相關申請案的交叉參考

本專利申請要求2010年11月5日提交的美國臨時申請序列號61/410,748以及2011年3月8日提交的61/464,806的優(yōu)先權(quán)，這兩份專利的每一篇的內(nèi)容均全文以引用方式并入本文中。

發(fā)明背景

焦慮是一種不存在立即威脅情況下的持續(xù)性擔憂加劇狀態(tài)，在處于疾病狀態(tài)時會變得嚴重虛弱。焦慮障礙代表了最常見的精神疾病(達28％的終生患病率)，并與重郁癥和藥物濫用病因?qū)W存在關聯(lián)。雖然長期以來據(jù)猜測杏仁核(一個對情感處理具有重要意義的大腦區(qū)域)在焦慮中發(fā)揮著作用，但是控制和調(diào)節(jié)焦慮的神經(jīng)機制尚未得以確定。盡管焦慮障礙的高患病率和嚴重性，但人們對相應的神經(jīng)回路基質(zhì)仍知之甚少，從而阻礙了開發(fā)安全有效的治療措施?？捎玫闹委煷胧┩欢际怯行?，或者就苯二氮類而言，還會上癮并存在嚴重的副作用，包括鎮(zhèn)靜以及可導致認知損害和死亡的呼吸抑制。對哺乳動物大腦中焦慮控制機制的更深入理解對于開發(fā)更有效而副作用更少的治療措施十分必要。尤其引人關注并具有新穎性的是利用抗焦慮作用的天然通路的可能性。

發(fā)明概要

本文提供一種包含在基底外側(cè)杏仁核(BLA)的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白的動物，其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導動物的焦慮或緩解焦慮。

本文提供一種在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白的動物，其中該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導動物的焦慮。在一些實施方案中，該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。在一些實施方案中，動物還包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的第二光反應性視蛋白，其中該第二視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中該第二視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明減輕動物的焦慮。在一些實施方案中，該第二視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該第二視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該第二視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。

本文提供一種在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白的動物，其中該視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明減輕動物的焦慮。在一些實施方案中，該視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。

本文還提供用于將核酸遞送到個體中的BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元的載體，其中該載體包含編碼光反應性視蛋白的核酸并且該核酸可操作地連接到控制視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子。在一些實施方案中，該啟動子為CaMKIIα啟動子。在一些實施方案中，該載體為AAV載體。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明緩解焦慮。在一些實施方案中，通過光誘導去極化的該視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導焦慮。在一些實施方案中，通過光誘導超極化的該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。在一些實施方案中，個體為小鼠或大鼠。在一些實施方案中，個體為人。

本文還提供用于將核酸遞送到個體中的BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元的方法，包括向該個體施用有效量的載體，該載體包含編碼光反應性視蛋白的核酸并且該核酸可操作地連接到控制視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子。在一些實施方案中，該啟動子為CaMKIIα啟動子。在一些實施方案中，該載體為AAV載體。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明緩解焦慮。在一些實施方案中，通過光誘導去極化的該視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白，并且其中該視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導焦慮。在一些實施方案中，通過光誘導超極化的該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。在一些實施方案中，個體為小鼠或大鼠。在一些實施方案中，個體為人。

本文還提供包含BLA、CeL和CeM的冠狀腦組織切片，其中光反應性蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白。在一些實施方案中，通過光誘導去極化的該視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。在一些實施方案中，該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白。在一些實施方案中，通過光誘導超極化的該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。在一些實施方案中，組織為小鼠或大鼠組織。

本文還提供用于篩選可緩解焦慮的化合物的方法，包括(a)將化合物施用給患有通過選擇性照明在BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的視蛋白而誘導的焦慮的動物，其中該動物包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白，其中該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白；以及(b)確定動物的焦慮水平，其中焦慮水平的降低表示化合物可有效治療焦慮。在一些實施方案中，該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。

本文還提供用于緩解個體焦慮的方法，包括：(a)向該個體施用有效量的載體，該載體包含編碼光反應性視蛋白的核酸并且該核酸可操作地連接到控制視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子，其中該視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達，其中該視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白；以及(b)選擇性照明BLA-CeL的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中的視蛋白以緩解焦慮。在一些實施方案中，該啟動子為CaMKIIα啟動子。在一些實施方案中，該載體為AAV載體。在一些實施方案中，該視蛋白為ChR2、VChR1或DChR。在一些實施方案中，該視蛋白為包含SEQ ID NO:8、9、10或11的氨基酸序列的C1V1嵌合蛋白。在一些實施方案中，該視蛋白包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。

本文還提供用于誘導個體焦慮的方法，包括：(a)向該個體施用有效量的載體，該載體包含編碼視蛋白的核酸并且該核酸可操作地連接到控制視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子，其中該視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達，其中該視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白；以及(b)選擇性照明BLA-CeL的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中的視蛋白以誘導焦慮。在一些實施方案中，該啟動子為CaMKIIα啟動子。在一些實施方案中，該載體為AAV載體。在一些實施方案中，該視蛋白為NpHR、BR、AR或GtR3。在一些實施方案中，NpHR包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。

應當理解，本文所述的各種實施方案的性質(zhì)的一種、一些或全部可加以組合形成本發(fā)明的其他實施方案。本發(fā)明的這些和其他方面對本領域的技術人員將變得顯而易見。

附圖簡述

考慮到以下說明和附圖，可更加全面地理解各種示例性實施方案，其中：

圖1顯示了根據(jù)本公開實施方案的用于提供大腦特異性投射的光遺傳學靶向的系統(tǒng)；以及

圖2顯示了根據(jù)本公開實施方案的使用基于焦慮的回路模型的流程圖。

圖3顯示了在CeA誘導的急性可逆抗焦慮作用中BLA終末的投射特異性興奮。a)所有小鼠在行為操縱前被單只地關在高應力環(huán)境中至少1周，然后在所有光開條件下接受20Hz的5-ms光脈沖。ChR2:BLA-CeA組中的小鼠接受CaMKII啟動子控制下BLA神經(jīng)元中ChR2的病毒轉(zhuǎn)導，并植入為BLA胞體屏蔽光線的斜口插管，從而允許選擇性照明CeA中的BLA終末，而對照組則僅接受含熒光團的病毒(EYFP:BLA-CeA組)或用于照明BLA胞體的光纖(ChR2:BLA胞體組)。(b-c)ChR2:BLA-CeA組(n＝8)中的小鼠在高架十字迷宮中在光開期間接受對CeA中BLA終末的選擇性照明，如該ChR2:BLA-CeA代表性路徑(b)中所見，其在光開期間相對于光滅期間以及EYFP:BLA-CeA(n＝9)和ChR2:BLA胞體(n＝7)對照(c)誘導了開臂時間增加5倍，進入開臂的可能性也顯著增加(參見插圖)。(d-f)ChR2:BLA-CeA組中的小鼠也顯示出在光開期間相對于光滅期間以及EYFP:BLA-CeA和ChR2:BLA胞體對照(e)在曠場試驗箱中心所花的時間增加，如該代表性圖線(d)中所見，但在光開期間未表現(xiàn)出活動度的顯著變化(f)。g)冠狀切片的共聚焦圖像，顯示了ChR2:BLA-CeA組中小鼠的CeA和BLA區(qū)域，其中125μm×125μm方形表示用于定量的區(qū)域。h)放大的區(qū)域按組排成行，按大腦區(qū)域排成列。(i-k)所有組所有DAPI識別的細胞中EYFP陽性和c-fos陽性神經(jīng)元的百分比(按區(qū)域進行劃分)。每個組和區(qū)域的計數(shù)以圖例示出。在各組之中，所研究的區(qū)域沒有一個表現(xiàn)出EYFP陽性細胞比例的可檢測差異。i)EYFP陽性或c-fos陽性的BLA神經(jīng)元的比例。ChR2:BLA胞體組相對于ChR2:BLA-CeA(p<0.01)或EYFP:BLA-CeA(p<0.05)組具有顯著更高的c-fos陽性BLA神經(jīng)元(F_2,9＝10.12,p<0.01)比例。j)ChR2:BLA-CeA組相對于EYFP:BLA-CeA組(p<0.05)但非ChR2:BLA胞體組具有顯著更高的c-fos陽性細胞比例。k)CeM神經(jīng)元的匯總數(shù)據(jù)表明各組之中無可檢測的差異。

圖4顯示了CeA中BLA終末的投射特異性興奮使CeL神經(jīng)元活化并引起CeM神經(jīng)元的前饋抑制。a)代表性光反應性BLA、CeL和CeM細胞的實時雙光子圖像，所有圖像均通過相同的切片成像，疊加在明場圖像上。(b-f)相關代表性電流鉗圖線(V_m＝約-70mV)的記錄和照明部位的圖示。b)得自表達ChR2的BLA錐體神經(jīng)元的代表性圖線，BLA中所有表達ChR2的BLA神經(jīng)元對每個5ms脈沖(n＝4)均出現(xiàn)尖峰(spike)。c)得自BLA投射神經(jīng)元終末區(qū)域(terminal field)中的CeL神經(jīng)元的代表性圖線，顯示了對光刺激的亞閾值和超閾值興奮性反應(n＝16)。左邊的插圖是對于20Hz的40個脈沖序列中每個脈沖出現(xiàn)尖峰的平均概率的細胞群匯總，虛線表示SEM。右邊的插圖是頻率直方圖，顯示了以20Hz遞送的5ms光脈沖的各個細胞尖峰保真度，y軸是每5％bin的細胞數(shù)。d)響應電流階躍(約60pA；以黑色表示)的CeM神經(jīng)元尖峰的六次掃描以及CeL中BLA終末的20Hz照明時的尖峰抑制。插圖為尖峰頻率，在CeL神經(jīng)元的光刺激期間顯著降低(n＝4)。(e-f)在對CeM廣泛照明時，膜片鉗試驗總結(jié)表明EPSC的延遲顯著短于IPSC的延遲，而在EPSC與IPSC的振幅方面則無顯著差異(n＝11；*p＝0.04，參見插圖)。相同的CeM神經(jīng)元(n＝7)表現(xiàn)出在接受CeM照明時的凈興奮(e)或在對CeL選擇性照明時的凈抑制(f)。

