵育之后，將測試化合物于50μL培養基中在各種濃度下添加至各孔中。在37℃下與藥物一起孵育96小時之后，添加FDA(最終濃度：10mg/mL)和曙紅Y[最終濃度：0.1％(w/v)]至各孔中，并且在37℃下再孵育細胞20分鐘。接著使用DIMSCAN測量每孔總熒光，并且將結果表示為處理孔中的熒光與未處理孔中的熒光的比率(存活分數)。

原位腫瘤模型。根據由City of Hope的IACUC核準的方案進行小鼠實驗。因為HCC1937和HCC1937+BRCA1細胞形成緩慢生長腫瘤，所以使用MATRIGEL^TM(Becton-Dickinson Biosciences)將它們進行植入。為產生腫瘤，將4x 10⁶個細胞于200μL含有50％MATRIGEL^TM的無血清培養基中注射至一對8周齡雌性NSG小鼠的腹股溝區域周圍的乳腺脂肪墊中。一旦初始腫瘤達到直徑13mm，即將它們解剖出，切碎成3mm塊段，并且植入實驗小鼠的乳腺脂肪墊的腹股溝區域中。歷經28天時期測量腫瘤，并且對于各時間點，史都登t檢驗(student t-test)用于確定用含400mg/kg COH29的30％聚乙二醇硬脂酸酯(solutol)每日管飼與相應媒介物對照之間的統計顯著性。小于0.05的p值(雙側)被視為指示統計顯著性。

產生EJ2細胞以通過監測GFP的熒光強度來評估Alt-NHEJ，并且EJ5細胞用于如先前所述測定NJEJ。(23)將細胞接種至6孔板中，并且用COH29或順鉑在不同濃度下處理24小時。接著用胰蛋白酶處理細胞，洗滌，并且通過流式細胞計量術來分析。

如先前所述進行抗人BRCA1siRNA表達性質粒的構建(24)。因此，利用先前公布的抗人BRCA1siRNA序列(5’-UCACAGUGUCCU UUAUGUA-3’[SEQ ID NO:1]和5’-UACAUAAAGGACACUGUGA-3’[SEQ ID NO:2])。在各情況下，將編碼siRNA的退火寡核苷酸雙鏈體亞克隆至表達載體psiRNA-hHlzeo(InvivoGen,San Diego,CA,USA)中以在RNA聚合酶III依賴性H1RNA啟動子的控制下進行表達。通過電穿孔，用指示的質粒在等摩爾濃度下轉染細胞。

使用微型試劑盒(Qiagen Inc.)分離總RNA。以DNA酶I處理來移除基因組DNA污染。通過1％瓊脂糖凝膠(SeaKem,FMC,Rockland,ME,USA)電泳或用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)來考查分離的RNA的完整性。通過紫外分光光度測定法來確定RNA濃度(A₂₆₀/A₂₈₀比率)。使用MMLV逆轉錄酶和作為引物的隨機六聚體(Invitrogen)，從總RNA制備cDNA。通過實時PCR，使用cDNA樣品來定量基因表達。針對BRCA1的引物購自APPLIEDFoster City,CA,USA。根據APPLIED指導方針(PRIMER軟件；APPLIED)設計針對18S和β-肌動蛋白的額外引物和探針以符合實時PCR要求。引物的序列是

AGGAATTGCGGGAGGAAAATGGGT(SEQ ID NO:3)和

GCCCCCTGAAGATCTTTCTGTCCT(SEQ ID NO:4)。

根據制造商方案，使用PARP1化學發光測定試劑盒(BPS Bioscience,San Diego)測定PARP1活性。簡要來說，使用測試抑制劑、陽性對照、底物對照和空白反應，在25℃下用活化的DNA在PARP測定緩沖液中進行核糖基化反應1小時。通過抗生蛋白鏈菌素-HRP來檢測，其中在光度計中讀取化學發光底物A和B。

斑馬魚(Zebrafish/Danio rerio)從臺北醫學大學的斑馬魚核心研究室(zebrafish Core facility of Taipei Medical University)獲得，并且按照14小時光照/10小時黑暗循環維持在28℃下。在28℃下孵育胚胎，并且如所述確定不同發育階段(25)。在20hpf時用不同濃度的HU(0、5、10、20、50mM)或COH29(0、10、20、50、100μΜ)處理野生型胚胎以評估誘變效應。每個孔條件處理15個胚胎。在2、3、4、5和6dpf時觀察處理的胚胎。在6dpf時，測定展現發育異常的魚的百分比和存活率。使用Olympus LX70-FLA倒置熒光顯微鏡觀察胚胎。使用SPOT數字照相機系統(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,Michigan,USA)獲取圖像，并且用ImageJ軟件集合(26)。

