一種通過(guò)孕穗期注射zebularine誘致植物染色體變異的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種誘致植物染色體變異的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人工選擇和集約化種植，很多栽培植物的遺傳基礎(chǔ)正逐漸變窄。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜 交和染色體工程技術(shù)，誘致植物染色體變異并轉(zhuǎn)移和利用親緣物種有利基因，是拓寬栽培 植物遺傳多樣性的重要途徑。如何高效誘致染色體變異是作物染色體工程的主要研究?jī)?nèi)容 之一。
[0003] 在小麥(Triticum aestivum L，2n = 6x = 42)染色體工程中，常用的染色體變異誘 變方法包括電離輻射、殺配子染色體、小麥Phlb基因突變體和自發(fā)變異(Jiang JM，F(xiàn)riebe B，Gill BS.Recent advances in alien gene transfer in wheat.Euphytica，1994,73: 199-212) ANA甲基化是維持染色體和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因子(Espada J，Esteller M， DNA me thylation and the functional organization of the nuclear compartment. Seminars in Cell&Developmental Biology?2010?21:238-246)〇Baubec et al. (2009)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑zebularine作為一種新的胞苷類(lèi)似物，能夠降 低擬南芥DNA甲基化水平和抑制幼苗生長(zhǎng)，同時(shí)還具有降低DNA螺旋化水平和激活沉默基因 表達(dá)的效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，zebularine還能導(dǎo)致DNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生損傷反應(yīng)，并能 通過(guò)同源重組機(jī)制進(jìn)行修復(fù)（Liu CH，F(xiàn)inke A，Diaz M，Rozhon W，Poppenberger B，Baubec T,Pecinka A,Repair of DNA damage induced by the cytidine analog zebularine requires ATR and ATM in Arabidopsis.The Plant Cell,2015,27(6)：1788-1800)〇2011 年，Cho和他的同事研究發(fā)現(xiàn)，zebularine具有誘發(fā)植物染色體變異的效應(yīng)。該研究以小麥-大賴草染色體1(臨時(shí)編號(hào)）二體異附加系萌動(dòng)種子為試材，添加不同濃度的zebularine (2.5-10. ΟμΜ)能顯著抑制小麥根的生長(zhǎng)，超過(guò)5μΜ根伸長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，超過(guò)ΙΟμΜ根不再伸 長(zhǎng)，并從處理的根尖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種染色體結(jié)構(gòu)變異，包括無(wú)著絲粒斷片、環(huán)狀染色體和雙 著絲粒染色體和小麥與大賴草染色體間的重組染色體包括插入、缺失和易位等，揭示 zebularine可以誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異（Cho SW，Ishii T，Matsumoto N，Tanaka H，Eltayeb AE,Tsujimoto H,Effects of the cytidine analogue zebularine on wheat mitotic chromosomes.Chromosome Science，2011，14:23-28)。但是上述研究獲得的染色體變異體 為發(fā)生在根尖細(xì)胞中的嵌合體，這些變異能否發(fā)生在莖尖分生組織及其他物種并因此是否 能夠穩(wěn)定傳遞給后代尚沒(méi)有報(bào)道。本專(zhuān)利以八倍體小黑麥荊輝1號(hào)(AABBDD，2n = 8x = 56,公 知公用）（亓增軍，莊麗芳，劉大鈞，陳佩度.將荊州黑麥種質(zhì)導(dǎo)入栽培小麥的研究.南京農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23:1-4)為例，建立了 一種通過(guò)孕穗期注射zebularine高效誘致可穩(wěn)定傳 遞的植物染色體變異體的新方法，為植物染色體工程育種和研究提供了新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種通過(guò)孕穗期注射zebularine誘致植物染色體變異的新 方法。