圖5顯示了光誘導的抗焦慮作用可歸因于單獨的BLA-CeL突觸活化。(a-b)對18個染料充灌的BLA神經(jīng)元的雙光子多層光切(z-stack)圖像進行了重構(gòu)，它們向CeL和CeM的投射匯總在(a)中，而它們的圖像則顯示在(b)中，其中紅色表示向CeL的投射，藍色表示向CeM的投射，紫色表示向CeL和CeM兩者的投射。c)當在各光斑位置進行全細胞記錄時記錄部位和光斑位置的示意圖，其中光斑以100um的步長以可視化軸突上方以及非軸突上方的方向遠離細胞體移動。d)針對與胞體相隔各種距離遞送的20Hz序列的尖峰保真度的標準化電流鉗匯總，顯示了與細胞體相隔約300um處，軸突終末照明導致了低(<5％)尖峰保真度。e)根據(jù)與細胞體的距離，照明時在細胞體處所見的去極化電流的標準化電壓鉗匯總。(f-i)在每個切片標本內(nèi)的各位置上方通過約150um直徑的光斑照明時的代表性電流鉗圖線(n＝7)。細胞體的照明引起了高保真度尖峰(f)。CeL中BLA終末的照明在突觸后CeL神經(jīng)元中引起了強烈的亞閾值和超閾值興奮性反應(g)，但是未在BLA神經(jīng)元本身中引起可靠的逆向尖峰(h)，以及顯示了在軸突之外遞送的光，以作為光散射對照用于比較(i)。(k-j)將一組單獨的ChR2:BLA-CeL小鼠(n＝8)各自在高架十字迷宮和曠場試驗中測試兩次，一個階段以CeA內(nèi)輸注鹽水開始(紅色)，而另一個階段則以順序反平衡的谷氨酸受體拮抗劑NBQX和AP5開始(紫色)。k)CeA中的谷氨酸受體阻滯使以下兩個指標的光誘導增加值減小而不影響光滅期間的表現(xiàn)：在高架十字迷宮上開臂中所花的時間以及進入開臂的概率(插圖)。j)局部谷氨酸受體拮抗使曠場試驗中心時間的光誘導增加值減小，插圖顯示了合并的匯總。

圖6顯示了CeA中BLA終末的選擇性抑制誘導了急性且可逆的焦慮加劇。a)所有小鼠被按組關在低應力環(huán)境中，并在光開期間接受雙側(cè)恒定591nm光。eNpHR3.0:BLA-CeA組中的小鼠(n＝9)在CaMKII啟動子控制下接受了BLA神經(jīng)元中的eNpHR3.0雙側(cè)病毒轉(zhuǎn)導并植入了使光遠離BLA胞體的斜口插管以允許對CeA中的BLA終末進行選擇性照明，而對照組則接受僅用熒光團的雙側(cè)病毒轉(zhuǎn)導(EYFP:BLA-CeA雙側(cè)組；n＝8)或直接照明BLA胞體的光纖(eNpHR3.0:BLA胞體組；n＝6)。b)用eNpHR3.0處理的小鼠的BLA和CeA的共聚焦圖像。(c-e)在用于下文的焦慮測定中的相同動物中，相對于EYFP組，eNpHR3.0組的CeM(e)中顯著更高比例的神經(jīng)元表達了c-fos(*p<0.05)。f)eNpHR3.0:BLA-CeA組中小鼠的代表性路徑，顯示了在CeA的BLA終末選擇性照明期間在高架十字迷宮上的開臂探索減少。g)eNpHR3.0小鼠相對于對照在光刺激期間表現(xiàn)出在開臂中所花的時間和進入開臂的概率降低。h)在曠場試驗中在匯總的光滅和光開期間eNpHR3.0:BLA-CeA組小鼠的代表性路徑。i)對于eNpHR3.0:BLA-CeA組，與對照相比，在光開但非光滅期間，在曠場試驗箱中的中心時間顯著縮短，插圖顯示了匯總的數(shù)據(jù)。(j-l)表達eNpHR3.0的BLA終末的選擇性照明在存在卡巴膽堿的情況下足以減少自發(fā)性囊泡釋放。其中BLA神經(jīng)元表達eNpHR 3.0的急性切片標本中CeL神經(jīng)元(j)的代表性圖線，顯示了當對離開BLA胞體約300μm的BLA終末照明時，在突觸后CeL神經(jīng)元處所見的sEPSC的振幅(k)和頻率(l)降低。經(jīng)各種長度的照明(5-60秒)后在CeL神經(jīng)元(n＝5)處記錄的sEPSC振幅(k)和頻率(l)的累積分布頻率，插圖顯示了在照明之前、期間和之后相匹配的持續(xù)時期中的相應平均值+SEM(**p<0.01；***p<0.001)。(m-p)對表達eNpHR 3.0的BLA終末的選擇性照明抑制了通過BLA中的電刺激而誘發(fā)的囊泡釋放。m)指示刺激電極、記錄電極以及約150μm直徑光斑的位置的示意圖。n)在對表達eNpHR3.0的BLA終末進行選擇性照明之前(滅₁)、期間(開)和之后(滅₂)CeL神經(jīng)元中EPSC的代表性圖線。得自包含表達eNpHR 3.0的BLA神經(jīng)元(n＝7)的切片標本和非轉(zhuǎn)導對照(n＝5)的標準化EPSC振幅匯總數(shù)據(jù)(o)和各細胞數(shù)據(jù)(p)表明選擇性照明CeL中的BLA終末顯著(*p＝0.006)降低了突觸后CeL神經(jīng)元中電誘發(fā)的EPSC的振幅。

圖7是顯示了用473nm光處理的小鼠在組織學上確認的布置的示意圖。圖中指明了作為半球反平衡的病毒注射針(圓形)和斜口插管的頂端(x)的單側(cè)布置。顏色指明了處理組，參見圖例。這里顯示了含有BLA和CeA的冠狀斷面，數(shù)字表示距離前囪的前后坐標(Aravanis et al.,J Neural Eng,4:S143-156,2007)。

圖8顯示了斜口插管和照明分布的設計。a)在充注熒光素水溶液的比色皿上方發(fā)射473nm光的裸光纖的光錐。光錐的角度為約12度。b)相同光纖的光錐并且光線被包鞘在斜口插管中。斜口插管阻擋光線遞送到其中一側(cè)，而不會可檢測地改變垂直光穿透。c)通過CeA上方的斜口插管由光纖遞送光線的示意圖。d)指出了當在光纖頂端所見的光功率密度為7mW(約99mW/mm²)時在小鼠腦組織中相隔光纖頂端各種距離處的光功率密度估計值的圖表。插圖為示出了構(gòu)造的示意圖。光纖處于垂直取向并通過小鼠腦組織塊正對功率表的中心。e)顯示了通過標準功率表測得的光功率(mW)以及在頂端處、在CeL處(腦組織中約0.5-0.7mm深度)和在CeM處(腦組織中約1.1mm深度)所見的光功率密度估計值(mW/mm²)的表格。

圖9顯示了斜口插管防止了光遞送到BLA和在用于行為測定的光功率下的BLA尖峰。a)示出了通過光纖將光遞送到CeA以及BLA中的記錄電極(紅色)的構(gòu)造的示意圖。b)在使用和不使用斜口插管的情況下將各種光功率遞送到CeA時BLA中記錄的散點圖匯總(n＝4個部位)。對于各部位，在使用和不使用斜口插管的情況下進行反復交替記錄。x軸顯示了光纖頂端處的光功率密度(黑色)和CeL處的估計光功率密度(灰色)。藍色豎直或陰影區(qū)域表示用于行為測定的光功率密度范圍(在光纖頂端約7mW；約99mW/mm²)。在此光功率密度范圍內(nèi)未觀察到BLA神經(jīng)元的可靠反應。c)在CeA中的相同記錄部位采用7mW(在光纖頂端約99mW/mm²；在CeL約5.9mW/mm²)的20Hz 5ms脈沖光刺激時BLA記錄的代表性圖線。d)響應單個光脈沖的細胞群尖峰波形揭露出實質(zhì)性的光限制，即使在12mV的高功率下仍是如此(光纖頂端處約170mW/mm²；CeL處約10.1mW/mm²)。

圖10展示了病毒轉(zhuǎn)導不包括閏細胞簇。a)在后續(xù)共聚焦圖像中顯示的閏細胞示意圖。(b-d)用于行為操縱的接受BLA中EYFP b)、eNpHR 3.0c)和ChR2d)注射的小鼠的閏細胞的代表性圖像。病毒表達未在閏細胞簇中觀察到。(e-f)對于用于行為測定的所有6個組，在閏細胞簇中存在非常低的(<2％)YFP表達水平。在各組之中，c-fos表達不存在統(tǒng)計顯著性差異。

圖11顯示了單側(cè)CeA內(nèi)施用谷氨酸拮抗劑未改變活動度。在曠場試驗前施用NBQX和AP5相對于鹽水輸注未降低活動度(通過平均速度度量)(F_1,77＝2.34,p＝0.1239)。