使用GENOMICS SUITE^TM(6.6版；Partek,Inc.)對微陣列樣品進行RMA標準化(27)，并且如果基因顯示至少1.2倍變化和<0.05的假發現率(FDR)，那么它們被確定為差異性表達。使用Benjamini和Hochberg(28)的方法，由關于線性對比p值的ANOVA分布計算FDR值。在GENOMICS SUITE^TM內進行基因本體論(GO)(29)富集分析，并且以費雪精確檢驗(Fisher Exact test)p值<0.05將GO種類確定為顯著。

基于Ivshina等人研究，使用U133A&B(GSE4922)，由對289個石蠟包埋的乳腺癌腫瘤樣品的基因表達剖析來確定RRM2-PARP1關聯分析。(30)使用Bioconductor R程序包(64位，v 3.0.2)進行統計分析(31)。使用斯皮爾曼氏秩關聯(Spearman's rank correlation)進行關聯分析。P<0.05和r>0.5的水平被視為統計顯著。

如先前所公布(26)，在修改下進行含有SV40復制起點的pSVO+質粒的體外復制。最終25μL反應體積含有30mM HEPES(pH＝7.2)、7mM MgCl₂、0.5mM DTT、5μCi[α-³²P]-dCTP、1μΜdCTP、各自100μΜdTTP、dCTP和dGTP、各自200μΜCTP、UTP和GTP、4mM ATP、40mM磷酸肌酸、50μg肌酸磷酸激酶、50ng pSVO+、0.1-1.0μg T Ag(通過滴定測定確定的最優濃度)和最優量的HeLa提取物(通過滴定測定所確定)(Chimerx；Milwaukee,WI)。為定量DNA復制抑制，在開始反應之前使HeLa提取物與遞增濃度的COH29一起孵育30分鐘。添加HeLa-化合物混合物至其余SV40DNA復制組分中，在37℃下孵育1小時，在DE81濾紙上點樣，用100mM焦磷酸鈉(pH 7.4)和300mM甲酸銨(pH 7.4)洗滌，接著干燥。接著通過液體閃爍計數來測定并入新合成的子代DNA鏈中的放射性標記的物質的量。

在不受任何特定理論束縛下，COH29抗癌活性可至少部分地源于抑制人核糖核苷酸還原酶(hRR)，其是一種用于生物合成脫氧核糖核苷酸來達成DNA復制的酶。此外，作為堿基切除修復復合物的組分，核糖核苷酸還原酶也涉及于DNA修復中。因此，在實施方案中，在本文中發現COH29靶向修復復合物的若干額外組分。此外，在實施方案中，BRCA1缺陷性人乳腺癌或卵巢癌細胞比野生型BRCA1對應物對COH29更敏感。在實施方案中，在BRCA1突變細胞中，COH29展現與諸如順鉑的DNA交聯藥物協同。在實施方案中，在本文中發現COH29抑制RAD51，在不受任何特定理論束縛下，RAD51涉及于通過同源性重組(HR)路徑對雙鏈斷裂(DSB)的修復中。在實施方案中，COH29靶向多個DNA修復路徑，并且潛在調節由遺傳背景(突變)所致的備用DNA修復。在實施方案中，COH29可克服對PARP抑制劑(例如PARP1抑制劑)的獲得性抗性。在藥理學上，以及在不受任何特定理論束縛下，在本文中發現COH29抑制吉西他濱抗性人癌細胞增殖，并且與順鉑或γ輻照協同。

COH29是一種芳族取代的噻唑化合物，在不受任何特定理論束縛下，其占據hRRM2亞單位上位于hRRM1/hRRM2界面處的在結構上保守的配體結合袋。在實施方案中，與這個袋的結合抑制hRRM1/hRRM2裝配，從而有效抑制RR活性。在體外，在多個人癌細胞系中，COH29是活性的，并且顯示其是高度有效力的，其中在大多數情況下IC₅₀小于10μΜ。已顯示COH29在NCI-60細胞系組中具有廣泛活性，并且多個人乳腺癌細胞系(包括例如人卵巢癌細胞系)對COH29敏感(6)。乳腺癌和卵巢癌在突變BRCA1基因攜帶者中比在一般群體中以更大頻率發生(32)。因此，在本文中，探究的是BRCA1缺陷性人癌細胞是否對COH29顯示更大敏感性。實際上，如圖1A中所示，由于純合性2594delC突變而表達截短BRCA1蛋白的UWB1.289卵巢癌細胞系(33)比表達野生型BRCA1的OV90人卵巢癌細胞系(IC₅₀：31.57±3.35μΜ)對COH29更敏感(IC₅₀：12.30±1.15μΜ)。