[0005] 本發(fā)明的目的主要通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006]以小麥-黑麥雙倍體荊輝1號(hào)為材料，材料種植于大田，選擇孕穗期的3~4cm長(zhǎng)的 幼穗，用ImL注射器在穗下第一節(jié)間上方0.5~Icm處注射IOOyL濃度為500μΜ的 zebularine;;注射后的單穗于成熟后按單穗收獲，對(duì)收獲的種子進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，檢測(cè)染 色體變異類(lèi)型與頻率。細(xì)胞學(xué)鑒定采用基因組原位雜交(GISH)和寡核苷酸pScl 19.2-1熒光 原位雜交(FISH)技術(shù)(王艷芝，百薩偃麥草染色體小片段易位的創(chuàng)制、鑒定與基因定位分 析.2013,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文）。
[0007] 有益效果：
[0008] 1:本發(fā)明公開(kāi)了一種誘發(fā)植物染色體變異的新方法，為染色體工程育種和研究提 供了新途徑；
[0009] 2:從誘變后代132粒種子中發(fā)現(xiàn)22個(gè)（16.7%)染色體變異類(lèi)型，包括14個(gè)染色體 數(shù)目變異，8個(gè)染色體結(jié)構(gòu)變異，證明了本方法的有效性。
[0010] 3:誘導(dǎo)獲得的染色體數(shù)目變異可以用于選育基于小黑麥背景的黑麥染色體缺體 系，結(jié)構(gòu)變異體包括端體、缺失、等臂染色體和易位，可以用于荊州黑麥相關(guān)目標(biāo)基因的染 色體或區(qū)段定位并利于向栽培小麥中轉(zhuǎn)移和利用黑麥優(yōu)良基因，為小麥遺傳育種研究提供 了新的遺傳材料。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖I zebularine誘致的八倍體小黑麥荊輝1號(hào)染色體變異體GISH/FISH分析
[0012] a:未經(jīng)處理的小黑麥荊輝1號(hào)對(duì)照，包含14條黑麥染色體和42條小麥染色體；
[0013] b:15MXH214-l為誘變處理后代，包含13條黑麥染色體;缺少了 1條黑麥染色體5R;
[0014] c: 15MXH200-5為誘變處理后代，包含12條黑麥染色體;缺少了兩條黑麥染色體4R; [0015] d:15MXH212-l為誘變處理后代，包含12條黑麥染色體和1條小麥-黑麥易位染色體 T5RS.5RL-W；
[0016] e:誘致產(chǎn)生的8種荊州黑麥染色體結(jié)構(gòu)變異體
[0017] bar = IOym
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0019] 1.荊輝1號(hào)染色體變異的誘變方法
[0020]以小麥-黑麥雙倍體荊輝1號(hào)為材料，材料種植于大田，選擇孕穗期的3~4cm長(zhǎng)的 幼穗，用ImL注射器在穗下第一節(jié)間上方0.5~Icm處注射IOOyL濃度為500μΜ的 zebularine，注射后的單穗于成熟后按單穗收獲，對(duì)收獲的種子進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，檢測(cè)染色 體變異類(lèi)型與頻率。
[0021]溶液配制：25mg zebularine溶于 1562.5yL DMS0,然后加3887.5yL dd H2O,配成 濃度為20mM的母液，處理時(shí)用ddH20稀釋成500μΜ的溶液備用。
[0022] 2誘變后代的細(xì)胞遺傳分析
[0023]染色體制片
[0024]對(duì)誘變處理獲得的種子放置于有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，24°C恒溫箱中培養(yǎng)至根長(zhǎng) 1.5-2cm時(shí)，剪取根尖并置于0°C冰水混合物中預(yù)處理24h，然后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(Vzii: V_=3:l)中固定一周后用45%乙酸解離制片，相差顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，然后將制 片置于-70Γ冰箱凍存3h以上，揭去蓋玻片后放入無(wú)水乙醇中脫水30min以上，取出，晾干， 鏡檢備用。
[0025] 探針標(biāo)記
[0026] 荊州黑麥基因組DNA探針標(biāo)記采用缺刻平移法(50yL體系），具體程序?yàn)閐NTP 5.0μ L, IOXBuffer 5.OyL,DNA polymerase I 3.OyL,DNase I(I ： 1000)1.2yL,Fluorsecein-12-dUTP I · OyUTemplate DNA 2 .OyL(約為4000ng)，最后加 CldH2O補(bǔ)足總體積至50yL。探針 混合液混勻后16°C溫育2h，-20°C保存?zhèn)溆谩９押塑账醦Scll9.2-l標(biāo)記利用TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)進(jìn)行5' 末端修飾獲得（Invitrogen公司，上海）。