圖12展示了浴液灌流谷氨酸拮抗劑阻斷了光誘發(fā)的突觸傳導。通過BLA內(nèi)輸注將AAV5-CamKII-ChR2-EYFP輸入野生型小鼠的BLA后4-6周，我們研究了谷氨酸受體拮抗劑NBQX和AP5阻斷谷氨酸能傳導的能力。a)在對表達ChR2的BLA終末進行20Hz的473nm光照序列時代表性CeL神經(jīng)元的代表性電流鉗(上圖)和電壓鉗(下圖)圖線。b)浴液灌流NBQX和AP5后相同細胞的反應顯示出被取消的尖峰和EPSC。c)浴液灌流NBQX和AP5前后所見的去極化電流的細胞群匯總(n＝5)，針對用藥前的反應標準化。

圖13是顯示了用594nm光處理的小鼠在組織學上確認的布置的示意圖。圖中示出了病毒注射針(圓形)和斜口插管頂端(x)的雙側(cè)放置。顏色指明了處理組，參見圖例。顯示了含有BLA和CeA的冠狀斷面；數(shù)字表示距離前囪的AP坐標(Aravanis et el.,J Neural Eng,4:S143-156,2007)。

圖14顯示了用于eNpHR 3.0終末抑制實驗的光刺激參數(shù)未阻斷細胞體處的尖峰。(a-c)在持續(xù)尖峰序列的持續(xù)時間的電流階躍下，在相應代表性圖線旁邊的光斑位置和記錄部位的示意圖，其與中間時期中各位置的黃色光照明配對(由黃色水平條表示)。a)在直接照明時表達eNpHR 3.0的BLA神經(jīng)元的代表性電流鉗圖線顯示出在細胞體照明期間的強效尖峰抑制。b)在距離細胞體約300μm處提供約125μm直徑的光斑而不照明軸突時表達eNpHR 3.0的BLA神經(jīng)元的代表性電流鉗圖線。c)在距離細胞體約300μm處提供約125μm直徑的光斑并照明軸突時表達eNpHR 3.0的BLA神經(jīng)元的代表性電流鉗圖線。d)雖然直接照明細胞體誘導了與所有其他條件存在顯著性差異的尖峰完全抑制(F_3,9＝81.50，p<0.0001；n根據(jù)條件為3或以上)，但是在離開表達eNpHR 3.0的BLA神經(jīng)元胞體約300μm的遠側(cè)照明條件和無光條件之間無顯著性差異(F_2,7＝0.79,p＝0.49)，從而表明遠側(cè)照明未顯著抑制細胞體處的尖峰。e)示出了相對于記錄部位的光斑位置的示意圖，右邊則顯示了細胞群匯總。細胞群匯總顯示了軸突側(cè)支之上和之外根據(jù)光斑與細胞體的距離從細胞體記錄的標準化超極化電流(n＝5)。

圖15展示了BLA終末的選擇性照明誘導了囊泡釋放到CeL神經(jīng)元上，而未可靠地引起逆行動作電位。示意圖和說明對應于下面的圖線，而圖線顏色則表示細胞類型。光照模式對于兩個圖線系列均相同。左列是每個細胞40個脈沖光序列的三次重疊掃描的CeL圖線(n＝8)。這里，兩個鎖時EPSC表示從突觸前ChR2表達性BLA終末的囊泡釋放，并且對于所有突觸后CeL細胞，對100％的光脈沖均存在興奮性反應。右列是每個細胞的三次重疊40個脈沖掃描的BLA圖線(n＝9)，其中在軸突終末遞送的平均數(shù)量的光脈沖導致了超閾值逆行動作電位(5.4％±2％，平均值±SEM)。

圖16是曲線圖，展示了在eNpHR 3.0和對照組中光刺激未改變活動度。在各組之間以及在各光照期間之間不存在可檢測的活動度差異(F_1,20＝0.023,p＝0.3892；F_1,100＝3.08,p＝0.086)。

具體實施方式

本公開涉及對如本文所述的神經(jīng)系統(tǒng)障礙的控制，諸如與焦慮和焦慮癥狀相關的障礙。雖然本公開不一定限于這些背景，但是通過對使用這些和其他背景的實例的討論將認識到本發(fā)明的各個方面。

本公開的各個實施方案涉及關于以可測量的指標對神經(jīng)回路進行暫時控制的光遺傳學系統(tǒng)或方法。例如，各種指標或癥狀可與表現(xiàn)出各種焦慮癥狀的神經(jīng)障礙相關。該光遺傳學系統(tǒng)靶向患者體內(nèi)的神經(jīng)回路以對其選擇性控制。該光遺傳學系統(tǒng)涉及對患者與神經(jīng)障礙相關的指標或癥狀進行監(jiān)控。這樣，光遺傳學系統(tǒng)可提供關于神經(jīng)回路、其功能和/或神經(jīng)障礙的詳細信息。

根據(jù)本文所討論的實施方案，特定的實施方案涉及研究和探索障礙。其他實施方案涉及鑒定和/或研究表型和內(nèi)表型。另有其他實施方案涉及鑒定治療靶標。

本公開的多個方面涉及使用人工誘導的焦慮狀態(tài)研究原本健康的動物中的焦慮。這尤其可用于監(jiān)控知之甚少并難以在活動物中準確建模的癥狀和方面。例如，由于沒有表現(xiàn)出焦慮狀態(tài)的可用動物而可能難以測試和/或研究焦慮狀態(tài)。此外，某些實施方案考慮到可逆的焦慮狀態(tài)，這尤其可用于建立測試的基線/對照點和/或用于測試治療對表現(xiàn)出焦慮狀態(tài)時和未表現(xiàn)出焦慮狀態(tài)時的相同動物的影響。某些實施方案的可逆焦慮狀態(tài)還允許重置在對相同動物測試不同治療的影響之間的基線。

本公開的某些方面涉及關于控制活動物中的焦慮和/或焦慮狀態(tài)的方法。在某些更具體的實施方案中，癥狀的監(jiān)控還包括評估刺激在緩和焦慮癥狀方面的功效。還存在多種其他方法和應用，其中一些在本文進行了更詳細地描述。

可用于本發(fā)明的光反應性視蛋白包括通過光誘導神經(jīng)元中超極化的視蛋白以及通過光誘導神經(jīng)元中去極化的視蛋白。視蛋白的實例在下表1和2中示出。

表1顯示了鑒定出的在可見光譜內(nèi)抑制細胞活性的視蛋白：

表2顯示了鑒定出的在可見光譜內(nèi)興奮和調(diào)節(jié)的視蛋白：

表2(續(xù))：

如本文所用，光反應性視蛋白(諸如NpHR、BR、AR、GtR3、Mac、ChR2、VChR1、DChR和ChETA)包括天然存在的蛋白和功能變體、片段、包含片段或全長蛋白的融合蛋白。例如，信號肽可以缺失。變體可具有與天然存在的蛋白質(zhì)序列以至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％任一百分比相同的氨基酸序列。功能變體可具有與天然存在的蛋白質(zhì)相同或相似的超極化功能或去極化功能。

在一些實施方案中，NpHR為eNpHR3.0或eNpHR3.1(參見www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.html)。在一些實施方案中，光反應性視蛋白為C1V1嵌合蛋白或C1V1-E162(SEQ ID NO:10)、C1V1-E122(SEQ ID NO:9)或C1V1-E122/E162(SEQ ID NO:11)突變嵌合蛋白(參見Yizhar et al,Nature,2011,477(7363):171-78和www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.html)。在一些實施方案中，光反應性視蛋白為SFO(SEQ ID NO:6)或SSFO(SEQ ID NO:7)(參見Yizhar et al,Nature,2011,477(7363):171-78；Berndt et al.,Nat.Neurosci.,12(2):229-34和www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.html)。

在一些實施方案中，光活化的蛋白為包含與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列的NpHR視蛋白。在一些實施方案中，NpHR視蛋白還包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號和/或膜運輸信號。例如，NpHR視蛋白包含與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號。在一些實施方案中，將與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列通過連接基連接到ER輸出信號。在一些實施方案中，ER輸出信號包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任何氨基酸。在另一個實施方案中，ER輸出信號包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任何氨基酸。在一些實施方案中，ER輸出信號包含氨基酸序列FCYENEV。在一些實施方案中，NpHR視蛋白包含與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。在其他實施方案中，NpHR視蛋白從N端到C端包含與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。在其他實施方案中，NpHR視蛋白從N端到C端包含與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列、膜運輸信號和ER輸出信號。在一些實施方案中，膜運輸信號衍生自人內(nèi)向整流鉀通道K_ir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，膜運輸信號包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。在一些實施方案中，將膜運輸信號通過連接基連接到與SEQ ID NO:1所示的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，將膜運輸信號通過連接基連接到ER輸出信號。連接基的長度可以為5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸中的任一者。連接基還可包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，光活化的視蛋白還包含N端信號肽。在一些實施方案中，光活化的視蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些實施方案中，光活化的蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一些實施方案中，光活化的視蛋白為衍生自團藻(Volvox carteri)的VChR1和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)的ChR1的嵌合蛋白。在一些實施方案中，嵌合蛋白包含VChR1的氨基酸序列，其具有至少第一和第二被ChR1的相應第一和第二跨膜螺旋替代的跨膜螺旋。在其他實施方案中，嵌合蛋白包含VChR1的氨基酸序列，其具有至少第一和第二被ChR1的相應第一和第二跨膜螺旋替代的跨膜螺旋；以及還包含被ChR1的相應部分替代的位于第二和第三跨膜螺旋之間的胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在一些實施方案中，位于嵌合光活化蛋白的第二和第三跨膜螺旋之間的整個胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域可被ChR1的相應胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域替代。在一些實施方案中，光活化的嵌合蛋白包含與SEQ ID NO:8所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，而不含信號肽序列。在一些實施方案中，光活化的嵌合蛋白包含與SEQ ID NO:8所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。C1V1嵌合光活化視蛋白可在嵌合多肽VChR1部分的視黃醛結(jié)合袋中的關鍵位置具有特定的氨基酸取代。在一些實施方案中，C1V1蛋白在SEQ ID NO:8的氨基酸殘基E122處具有突變。在一些實施方案中，C1V1蛋白在SEQ ID NO:8的氨基酸殘基E162處具有突變。在其他實施方案中，C1V1蛋白在SEQ ID NO:8的氨基酸殘基E162和E122處均具有突變。在一些實施方案中，本發(fā)明所公開的突變C1V1嵌合蛋白的每一種可具有特定的性質(zhì)和特征，以用于響應光線而使動物細胞膜去極化。