評估COH29在具有相同遺傳背景，僅在BRCA1表達方面不同的乳腺癌細胞中的作用以確定突變BRCA1使細胞毒性增加的程度。首先，考查使BRCA1表達沉默的影響。HCC1937是導致內源性表達截短BRCA1蛋白的插入突變純合性人乳腺癌細胞(34)，并且HCC1937+BRCA1是表達人野生型BRCA1蛋白的穩定轉染子克隆。在這些細胞中，通過RNA干涉來抑制BRCA1表達。在用10μΜ COH29處理72小時之后，72％的用對照siRNA轉染的HCC1937+BRCA1細胞存活。相比之下，僅53％的用BRCA1siRNA轉染的細胞存活。通過比較HCC1937細胞和HCC1937+BRCA1細胞來探究恢復野生型BRCA1表達對COH29細胞毒性的影響。當用不同劑量的COH29處理72小時時，表達野生型BRCA1的細胞比BRCA1突變HCC1937細胞(IC₅₀：7.25±0.64μΜ)對COH29的敏感性小得多(IC₅₀：35.01±3.63μΜ)。實時逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)顯示HCC1937+BRCA1細胞表達BRCA1的水平比HCC1937高約2.5倍。

在原位腫瘤外植體模型中進一步確認BRCA1缺乏性細胞對COH29的敏感性。相較于媒介物，通過用400mg/kg COH29每日口服給藥，植入小鼠乳腺脂肪墊中的HCC1937腫瘤的生長得以顯著(p＝0.0007)抑制(圖1B)。相比之下，COH29治療小鼠中的用等基因HCC1937+BRCA1細胞產生的腫瘤不顯著小于媒介物對照中(p＝0.1577；圖1C)。

也考查卵巢癌細胞中BRCA1突變對COH29處理響應的影響。UWB1.289+BRCA1是表達人野生型BRCA1基因的卵巢癌細胞的穩定轉染子克隆，并且UWB1.289是用表達新霉素抗性基因的對照質粒轉染的親本細胞。用不同劑量的COH29處理這些細胞72小時。表達wt BRCA1的細胞對COH29的敏感性較小(IC50：對于UWB1.289+BRCA1和UWB1.289分別是23.52±2.38μΜ和12.30±1.15μΜ)。RT-PCR測定顯示UWB1.289+BRCA1細胞表達的BRCA1的水平比UWB1.289高約3.08倍。這些結果表明在BRCA1缺陷性人癌細胞中，COH29可誘導更大致死性。COH29的額外藥理學數據如表1和2所提供。特別重要的是發現COH29抑制對吉西他濱或順鉑具有抗性的各種人癌細胞的生長(表1)。

專利

代理人案號48440-541001WO

專利

代理人案號48440-541001WO

為鑒定COH29通過其來優先溶解BRCA1突變人癌細胞的機理，我們使用微陣列平臺進行全基因組微陣列分析以鑒定受COH29處理影響的基因表達譜和路徑。將COH29處理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌細胞的RNA表達譜與COH29處理的HCC1937+BRCA1細胞的RNA表達譜進行比較。HCC1937-COH29細胞與HCC1937+BRCA1-COH29細胞兩者均顯示DNA修復基因的基因本體論(GO)富集(表1a；p值在0.0046-0.0069的范圍內)，從而表明COH29干擾DNA修復路徑。舉例來說，在HCC1937細胞中，DNA修復中涉及的DNA連接得以更強烈富集，此可與表型效應相關。在BRCA1野生型細胞中，COH29誘導DNA損害信號傳導，并且抑制BRCA1和Rad51表達，從而表明COH29可抑制同源性重組(HR)路徑以維持由COH29活化的DDR(DNA損害響應)誘導的雙鏈斷裂(DSB)。