[0027]原位雜交
[0028] (1)配制雜交液（1 張片子，16yL體系）：20XSSC 1.5yL，dFA 7.5yL，ssDNA 0.5yL， 50%DS 2.5yL，荊州黑麥基因組DNADNA probe 2.0yL，pScll9.2-10.1yL，封組DNA(輝縣紅） 2. OyL(約為6000ng)，雜交液混勻之后，105 °C加熱13min，之后置于-20 °C 100 %冰酒精中冷 卻IOmin以上，備用。
[0029] (2)片子變性:70%甲酰胺70°C變性30s，依次用70%、95%、100%預(yù)冷無(wú)水乙醇梯 度脫水5min，氣干備用。
[0030] (3)雜交:加上雜交液，37°C過(guò)夜雜交。
[0031] (4)洗片：依次為2/55〇511^11，2/55〇511^11，50%(^厶211^11，2/55〇511^11，2/55〇 5min〇
[0032] (5)DAPI套染和鏡檢：2.5yL DAPI母液（10mgAiL)+500yL DAPI緩沖液，染色3min， 氣干加6.5以]^￥6(^3811丨61(1膠，蓋上24臟/24臟蓋玻片，01^11^)118 1^(60型焚光顯微鏡用450-490nm激發(fā)光波長(zhǎng)觀察。用SPOT CCD(SP0T Cool Color Digital Camera)攝取照片。
[0033] 染色體變異體分析
[0034] 每粒種子至少觀察5個(gè)以上完整的細(xì)胞，當(dāng)所有細(xì)胞均表現(xiàn)一致時(shí)才確定染色體 是否發(fā)生了穩(wěn)定的變異，對(duì)每個(gè)變異體進(jìn)一步根據(jù)荊州黑麥的核型(劉振乾，荊州黑麥染色 體變異體的誘致與鑒定.2012,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文)進(jìn)行染色體身份識(shí)別，研究共 隨機(jī)調(diào)查了 15個(gè)穗子的132粒種子，從中發(fā)現(xiàn)22個(gè)（16.7%)染色體變異體，包括染色體數(shù) 目變異14個(gè)，染色體結(jié)構(gòu)變異8個(gè)(表1)，這些變異體涉及14個(gè)接種穗(93.3%)。本專(zhuān)利表 明，通過(guò)孕穗期接種可以有效誘發(fā)植物染色體變異，為染色體工程育種和研究提供了新方 法。
[0035] 可以知道，上述實(shí)施例僅為了說(shuō)明發(fā)明原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā) 明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)情況下，可以做出各種改進(jìn)和變更，這 些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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[0037] 表2: Zebularine誘致的22個(gè)染色體變異體

[0039]注：表;^染色體未做進(jìn)一步分析，del =deletion，i = isoarm chromosome，t = t e losome，T = translocation。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種誘致小麥-黑麥染色體變異的新方法:其特征在于:包括如下步驟： (1) 以八倍體小黑麥荊輝1號(hào)為材料，選擇孕穗期的單株，幼穗長(zhǎng)3~4cm，采用lmL注射 器在穗下第一節(jié)間上方0.5~lcm處注射lOOyL濃度為500μΜ的zebularine; (2) 注射后的單穗發(fā)育成熟后按單穗收獲，對(duì)收獲的種子進(jìn)行染色體鑒定，檢測(cè)染色體 變異類(lèi)型與頻率。2. 權(quán)利要求1所述的方法在誘致小麥與其他親緣物種及其他作物染色體變異上的應(yīng) 用。3. 權(quán)利要求1、2所述的方法在小麥及其他植物新品種培育上的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑zebularine誘致植物染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的新方法。本方法以八倍體小黑麥荊輝1號(hào)為試材，通過(guò)對(duì)孕穗期植株直接注射zebularine，然后收獲自交種子進(jìn)行染色體鑒定，從中發(fā)現(xiàn)了能夠穩(wěn)定傳遞的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異，為植物染色體工程育種及其相關(guān)理論研究提供了新方法。
【IPC分類(lèi)】A01H1/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105706920
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610076099
【發(fā)明人】莊麗芳, 馬旭輝, 亓增軍, 王艷芝, 王青, 馬潔云, 劉朋, 吳楠
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)