如本文所用，載體包含編碼本文所述的光反應性視蛋白的核酸，并且該核酸可操作地連接到控制視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子?？墒褂每捎糜趯⒑怂徇f送到谷氨酸能錐體神經(jīng)元的任何載體。載體包括病毒載體，諸如AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體和慢病毒載體。AAV載體的實例為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16。可使用可控制視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的CaMKIIα啟動子和任何其他啟動子。

“個體”是哺乳動物，諸如人。哺乳動物還包括但不限于家畜、用于體育活動的動物、寵物(諸如貓、狗、馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠?！皠游铩笔欠侨瞬溉閯游铩?/p>

如本文所用，“處理”或“治療”或“緩解”是獲得有益或所需結(jié)果(包括并優(yōu)選地為臨床結(jié)果)的方法。對于本發(fā)明而言，有益或所需臨床結(jié)果包括但不限于以下一者或多者：表現(xiàn)出疾病(諸如焦慮)一種或多種體征可觀察的和/或可測量的減輕、減輕疾病所致的癥狀、提高患病者的生活質(zhì)量、降低治療疾病所需的其他藥劑的劑量和/或延遲疾病進展。

如本文所用，藥物、化合物或藥物組合物的“有效劑量”或“有效量”是足以實現(xiàn)有益或所需結(jié)果的量。對于治療性用途，有益或所需結(jié)果包括臨床結(jié)果，諸如減輕疾病所致的一種或多種癥狀、提高罹患疾患的患者的生活質(zhì)量、降低治療疾病所需的其他藥劑的劑量、諸如通過靶向而增強另一種藥劑的效果和/或延遲疾病進展。如在臨床背景中可以理解的是，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量可以或可以不與另一種藥物、化合物、藥物組合物或另一種治療聯(lián)用而加以實現(xiàn)。因此，“有效劑量”可在施用一種或多種治療劑或治療措施的背景下進行考慮，并且如果聯(lián)合一種或多種其他藥劑或治療措施時可實現(xiàn)所需的結(jié)果，則可以考慮以有效量給予單一藥劑。

以上概述并非意圖描述本發(fā)明的各個所示實施方案或每種實施方式。

詳細說明和示例性實驗實施方案

本發(fā)明據(jù)信可用于控制焦慮狀態(tài)和/或焦慮癥狀。本發(fā)明的具體應用涉及光遺傳學系統(tǒng)或方法，其又涉及對與焦慮狀態(tài)和/或其癥狀相關的神經(jīng)回路的暫時、空間和/或細胞類型控制。由于本文所公開的示例性實施方案的許多方面涉及并廣泛依賴于本領域之前的發(fā)展，因此以下討論對此類之前的發(fā)展進行了概述，以提供對可從中引出實施方式詳情和修改(包括實施例中所見的那些)的基礎和潛在教導內(nèi)容的切實理解。以下討論均在此背景下提供，而參考文獻中的教導內(nèi)容以引用方式并入本文中。雖然本發(fā)明不一定限于此類應用，但是通過對使用此背景的各種實例的討論可認識到本發(fā)明的各個方面。

焦慮是指一種不存在立即威脅情況下的持續(xù)性擔憂加劇狀態(tài)，在處于疾病狀態(tài)時會變得嚴重虛弱。本公開的實施方案涉及使用具有雙光子顯微鏡的細胞類型特異性光遺傳學工具、電生理學和焦慮測定法中的一種或多種研究和開發(fā)涉及焦慮相關行為潛在的神經(jīng)回路的治療措施。

本公開的多個方面涉及在研究與精神疾病相關的神經(jīng)回路功能中光遺傳學靶向大腦而非細胞類型的特異性投射。

根據(jù)本公開的特定實施方案，將杏仁核中央核(CeA)中的基底外側(cè)杏仁核(BLA)終末的暫時性精確光遺傳學刺激用于產(chǎn)生可逆的抗焦慮作用。光遺傳學刺激可通過以下方式實施：用諸如ChR2的光反應性視蛋白對BLA進行病毒轉(zhuǎn)導，然后在下游CeA中進行限制性照明。

根據(jù)本公開的其他實施方案，將杏仁核中央核(CeA)中的基底外側(cè)杏仁核(BLA)終末的光遺傳學抑制用于增強焦慮相關行為。光遺傳學刺激可通過以下方式實施：用諸如eNpHR3.0的光反應性視蛋白對BLA進行病毒轉(zhuǎn)導，然后在下游CeA中進行限制性照明。

本公開的實施方案涉及神經(jīng)細胞群的特異性靶向，因為在對BLA胞體的直接光遺傳學控制下未觀察到基于焦慮的作用。例如，靶向作為回路元件的特異性BLA-CeA投射已通過實驗證實足以實現(xiàn)哺乳動物大腦中的內(nèi)源性焦慮控制。

根據(jù)本公開的實施方案，靶向作為回路元件的特異性BLA-CeA投射基于下文將更詳細討論的許多因素。杏仁核由具有復雜互聯(lián)性的在功能和形態(tài)學上具有異質(zhì)性的亞核組成。杏仁核的主要劃分為基底外側(cè)杏仁核復合體(BLA)，其涵蓋外側(cè)(LA)、基底外側(cè)(BL)和基底內(nèi)側(cè)(BM)杏仁核(約90％的BLA神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元)。相比之下，由中央外側(cè)(CeL)和中央內(nèi)側(cè)(CeM)核組成的杏仁核中央核(CeA)主要(大約95％)由GABA能中型多棘神經(jīng)元構(gòu)成。BLA包鞘在GABA能閏細胞(ITC)的致密簇中，這些細胞在功能上與CeA的局域中間神經(jīng)元和中型多棘神經(jīng)元均不同。杏仁核的主要輸出核為CeM，其在通過化學或電方式興奮時，據(jù)信可通過投射到腦干而介導與恐懼和焦慮相關的自主和行為反應。雖然CeM不直接通過會聚環(huán)境和認知信息(LA)的主要杏仁核部位進行控制，但是LA和BLA神經(jīng)元可使GABA能CeL神經(jīng)元興奮，這可向CeM“輸出”神經(jīng)元上提供前饋抑制并減少杏仁核輸出。BLA-CeL-CeM是一種研究還不夠透徹的通路，已表明其不涉及恐懼消退而是涉及條件性抑制。已表明，可能由于音調(diào)和驚嚇(tone and shock)的明確不成對而導致的恐懼表達受到抑制與BLA-CeL突觸增強相關。

BLA細胞具有遍及大腦的各種各樣的投射，包括向終紋床核(BNST)、伏核、海馬體和皮質(zhì)的投射。本公開的多個方面涉及用于選擇性控制CeL中的BLA終末而對其他BLA投射幾乎沒有直接影響/控制的方法?？赏ㄟ^將視蛋白基因表達限制到BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元以及通過將光遞送限制到CeA，而促進BLA-CeL突觸的優(yōu)先靶向。

例如，BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元的控制可通過攜帶光活化的光遺傳學控制基因的腺相關病毒(AAV5)載體在CaMKIIα啟動子的控制下實現(xiàn)。在BLA內(nèi)，CaMKIIα只在谷氨酸能錐體神經(jīng)元而不在局域中間神經(jīng)元或閏細胞中表達。

圖1顯示了根據(jù)本公開實施方案的用于提供大腦特異性投射的光遺傳學靶向的系統(tǒng)。例如，斜口引導插管可用于引導光線，例如，防止光遞送到BLA并允許實現(xiàn)CeA的選擇性照明。這種光線優(yōu)先遞送到CeA投射可使用立體定位指引方法連同CeL上方的植入而實現(xiàn)。所得的光分布的幾何和功能性質(zhì)可在體外和體內(nèi)進行定量，例如使用體內(nèi)電生理記錄，以確定用于BLA終末而非BLA細胞體的選擇性控制的光功率參數(shù)。諸如實施例中所述的那些實驗結(jié)果支持以下結(jié)論：此類選擇性興奮或抑制可導致顯著、立即且可逆的基于焦慮的作用。

本公開的實施方案涉及適用于本文確定的各種解剖、功能、結(jié)構(gòu)和回路靶標的以上目標的實現(xiàn)。例如，可研究回路靶標以開發(fā)用于焦慮精神疾病的治療措施。這些治療措施可包括以下非限制性實例：藥理學、電、磁、手術和光遺傳學治療或其他治療手段。

圖2顯示了根據(jù)本公開實施方案的使用基于焦慮的回路模型的流程圖。在202形成光遺傳學遞送裝置，諸如病毒遞送裝置。該遞送裝置可被構(gòu)造成將光學反應性視蛋白引向靶細胞，并可包括特定細胞類型的靶向啟動子。然后在204可將遞送裝置在立體定位下(或其他方式下)注射進BLA。然后在206可將光遞送裝置通過手術植入。該光遞送裝置可被構(gòu)造成提供靶向照明(例如，使用定向光學元件)。然后在208對靶區(qū)域照明。靶區(qū)域可以為例如BLA-CeA。然后在210可監(jiān)控和/或評估其效果。這還可以與治療或藥物篩選相結(jié)合而使用。