表1a.由于COH29處理而下調的基因的基因本體論富集

我們另外考查了公開可用的在乳腺癌和卵巢癌患者群組中進行的基因表達研究以驗證RRM2與PARP1之間的基因表達關聯。我們發現在Ivshina等人(30)的乳腺癌群組研究中(n＝289，P＝0，r＝0.56；圖2A)，以及在來自Anglesio等人(35)的卵巢癌群組研究中的RRM2和PARP1基因表達關聯分析中(n＝90，p＝0，r＝0.62；圖2B)，在RRM2與PARP1之間存在強烈關聯。未來在所選患者群組中的基因型-表型關聯可有助于確定用COH29與傳統乳腺和卵巢化學療法組合進行靶向治療的風險概況。

為探究COH29通過其來優先溶解BRCA1突變人癌細胞的機理，我們設法鑒定靶標蛋白質。在不受任何特定理論束縛下，我們推理靶標蛋白質的表達譜可通過與COH29相互作用而受影響。舉例來說，COH-29與靶標蛋白質結合可通過蛋白酶體募集來誘導它的降解。蛋白質水平變化轉而可改變相應基因的表達樣式。進行微陣列分析以鑒定由于COH29處理而差異性表達的基因。將COH29處理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌細胞的RNA表達譜與COH29處理的HCC1937+BRCA1細胞的RNA表達譜進行比較。差異性表達的基因的群集顯示于圖2A-2B中。

為確定COH29是否抑制hPARP1，考查用或不用COH29處理4小時、8小時或24小時的細胞的溶解產物中的PARP1活性。在缺乏BRCA1的人乳腺癌HCC1937細胞中，24小時COH29孵育使PARP1活性降低41.08％(726177cps(針對未處理)對427851cps(針對COH29處理))，而在類似處理的含有BRCA1的HCC1937+BRCA1細胞中，它降低了12.66％(2336878cps(針對未處理)對2041097cps(針對COH-29處理))(圖3A)。

在UWB1.289人卵巢癌株系中，PARP1受COH29抑制更顯著(圖3A)。在8小時COH29處理之后，在缺乏BRCA1的UWB1.289細胞中，PARP1活性降低了31.79％(113559cps(針對未處理)對774611(針對COH29處理))，而在類似處理的表達wt BRCA1的UWB1.289+BRCA1細胞中，它升高了46.31％(145769cps(針對未處理)對2129944cps(針對COH29處理))。總之，這指示在BRCA1缺陷性人癌細胞中，COH29以更大功效抑制PARP1。

也考查COH29對PARP1蛋白水平的影響。用COH29處理24小時使HCC1937BRCA1缺陷性乳腺癌細胞中的PARP1蛋白減弱，以及在較小程度上使HCC1937BRCA1wt細胞中的PARP1蛋白減弱(圖3B)。對于4小時COH29處理，觀察到少許降低。相比之下，ABT-888處理4小時導致HCC1937細胞中的PARP1顯著降低，而與它們的BRCA1狀態無關(圖3B)。

在BRCA1突變細胞背景下通過抑制PARP1實現的合成致死性可加強DNA損害性藥物的細胞毒性。(18)在此處，我們探究在BRCA1缺陷性人癌細胞中，由COH29抑制PARP1是否增強順鉑的細胞毒性。順鉑是一種廣泛使用的化學治療劑，其抗癌活性主要歸因于靶標細胞中的DNA交聯。表達wt BRCA1的人乳腺癌株系HCC1937的穩定轉染子(HCC1937+)或對照轉染子(HCC1937)細胞用COH29和順鉑同時處理24小時。在用兩種藥物處理之后，當相較于HCC1937+BRCA1細胞時，在HCC1937細胞中存在可存活性顯著降低(圖4A)。并行進行的對照實驗顯示用單獨COH29或單獨順鉑進行單次處理對兩種細胞系產生較小但類似的水平的影響(圖4B；也參見表3)。在COH29與吉西他濱或γ輻照之間觀察到額外協同(表2)。