本公開的多個實施方案涉及使用確定的模型篩選新的焦慮治療措施。例如，可以使用本文所述的方法人工誘導或抑制焦慮，然后應用藥理、電、磁、手術或光遺傳學治療措施并進行評估。在本公開的其他實施方案中，該模型可用于開發(fā)所確定的回路的體外模仿或模擬，然后可用于篩選裝置、試劑、工具、技術、方法和途徑以及用于研究和探索焦慮和相關障礙。此研究可涉及但不必定限于鑒定表型、內(nèi)表型和治療靶標。

本公開的實施方案可涉及作為內(nèi)源性神經(jīng)基質(zhì)對BLA-CeL通路建模，以用于雙向調(diào)節(jié)焦慮的非條件表達。某些實施方案涉及其他下游回路，諸如CeA向BNST的投射，它們在焦慮或焦慮相關行為的表達中的作用。例如，據(jù)信，BNST中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)網(wǎng)絡可在調(diào)節(jié)焦慮相關行為中起著重要作用，因為CeL是BNST的主要CRH來源。其他神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)可調(diào)節(jié)或門控對分布式神經(jīng)回路的作用，包括血清素、多巴胺、乙酰膽堿、甘氨酸、GABA和CRH。還有其他實施方案涉及對會聚到此通路以及從此通路分開的神經(jīng)回路的控制，因為據(jù)信BLA-CeL突觸的平行或下游回路有助于焦慮表型的調(diào)節(jié)或表達。此外，在杏仁核的上游，該微回路良好定位，以被來自對處理恐懼和焦慮具有重要意義的區(qū)域的自上而下的皮質(zhì)控制所利用，包括提供對BLA和CeL的強大神經(jīng)支配的前邊緣、下邊緣和島葉皮質(zhì)。

基于BLA解剖學的實驗結(jié)果表明，投射到CeL和CeM神經(jīng)元的BLA神經(jīng)元群大部分不重疊。在自然狀態(tài)下，投射CeL的BLA神經(jīng)元可以微回路體內(nèi)平衡機制使投射CeM的BLA神經(jīng)元興奮，然后當存在偏離回路平衡的突觸變化以允許未受抑制的CeM活化時可用于研究潛在的焦慮障礙。

本文所述的實施方案和特定應用(包括實施例)可結(jié)合上述方面、實施方案和實施方式中的一個或多個以及結(jié)合圖中所示和下文所述的那些內(nèi)容而加以實施。以下實施例可能會參考文獻，其全文以引用方式并入本文。有關光反應性分子和/或視蛋白的詳細信息，包括方法學、裝置和物質(zhì)，還可以參考以下背景性出版物：Zhang等人的名稱為“System for Optical Stimulation of Target Cells”的美國專利公布No.2010/0190229；Zhang等人的名稱也為“System for Optical Stimulation of Target Cells”的美國專利公開No.2010/0145418；Boyden等人的名稱為“System for Optical Stimulation of Target Cells”的美國專利公布No.2007/0261127；以及名稱為“Light Sensitive Ion Passing Molecules”的PCT WO 2011/116238。這些專利申請構(gòu)成了本專利文獻的一部分并全部以引用方式并入本文。根據(jù)這些出版物，許多視蛋白可在體內(nèi)和體外用于哺乳動物細胞，以提供對靶細胞的光學刺激和控制。例如，當將ChR2引入電興奮細胞諸如神經(jīng)元時，ChR2紫紅質(zhì)通道蛋白(channelrhodopsin)的光活化可導致細胞興奮和/或放電。在將NpHR引入電興奮細胞諸如神經(jīng)元的情況下，NpHR視蛋白的光活化可導致細胞放電受到抑制。上文引用的專利申請的公開內(nèi)容的這些和其他方面可用于實施本公開的多個方面。

雖然本公開可存在各種修改和替代形式，但是其細節(jié)已通過舉例的方式在附圖中示出并將更加詳細地描述。應當理解，本發(fā)明不限于所述特定實施方案和/或應用的公開內(nèi)容。相反，本發(fā)明將涵蓋落在本公開精神和范圍內(nèi)的所有修改形式、等效形式和替代形式。

實施例

簡介

焦慮是一種不存在立即威脅情況下的持續(xù)性擔憂加劇狀態(tài)，在處于疾病狀態(tài)時會變得嚴重虛弱¹。焦慮障礙代表了最常見的精神疾病(達28％的終生患病率)²，并與重郁癥和藥物濫用病因?qū)W存在關聯(lián)^3-5。雖然長期以來據(jù)猜測杏仁核(一個對情感處理具有重要意義的大腦區(qū)域^9-17)在焦慮中發(fā)揮著作用^18-23，但是控制和調(diào)節(jié)焦慮的神經(jīng)機制尚未得以確定。這里，我們在自由活動的小鼠中將具有雙光子顯微鏡的細胞類型特異性光遺傳學工具、電生理學和焦慮測定法相結(jié)合，以鑒定焦慮相關行為潛在的神經(jīng)回路。通過有效利用光遺傳學^24-26不僅能控制細胞類型還能控制細胞間特定連接的獨特能力，我們觀察到對杏仁核中央核(CeA)中基底外側(cè)杏仁核(BLA)終末的暫時性精確光遺傳學刺激(通過用ChR2進行BLA的病毒轉(zhuǎn)導，然后在下游CeA中進行限制性照明而實現(xiàn))發(fā)揮了顯著、即時且可逆的抗焦慮作用。相反，使用eNpHR3.0的相同限定投射的選擇性光遺傳學抑制²⁵強效、快速且可逆地增強了焦慮相關行為。重要的是，這些作用在對BLA胞體本身的直接光遺傳學控制下未觀察到。總之，這些結(jié)果暗示作為回路元件的特異性BLA-CeA投射對于哺乳動物大腦中的內(nèi)源性焦慮控制既是必要的也是足夠的，并且表明光遺傳學靶向特異性投射而非細胞類型在研究與精神疾病相關的神經(jīng)回路功能中的重要性。

盡管焦慮障礙的高患病率和嚴重性¹，但人們對相應的神經(jīng)回路基質(zhì)仍知之甚少，從而阻礙了開發(fā)安全有效的治療措施。可用的治療措施往往不都是有效，或者就苯二氮類而言，還會上癮并存在嚴重的副作用，包括鎮(zhèn)靜以及可導致認知損害和死亡的呼吸抑制^27,28。對哺乳動物大腦中焦慮控制機制的更深入理解^29,30對于開發(fā)更有效而副作用更少的治療措施十分必要。尤其引人關注并具有新穎性的是利用抗焦慮作用的天然通路的可能性。

杏仁核在處理中性刺激與積極結(jié)果或負面結(jié)果之間的關聯(lián)中具有重要作用，并且還與處理非條件情感狀態(tài)有關。雖然已在恐懼條件化的背景下對杏仁核微回路進行了功能上的剖析，但是杏仁核還參與許多其他功能和情感狀態(tài)，包括非條件焦慮。杏仁核由具有復雜互聯(lián)性的在功能和形態(tài)學上具有異質(zhì)性的亞核組成。杏仁核的主要劃分為基底外側(cè)杏仁核復合體(BLA)，其涵蓋外側(cè)(LA)、基底外側(cè)(BL)和基底內(nèi)側(cè)(BM)杏仁核(約90％的BLA神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元)^33,34。相比之下，由中央外側(cè)(CeL)和中央內(nèi)側(cè)(CeM)核組成的杏仁核中央核(CeA)主要(大約95％)由GABA能中型多棘神經(jīng)元構(gòu)成³⁵。BLA包鞘在GABA能閏細胞(ITC)的致密簇中，這些細胞在功能上與CeA的局域中間神經(jīng)元和中型多棘神經(jīng)元均不同^36,37。杏仁核的主要輸出核為CeM，^32,35,38-40其在通過化學或電方式興奮時，通過投射到腦干而介導與恐懼和焦慮相關的自主和行為反應^6,12,^32,35。雖然CeM不直接通過會聚環(huán)境和認知信息(LA)的主要杏仁核部位進行控制^12,38,41，但是LA和BLA神經(jīng)元可使GABA能CeL神經(jīng)元興奮⁴²，這可向CeM^40,46“輸出”神經(jīng)元上提供前饋抑制并減少杏仁核輸出。BLA-CeL-CeM是一種研究還不夠透徹的通路，已表明其不涉及恐懼消退而是涉及條件性抑制，因音調(diào)和驚嚇的明確不成對所致的恐懼表達抑制與BLA-CeL突觸的增強相關⁴⁷。雖然將恐懼表征為一種通過外因觸發(fā)的位相狀態(tài)，而焦慮則是一種可能在不存在外部觸發(fā)因素下發(fā)生的持續(xù)性狀態(tài)，因此我們想知道調(diào)節(jié)恐懼的條件性抑制的回路是否也會涉及調(diào)節(jié)焦慮的非條件抑制。

材料和方法

受試者：將實驗程序開始時為4-6周齡的雄性C57BL/6小鼠維持在12小時的光照/黑暗交替循環(huán)中，并隨意提供食物和水。圖3、4和5中所示的動物(ChR2終末、EYFP終末和ChR2細胞體組中的小鼠)均單只地關在典型的高容量小鼠籠舍中，以增加基線焦慮水平。每只小鼠屬于單個處理組。圖6中所示的動物(雙側(cè)EYFP和eNpHR3.0組)按組關在特殊的高容量籠舍中以降低基線焦慮水平。動物飼養(yǎng)以及動物實驗操縱的所有方面均按照National Institute of Health的指導原則進行，并得到了Stanford Institutional Animal Care and Use Committee成員的批準。

光強測量：使用得自急性處死的小鼠的腦組織塊進行了光透射測量。然后將組織置于功率表(ThorLabs,Newton,NJ)的光電檢測器上方，以測量穿透組織的激光的光功率。將300μm直徑的光纖的頂端耦合到473nm藍色激光器(OEM Laser Systems,East Lansing,MI)。為了表征斜面相對側(cè)的光透射，將功率表的光電檢測器平行于斜口插管布置。為了使光錐可視化，我們使用了置于比色皿中的約5mg/ml的熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(FD150s；Sigma,Saint Louis,MO)，使具有或不具有斜口插管屏蔽的光纖正對熒光素上方?？紤]到由于光錐形輸出所致的強度的分率降低以及因組織中的散射所致的光損失，計算了特定深度的功率密度(Aravanis et al.,J Neural Eng,4:S143-156,2007)(Gradinaru et al.,J Neurosci,27:14231-14238,2007)。多模光纖發(fā)散角θ_div的半角(決定輸出光的角展度)為

${\mathrm{\&theta;}}_{div}={\sin }^{-1}\left(\frac{{\mathrm{NA}}_{fib}}{n_{tis}}\right)$

其中n_tis為灰質(zhì)的折射率(1.36,Vo-Dinh T 2003,Biomedical Photonics Handbook(Boca Raton,FL:CRC Press))以及NA_fib(0.37)為光纖的數(shù)值孔徑。隨著離開光纖的距離(z)因光的錐形擴散所致的強度的分率變化使用三角函數(shù)計算

其中

并且r為光纖的半徑(100μm)。

將因散射所致的損失后的光分率透射使用經(jīng)驗測量和Kubelka-Munk模型^1,2作為雙曲線函數(shù)建模，而光纖頂端的功率密度以及因錐形擴散和光散射所致的分率變化的聯(lián)合乘積則得出光纖下方特定深度的功率密度值。

病毒構(gòu)建和包裝：由University of North Carolina的病毒載體中心(viral vector core)將重組AAV載體通過AAV₅外殼蛋白進行血清分型，并進行包裝。病毒滴度對于AAV-CaMKIIα-hChR2(H134R)-EYFP、AAV-CaMKIIα-EYFP和AAV-CaMKIIα-eNpHR 3.0-EYFP分別為2×10e¹²個顆粒/mL、3×10e¹²個顆粒/mL、4×10e¹²個顆粒/mL。通過使用MluI和EcoRI限制性位點將CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP克隆進AAV主鏈而構(gòu)建pAAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP質(zhì)粒。相似地，通過使用MluI和EcoRI限制性位點將CaMKIIα-EYFP克隆進AAV主鏈而構(gòu)建pAAV-CaMKIIα-EYFP質(zhì)粒。圖譜可在www.optogenetics.org在線獲得，其以引用方式并入本文。

立體定位注射和光纖放置：所有手術均在無菌條件下通過立體定位指引進行。將小鼠用1.5-3.0％的異氟烷麻醉。所有坐標均相對于前囪，單位為mm³。在所有實驗中，無論體內(nèi)還是體外，均只將病毒遞送到BLA，而CeA中的任何病毒表達均從所有實驗中排除。將引導插管傾斜以形成45-55度角，以限制向CeA的照明。將斜口引導插管的短側(cè)以前內(nèi)側(cè)方向設置，而斜口插管的長側(cè)則屏蔽光錐的后外側(cè)，從而面向病毒注射針的相反方向。為了優(yōu)先靶向BLA-CeL突觸，我們將視蛋白基因表達限制到BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元以及將光遞送限制到CeA。BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元的控制通過使用攜帶光活化的光遺傳學控制基因的腺相關病毒(AAV5)載體在CaMKIIα啟動子的控制下實現(xiàn)。在BLA內(nèi)，CaMKIIα只在谷氨酸能錐體神經(jīng)元而不在局域中間神經(jīng)元中表達⁴。ChR2終末和EYFP終末組中的小鼠接受光纖的單側(cè)斜口插管植入(半球的反平衡)，而eNpHR 3.0或相應的EYFP組中的小鼠則在CeA的上方接受斜口插管的雙側(cè)植入(-1.06mm前后位(AP)、±2.25mm中間外側(cè)(ML)和-4.4mm背腹側(cè)(DV)；PlasticsOne,Roanoke,VA)³。ChR2細胞體組中的小鼠以(-1.6mm AP；±3.1mm ML；-4.5mm DV)在BLA上方接受Doric跳線長期植入式光纖(NA＝0.22；Doric lenses,Quebec,Canada)的單側(cè)植入³。對于所有小鼠，使用面向后側(cè)的斜口33或35號金屬針將0.5μl純化的AAV₅經(jīng)單側(cè)或雙側(cè)注射到BLA(±3.1mm AP,1.6mm ML,-4.9mm DV)中³，以將病毒輸注限制到BLA。將10μl Hamilton微量注射器(nanofil；WPI,Sarasota,FL)用于通過微量注射器泵(UMP3；WPI,Sarasota,FL)及其控制器(Micro4；WPI,Sarasota,FL)遞送濃縮的AAV溶液。然后，將0.5μl病毒溶液在各部位以0.1μl每分鐘的速率注射。注射完成后，將針提起0.1mm，再保持10分鐘，然后慢慢抽出。將一層粘合水泥(C&B metabond；Parkell,Edgewood,NY)接著為顱骨整形水泥(Dental cement；Stoelting,Wood Dale,IL)用于將光纖引導系統(tǒng)固定到顱骨。20分鐘后，將切口使用組織粘合劑(Vetbond；Fisher,Pittsburgh,PA)閉合。將動物放在加熱墊上，直至從麻醉中恢復。將引錠帽(dummy cap)(大鼠：C312G，小鼠：C313G)插入以保持引導插管的專利性。在4-6周后進行行為和電生理學實驗，以允許病毒表達。

體內(nèi)記錄：如前人所述(Gradinaru et al.,J Neurosci,27:14231-14238,2007)，同時進行之前(4-6周前)用AAV-CaMKIIa-ChR2-eYFP病毒構(gòu)建體在BLA中轉(zhuǎn)導的成年雄性小鼠的中央杏仁核(CeA)光刺激和基底外側(cè)杏仁核(BLA)電記錄。動物在開顱手術前用異氟烷深麻醉，并具有陰性捏指(toe pinch)反射。通過立體定位將小鼠對準后，手術摘除約3mm²的杏仁核背側(cè)的顱骨。調(diào)整坐標以允許顱骨和大腦發(fā)育生長，當小鼠在4至6周齡接受手術時以及當小鼠8-10周齡進行實驗時(-1.5mm AP、±2.75mm ML居中)³，將1Mohm的0.005英寸細胞外鎢電極(A-M systems)在立體定位下在BLA上方插入經(jīng)開顱手術的腦區(qū)域(單位為mm：-1.65AP,±3.35ML,-4.9DV)³。單獨地，將數(shù)值孔徑為0.2、芯徑為200μm的纖維光纜(Thor Labs)在立體定位下插入CeA背側(cè)的大腦(-1.1AP,±2.25ML,-4.2DV)³。采集光誘發(fā)反應后，將電壓斜升用于在長度為2秒的刺激期間(20Hz、5毫秒脈沖寬度)改變光強。采集光誘發(fā)的信號后，記錄光纖的精確位置，從大腦中移除光纖，插入定制斜口插管，再次插入相同的位置，并重復相同的方案。在大部分試驗中，然后從大腦中取出光纖/插管，移除插管，然后將裸光纖再次插入以確保發(fā)出誘發(fā)信號的神經(jīng)元群的保真度。將記錄的信號在300Hz與20kHz之間帶通濾波，交流放大1000倍或10000倍(A-M Systems 1800)，并數(shù)字化(Molecular Devices Digidata 1322A)然后使用Clampex軟件(Molecular Devices)記錄。將Clampex軟件用于記錄場信號以及控制耦合到光極的473nm(OEM Laser Systems)固態(tài)激光二極管光源。將光纖頂端的光功率在<1mW(約14mW/mm²)與28mW(約396mW/mm²)之間調(diào)節(jié)，并使用標準光功率表(ThorLabs)測量。在將異氟烷麻醉降低到1％的恒定水平后，在BLA背側(cè)約1mm開始電生理學記錄。將光極以大約0.1mm的階梯變化在腹側(cè)降低，直至定位到光誘發(fā)的信號。

行為測定：用于行為測定的所用動物均接受BLA神經(jīng)元病毒轉(zhuǎn)導和植入，使得能夠?qū)崿F(xiàn)單側(cè)(對于ChR2組和對照)或雙側(cè)(對于eNpHR3.0組和對照)光遞送。對于行為測定，將多模光纖(數(shù)值孔徑0.37，芯徑300μm，BFL37-300；ThorLabs,Newton,NJ)精確切割成用于將光限制到CeA的最佳長度，其短于斜口插管的長邊緣，但長于斜口插管的最短邊緣。對于光學刺激，將光纖通過FC/PC適配器連接到473nm或594nm激光二極管(OEM Laser Systems,East Lansing,MI)。使用Master-8脈沖刺激器(A.M.P.I.,Jerusalem,Israel)對激光輸出進行控制，以針對473nm光實驗遞送頻率為20Hz、脈沖寬度為5毫秒的光序列，而針對594nm光實驗遞送恒定光。所有包括在內(nèi)的動物均具有位于BLA中的病毒注射中心，但有時存在向相鄰區(qū)域的或沿著針道的泄漏。當CeA中存在任何可檢測的病毒表達時，將相應的動物排除在外。對光的所有統(tǒng)計顯著性效果進行了討論，而未進行討論的比較則未表現(xiàn)出可檢測的差異。