表2：COH29與各種抗贅生治療劑的協同

ND；未進行

已知RR抑制性藥物羥基脲具有基因毒性(36,37)。預期COH29具有類似結果，因為它也抑制RR。在人細胞中，所述損害使DNA損害檢查點活化以停止細胞周期進展來允許有時間進行修復。在不受任何特定理論束縛下，由DNA損害引發的信號傳導最初由‘共濟失調-毛細血管擴張突變物’(ATM)和‘ATM和Rad 3相關物’(ATR)介導。Chk1和Chk2代表信號傳導事件的下游激酶，其使Cdc25磷酸酶磷酸化。抑制Cdc25轉而會抑制Cdk/周期素復合物，從而導致細胞周期阻滯(39)。為評估COH29處理對DNA損害檢查點的作用，我們采用兩種在p53狀態方面不同的細胞系。COH29處理含有野生型p53的MCF7細胞使DNA損害檢查點活化(圖6左側圖版)，如由ATM的磷酸化所證實。下游激酶CHK1和CHK2也被磷酸化。在缺乏p53的MCF7細胞(MCF-7p53-/-)中，在COH29處理之后，這些蛋白質也被類似地修飾(圖6中心圖版)。在DNA損害之后，ATM或ATR使γ-Η2ΑΧ磷酸化以將修復蛋白質募集至受損害的DNA的位點(39)。在兩種細胞系中，在COH29處理之后，均存在γ-Η2ΑΧ水平增加。因此，COH29處理以p53非依賴性方式使DNA損害檢查點活化。最后，考查COH29在表達降低水平的孕酮受體、雌激素受體和Her2受體的‘三重陰性’人乳腺癌細胞中的影響(33)。當用COH29處理MDA-MB-468細胞時，觀察到以上激酶的類似活化概況(圖6，右側圖版)。

進一步評估COH29在BRCA1野生型細胞中的作用。如圖7A中所示，COH29也誘導γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM在核中積累。此外，觀察到在COH29處理的細胞中，在核中對foxo3和它的靶標蛋白質p27的誘導(圖7A)。此外，我們通過共焦免疫熒光顯微術發現γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM與foxo3共定位在核中(圖7B、7C和7D)。這些結果指示在BRCA1野生型NSCLC A549細胞中，COH29也誘導DNA損害。DNA雙鏈斷裂(DSB)可通過同源性重組(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路徑來修復。為進一步闡明COH29在DSB DNA修復中的作用，我們通過基于GFP的染色體報道體EJ5-GFP確定在細胞中，COH29對NHEJ修復效率具有少許影響(圖8A-8B)。然而，根據蛋白質印跡分析，在BRCA1野生型NSCLC A549細胞的核中，COH29對負責HR修復的關鍵蛋白質Rad51的表達的作用被下調(圖7A)。此外，COH29抑制BRCA1和Rad51灶形成的蛋白質水平，伴有DSB標志物γ-Η2ΑΧ在細胞中積累(圖9A和9B)，從而表明COH29可能夠通過下調BRCA1野生型A549細胞中的HR路徑來延長DNA損害響應(DDR)誘導的DSB。

為評估COH29的基因毒性，用一定劑量范圍的COH29(0-100μΜ)從1至7dpf(受精后天數)處理野生型斑馬魚胚胎，并且與用已知會導致發育缺陷的HU(0-50mM)類似處理的胚胎進行比較。如所預期，截至4dpf，HU導致眼和心臟中的缺陷(圖5A)，并且導致突變胚胎的數目劑量依賴性增加(圖5B)。相比之下，在COH29存在下未觀察到發育缺陷(圖5C)或活力降低(圖5D)。

在本文中，在體外研究與體內研究兩者中均觀察到COH29在BRCA1缺乏性細胞系中比在BRCA1野生型細胞系中更具活性。BRCA1是細胞對DNA損害的應答的一種介體。因此，在本文中進行的對COH29處理的BRCA1缺乏性細胞和BRCA1野生型細胞的差異性基因表達分析將PARP1鑒定為另一受抑制蛋白質。此外，我們尤其發現COH29加強DNA損害劑順鉑的活性。此外，我們尤其發現COH29以p53非依賴性方式使DNA損害檢查點活化，并且核Rad51被下調。

在試圖整合以上觀察結果時，我們提出下方案。在不受任何特定理論束縛下，我們提出在人細胞中，對DNA的損害(諸如由順鉑形成的交聯)通常通過BER路徑來修復。因為RR提供為修復所必需的dNTP，所以所述酶密切涉及于在S期期間發生的BER中。在G1期中，p53誘導性亞單位p53R2提供dNTP來達成BER。我們先前報道由COH29抑制RR會導致體內dNTP消減(6)。

COH29可影響雙鏈DNA斷裂修復，如由我們的顯示HR復合蛋白Rad51受抑制的數據所表明。這由COH29導致細胞內Rad51蛋白水平減弱的觀察結果指示(圖7A)。響應于DNA損害，RAD51從胞質液易位至核以在ssDNA上形成核絲，此是為促進HR路徑所必需的步驟(45,46)。在未處理細胞中，大多數Rad51在胞質液中表達(圖7B，上部圖版)。響應于暴露于COH29，與Rad51顯著降低并行的核中γ-H2AX表達顯著增加表明Rad51可在COH29誘導的DSB中起作用。COH29對Rad51的這個作用類似于文獻對已知會使復制叉停滯的HU記載的作用(47)，其中重要差別在于COH29比HU更有效力20倍(6)，并且不具有可觀基因毒性(圖5A-5D)。

此外，COH29也抑制BRCA1，其是另一重要HR組分。已報道抑制PARP會下調由E2F4和p130介導的BRCA1和RAD51表達(48)。開發用以打斷HR DNA修復機構的抑制劑(51)已變得具有吸引力，因為Rad51表達升高已在眾多類型的癌癥中被觀察到，并且與不良預后和藥物抗性相關聯(52,53)。已報道通過上調Rad51表達水平來增加HR能力可導致癌細胞對PARP抑制劑的抗性(54)。甚至在BRCA1缺陷性細胞中，使53BP1損失也可允許達成部分HR修復，并且介導對PARP抑制劑的獲得性抗性(55)。由COH29誘導的通過下調Rad51的表達水平來使它的功能失活可充當針對癌癥的潛在療法。我們的數據顯示COH29可干擾細胞中的BER、NER和HR修復路徑，從而表明COH29可靶向由遺傳背景或對PARP抑制劑的抗性所致的備用DNA修復。

通過合成致死性或其它手段來增加DNA損害性藥物的效價攜有由于抑制體內DNA修復能力而使這些藥物的誘變潛力增加的風險。在dsB修復路徑的情況下，顯示POLD1的失活(參見上文)導致結腸直腸腺瘤和癌瘤(49)。RAD51的多態性與某些人癌癥類型的發作相關聯(50)。然而，本文數據已顯示不同于HU，COH29處理似乎不在斑馬魚的胚胎發育期間致使可見形態學異常。此處所述的進步可導致進一步改進當前用于治療人癌癥的策略。COH-29對各種人乳腺癌細胞的作用顯示于表3中。

表3.COH29、順鉑和太平洋紫杉醇對乳腺癌細胞系的作用。

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實施方案

本文公開的主題的實施方案包括以下。

實施方案1.一種治療有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括施用有效量的COH29(N-(4-(3，4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3，4-二羥基苯甲酰胺)，其中所述受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

實施方案2.如實施方案1所述的方法，其中所述受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

實施方案3.如實施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受試者中的DNA修復。

實施方案4.如實施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受試者中的堿基切除修復(BER)、核苷酸切除修復(NER)或雙鏈DNA斷裂修復。

實施方案5.如實施方案1所述的方法，其中所述施用增加所述受試者中的γ-H2AX蛋白活性或表達。

實施方案6.如實施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的Rad51蛋白活性或表達。

實施方案7.如實施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的BRCA1蛋白活性或表達。

實施方案8.如實施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的PARP1蛋白活性或表達。

實施方案9.一種治療有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括以組合協同量施用COH29(N-(4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羥基苯甲酰胺)和DNA損害性抗癌劑。

實施方案10.如實施方案9所述的方法，其中所述受試者是BRCA1缺陷性受試者或PARP1抑制劑抗性受試者。

實施方案11.如實施方案10所述的方法，其中所述受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

實施方案12.如實施方案9所述的方法，其中所述DNA損害性抗癌劑是化學治療性DNA損害劑。

實施方案13.如實施方案12所述的方法，其中所述化學治療性DNA損害劑是烷基化劑。

實施方案14.如實施方案13所述的方法，其中所述烷基化劑是氮丙啶、甲基蜜胺、亞硝基脲、氮芥、白消安、環磷酰胺或甲基芐肼。

實施方案15.如實施方案9所述的方法，其中所述化學治療性DNA損害劑是拓撲異構酶I藥劑、拓撲異構酶II藥劑、喜樹堿、伊立替康、拓撲替康、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素、阿霉素、依托泊苷、單鏈斷裂劑、BCNU卡莫司汀、CCNU、DTIC、癌得星、異環磷酰胺、博萊霉素或絲裂霉素C。

實施方案16.如實施方案9所述的方法，其中所述DNA損害性抗癌劑是順鉑、吉西他濱或γ輻照。