高架十字迷宮由塑料制成，并包括從中央平臺(5×5×5cm)以十字形式呈90度延伸的兩個淺灰色開臂(30×5cm)、兩個黑色閉臂(30×5×30cm)。迷宮置于地板以上30cm高。將小鼠單獨地放在中心。在開始試驗階段前，讓小鼠從處理中恢復1-5分鐘。將視頻跟蹤軟件(BiObserve,Fort Lee,NJ)用于跟蹤小鼠位置、速度以及頭、身體和尾巴移動。顯示的所有測量值均相對于小鼠身體。光刺激方案按組指定。將ChR2:BLA-CeA小鼠和相應的對照組(EYFP:BLA-CeA和ChR2:BLA胞體)單只地關在高應力環(huán)境中至少1周，然后進行焦慮測定：以7-8mW(光纖頂端處為約106mW/mm²，CeL處為約6.3mW/mm²以及CeM處為約2.4mW/mm²)的473nm光脈沖序列(5毫秒脈沖，頻率20Hz)對CeA中的BLA終末進行單側(cè)照明。對于ChR2細胞體組，將BLA神經(jīng)元以較低的光功率直接照明，因為7-8mW的照明誘導了癲癇發(fā)作，因此我們以3-5mW(約57mW/mm²)的473nm光脈沖序列(5毫秒脈沖，頻率20Hz)對BLA神經(jīng)元進行單側(cè)照明。對于eNpHR 3.0和相應的EYFP組，所有小鼠被按組關在籠舍中，并接受雙側(cè)病毒注射以及以4-6mW(光纖頂端處為約71mW/mm²，CeL處為約4.7mW/mm²以及CeM處為約1.9mW/mm²)的594nm光對CeA中BLA終末進行的雙側(cè)照明，其中在5分鐘的光開時期中保持恒定照明。將15分鐘的試驗階段分成3個為期5分鐘的時期，第一個時期無光刺激(光滅)，第二個時期以如上指定的條件遞送光線(光開)，第三個時期無光刺激(光滅)。

將曠場實驗箱(50×50cm)和曠場分成中心場(中心，23×23cm)和外場(周邊)。將各只小鼠置于曠場周邊，通過攝像機記錄動物的路徑。通過使用相同的視頻跟蹤軟件Viewer²(BiObserve,Fort Lee,NJ)對總行進距離進行分析。在高架十字迷宮試驗后，立即進行曠場評估。曠場試驗包括18分鐘的階段，其中存在六個為期3分鐘的時期。各時期在無光刺激與有光刺激周期之間交替，開始時為光滅時期。對于所有分析和圖表，其中只顯示“滅”和“開”條件，將3個“滅”時期匯總在一起，將3個“開”時期也匯總在一起。

對于谷氨酸受體拮抗劑操縱，谷氨酸拮抗劑溶液包含溶于鹽水(0.9％NaCl)中的22.0mM NBQX和38.0mM D-APV(Tocris,Ellisville,MO)。在焦慮測定前5-15min，將0.3μl谷氨酸拮抗劑溶液通過被插入用于通過光纖遞送光線的相同引導插管中的內(nèi)部輸注針輸注到CeA，該輸注針連接到10μl Hamilton注射器(nanofil；WPI,Sarasota,FL)。通過注射器泵(Harvard Apparatus,MA)調(diào)節(jié)流速(0.1μl/min)。病毒注射、引導插管和長期植入光纖的放置如圖7和10中所示通過組織學加以確認。

雙光子光遺傳學回路作圖和體外電生理記錄：將小鼠在4周齡時注射AAV5-CaMKIIα-ChR2-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周時間后處死以制作急性切片。制作包含BLA和CeA的冠狀切片，以研究BLA與CeA之間的功能聯(lián)系。在恒定的aCSF灌注下進行雙光子成像和電生理記錄，其中aCSF包含(單位mM)：126NaCl、26NaHCO₃、2.5KCl、1.25NaH₂PO₄、1MgCl₂、2CaCl₂和10葡萄糖。所有記錄均在32℃下進行。將貼片電極(4-6MOhm)充灌(單位mM)：10HEPES、4Mg-ATP、0.5MgCl₂、0.4Na₃-GTP、10NaCl、140葡萄糖酸鉀和80Alexa-Fluor 594酰肼(Molecular Probes,Eugene OR)。在BLA、CeL和CeM神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄，讓細胞充脹大約30分鐘，然后在改進的雙光子顯微鏡(Prairie Microscopes,Madison WI)上成像，其中雙光子成像、全細胞記錄和光遺傳學刺激可同時進行。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。除非另外指明，否則均使用約7mW/mm²的473nm LED(Thorlabs,Newton NJ)引發(fā)藍色光脈沖。將Coherent Ti-Saphire(摻鈦藍寶石)激光器用于對ChR2-YFP(940nm)和Alexa-Fluor 594(800nm)兩者成像。還將具有濾光片630/69和542/27的FF560二向色鏡(Semrock,Rochester NY)用于分離兩種分子的發(fā)射。所有圖像均使用40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)采集。為了分離光纖從BLA向CeL的投射以及研究CeM中的反應，用未照明的BLA如上所述制作切片。通過從正對在CeL上方的物鏡的照明，在CeM中進行了全細胞記錄。為了進一步確保終末從BLA到CeL的活化是選擇性的，將照明圍繞CeL的中心限制到大約125μm的直徑。這里，使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)引發(fā)藍色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的470/3濾光片(6.5mW/mm²)。對于功能作圖，我們首先從表達ChR2的BLA神經(jīng)元進行記錄，同時采集電生理記錄并將細胞用Alexa-Fluor 594酰肼染料充灌以允許雙光子成像。沿著充灌BLA神經(jīng)元的軸突在多個位置采集了雙光子多層光切圖像。我們?nèi)缓箜樦駽eL核投射的BLA神經(jīng)元的軸突，從BLA終末區(qū)域中的CeL進行記錄。接著，我們在順著CeL神經(jīng)元軸突向CeM之前，同時地從CeL神經(jīng)元進行記錄、用染料充灌細胞并執(zhí)行雙光子實時成像。我們隨后在CeM神經(jīng)元中重復了這一程序，但將光移回到CeL中的終末區(qū)域，以通過體內(nèi)執(zhí)行時相同的刺激參數(shù)模擬BLA-CeL突觸的優(yōu)先照明。在-70mV和0mV下進行了電壓鉗記錄，以分別分離EPSC和IPSC。通過浴液灌流谷氨酸受體拮抗劑(n＝5)NBQX(22μM)和AP5(38μM)，EPSC經(jīng)確認為EPSC；通過浴液灌流荷包牡丹堿(10μM；n＝2)，IPSC經(jīng)確認為IPSC，這些物質(zhì)將分別取消EPSC和IPSC。我們還在約-70mV下細胞靜息時進行了電流鉗記錄。

對于光遺傳學驅(qū)動的BLA軸突終末中的逆行刺激的表征，將動物在4周齡時注射AAV5-CaMKIIα-ChR2-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周后處死用于制作急性切片。切片的制作與上文相同。向aCSF中添加0.1mM木防己苦毒素、10μM CNQX和25μM AP5(Sigma,St.Louis,MO)。在BLA神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄，并在雙光子成像前讓神經(jīng)元充灌大約30分鐘。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。所有圖像均使用40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)采集。使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)引發(fā)藍色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的470/30濾光片(6.5mW/mm²)。沿著充灌BLA神經(jīng)元的軸突在多個位置采集了雙光子多層光切圖像。只將朝向CeL核直徑超過約300μm的可看到其軸突的神經(jīng)元包括在實驗中，并將向著所有方向都具有突起的神經(jīng)元也排除在外。通過相對于約125μm直徑的藍色光斑移動切片，進行了軸突之上/之外的刺激。為了對切片的正確表達進行校準，在CeL細胞上進行了全細胞膜片鉗試驗，并將約125μm直徑的藍色脈沖光斑用于確保從BLA終末向CeL神經(jīng)元上的突出釋放可靠地進行。

為了解剖向CeM的直接和間接投射，將動物在4周齡時注射AAV₅-CaMKIIα-ChR2-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周后處死用于制作急性切片。切片的制作與上文相同。通過40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)遞送光線。在CeM核中進行全細胞膜片鉗試驗前，記下CeL核的位置以便通過限制到此區(qū)域的光斑再次回到該位置。在CeM神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)引發(fā)藍色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的470/30濾光片(6.5mW/mm²)。在CeM記錄期間，對CeA中的BLA終末廣泛照明(約425-450μm直徑)，并采用2秒的20Hz、5毫秒光序列。在70mV和0mV下進行了電壓鉗記錄，以分別分離EPSC和IPSC。也進行了電流鉗記錄。然后，使用約125μm直徑的限制光斑將照明移動到CeL。我們在-70mV和0mV再次進行了電壓鉗記錄，并使用2秒的20Hz、5毫秒光序列。對于電流鉗中的CeM神經(jīng)元尖峰抑制實驗，我們采用了誘導尖峰所需的最小電流階躍(約60pA)并同時通過2秒的20Hz、5毫秒光序列對CeL中的ChR2表達性BLA終末進行優(yōu)先照明(每個細胞6次掃描的平均值)。對于在CeM居中的BLA終末區(qū)域的廣泛照明與BLA-CeL終末的選擇性照明之間的比較實驗，在相同的CeM細胞中反復交替地執(zhí)行了這些條件(n＝7)。

為了確認終末抑制未改變體細胞尖峰，將動物在4周齡時注射AAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周后處死用于制作急性切片。切片的制作與上文相同。在BLA神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄，并讓神經(jīng)元充灌大約30分鐘。通過40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)遞送光線。在BLA神經(jīng)元上進行了全細胞膜片鉗記錄。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)引發(fā)黃色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的589/24濾光片(6.5mW/mm²)。成斑之后，將未限制的光斑(直徑約425-450微米)置于BLA胞體上方，并施加1秒脈沖。如果記錄的電流低于600pA的超極化電流并且軸突向CeL核的行進距離未超過約300μm，則將相應的細胞排除。然后將光斑直徑限制到約125μm。通過1秒的光脈沖，進行了軸突之上和之外的電壓鉗記錄。對于電流鉗記錄，通過膜片微電極向細胞體施加250pA的電流生成動作電位。

為了證實eNpHR3.0表達性BLA終末的選擇性照明降低自發(fā)囊泡釋放的概率，將動物在4周齡時注射AAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周后處死用于制作急性切片。切片的制作與上文相同。在中央外側(cè)神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄。通過40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)遞送光線。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)引發(fā)黃色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的589/24濾光片(6.5mW/mm²)。將光斑直徑限制到約125μm。將卡巴膽堿以20μM的濃度加到浴液中。在CeL神經(jīng)元中的sEPSC活動增強后，施加5秒至30秒范圍內(nèi)的光脈沖。

為了證實eNpHR3.0表達性BLA終末的選擇性照明可降低電刺激誘發(fā)的囊泡釋放的概率，將動物在4周齡時注射AAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP，并在允許病毒表達的4-6周后處死用于制作急性切片。切片的制作與上文相同。將雙極同心刺激電極(FHC,Bowdoin ME)置于BLA中。在CeL神經(jīng)元中進行了全細胞膜片鉗記錄。通過40X/.8NA LUMPlanFL/IR物鏡(Olympus,Center Valley PA)遞送光線。微電極的串聯(lián)電阻通常為10–20MOhm。使用XCite鹵素光源(EXPO,Mississauga,Ontario)在中央外側(cè)細胞上方引發(fā)琥珀色光脈沖，該光源具有耦合到快門(Uniblitz,Rochester NY)的589/24濾光片(6.5mW/mm²)。將光斑直徑限制到約125μm。將電脈沖遞送40秒，在10秒時開始遞送光線，在中間30秒時關閉光線。

對于解剖跟蹤實驗，當觀察到所跟蹤的軸突被切斷時將相應的神經(jīng)元排除，解剖測定中包含的所有BLA神經(jīng)元(圖5a-i)顯示出電流階躍時BLA錐體神經(jīng)元的典型尖峰模式¹⁸。

切片免疫組織化學：在終止體內(nèi)光刺激后100-110min，將麻醉后的小鼠經(jīng)心臟灌注冰冷的4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液(pH 7.4)。將腦在4％的PFA中固定過夜，然后在30％的蔗糖的PBS溶液中平衡。在冷凍切片機上切割40μm厚的冠狀斷面，保存在4℃的冷凍保護劑中直至進行處理用于免疫組織化學分析。將漂片在PBS中洗滌，然后在0.3％Tx100和3％正常驢血清(NDS)中孵育30min。在4℃下在3％NDS/PBS(兔抗c-fos 1:500,Calbiochem,La Jolla,CA；小鼠抗CaMKII 1:500,Abcam,Cambridge,MA)中進行一抗孵育。然后洗滌切片，并在室溫下用偶聯(lián)到Cy3或Cy5(Jackson Laboratories,West Grove,PA)的二抗(1:1000)孵育3小時。在用DAPI(1:50,000)孵育20min后，洗滌切片并通過PVD-DABCO安裝到顯微鏡載片上。

共聚焦顯微術及分析：使用20X/0.70NA或40X/1.25NA油浸物鏡在Leica TCS SP5掃描激光顯微鏡上采集了共聚焦熒光圖像。使用等同的設置采集了通過多個切片的涵蓋10μm深度的多層光切圖像。Volocity圖像分析軟件(Improvision/PerkinElmer,Waltham,MA)計算每個視野的c-fos陽性細胞數(shù)，方式是使c-fos免疫反應性的閾值高于背景水平并使用DAPI染色顯現(xiàn)核。所有圖像和分析均在對實驗條件設盲的情況下進行。

統(tǒng)計：對于行為實驗和體外電生理學數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)自舉(bootstrapped)t檢驗(在適當?shù)那闆r下配對或非配對)對兩兩比較進行了檢驗⁵，而涉及兩組以上的假設則使用線性對比進行檢驗(分別使用R語言的“boot”和“l(fā)me4”包⁶)；將后者與作為遺傳或藥理學操縱和光處理(開或滅)的固定效應制定為線性混合效應模型(“雙向重復測量方差分析”)系數(shù)之間的比對。所有假設檢驗均先驗指定。將受試者作為隨機效應建模。對于c-fos定量比較，我們使用了單因素方差分析然后是Tukey多重比較檢驗。

數(shù)據(jù)圖清楚地顯示了觀測平均值和觀測方差之間的關系(也就是說，它們?yōu)楫惙讲畹模粎⒁娎鐖D3e和圖5j)。我們發(fā)現(xiàn)標準平方根變換能對此很好地糾正。另外，eNpHR3.0高架十字迷宮(EPM)數(shù)據(jù)需要通過對時間的線性擬合而消除趨勢，以解釋隨時間變化探索行為的降低。按照雙向線性混合效應模型(也稱為雙向重復測量方差分析)的標準，我們將第ij個細胞中的第k個觀測值(y_ijk)(的平方根修正值)建模為

$\sqrt{y_{ijk}}=\mathrm{\&mu;}+c_i+t_j+{(c:t)}_{ij}+b_j+e_{ijk}---\left(1\right)$

其中

μ為所有細胞的總平均值(其中觀測值集合中的第ij個“細胞”對應于第i種條件和第j種處理)

c_i是所有處理(例如遺傳操縱)中由于第i種動物條件所致的固定效應

t_j是所有條件(例如光開或光滅)中由于第j種處理所致的固定效應

(c:t)_ij是由于第ij個細胞中第i種條件和第j種處理的相互作用所致的固定效應

b_j是對應于在所有處理中所用的動物的隨機效應，以及

e_ijk是第ijk個觀測值中獨立同分布(i.i.d.)隨機正態(tài)干擾，具有平均值0和方差σ²并且對于所有j與b_j無關

將固定效應集中到雙向方差分析(ANOVA)設計矩陣中、在稀疏矩陣中虛擬編碼并讓我們可以矩陣形式將模型表示為

$\tilde{y}=X\mathrm{\&beta;}+Zb+\mathrm{\&epsiv;}---\left(2\right)$

其中和分別是隨機變量和e的觀測值，并且我們的模型假定

其中N(μ,Σ)表示具有平均向量μ和方差-協(xié)方差矩陣Σ的多元高斯分布，并且⊥表示兩個變量為自變量。為了估計系數(shù)向量以及方差參數(shù)σ和稀疏(塊對角)相對方差-協(xié)方差矩陣我們使用由Douglas Bates和Martin Maechler以R語言編寫的lme4包，其使用多項式迭代加權(quán)最小二乘法首先發(fā)現(xiàn)了將隨機效應“放在球體內(nèi)”的坐標的線性變化，然后發(fā)現(xiàn)了β、σ和Σ的最大似然估計，從而利用隨機效應矩陣的稀疏性加速計算。有關更多信息，參見http://www.r-project.org/的lme4庫中的軟件包所附的文檔。

為了解決最大似然估計，公式2中的設計矩陣X必須具有滿列秩。熟知的是，對于具有截距的完全因子設計矩陣(如公式1中)并非如此，并因此必須將線性組合(“對比”)用于限定X的列以便可以估計固定效應系數(shù)。由于我們的設計均衡(或接近均衡)，我們在與光滅條件相比較的光開相關系數(shù)、與對照條件相比較的終末刺激等等之間使用了正交(或接近正交)Helmert對比，如正文中所報告。此類對比使得我們能夠在重復測量設計內(nèi)在彼此之間比較合并的數(shù)據(jù)(例如，得自多個連續(xù)光開條件與光滅條件的數(shù)據(jù))，從而得到改善的參數(shù)估計和檢驗效能，同時解釋動物內(nèi)的相關性。

結(jié)果

BLA細胞具有遍及大腦的各種各樣的投射，包括向終紋床核(BNST)、伏核、海馬體和皮質(zhì)的投射^38,43。為了測試BLA-CeL突觸是否可能為焦慮的相關原因，因此有必要開發(fā)一種選擇性控制CeL中的BLA終末而不直接影響其他BLA投射的方法。為了優(yōu)先靶向BLA-CeL突觸，我們將視蛋白基因表達限制到BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元以及將光遞送限制到CeA。BLA谷氨酸能投射神經(jīng)元的控制通過攜帶光活化的光遺傳學控制基因的腺相關病毒(AAV5)載體在CaMKIIα啟動子的控制下實現(xiàn)；在BLA內(nèi)，CaMKIIα僅在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中而不在局域中間神經(jīng)元或閏細胞中表達⁴⁸。為了將光優(yōu)先遞送到CeA投射，將病毒在立體定位指引下單側(cè)遞送進BLA(圖7和圖8)，同時連同在CeL上方植入斜口引導插管以防止將光遞送到BLA并允許對CeA進行選擇性照明。通過體內(nèi)電生理記錄，將所得的光分布的幾何和功能性質(zhì)在體外和體內(nèi)進行定量，以確定用于BLA終末而非BLA細胞體的選擇性控制的光功率參數(shù)(圖9)。

為了檢驗BLA-CeA通路可能執(zhí)行抗焦慮作用的內(nèi)源性機制這一假設，我們在兩項不同的并得到充分驗證的焦慮測定中在投射特異性光遺傳學控制下探索了自由活動的小鼠：高架十字迷宮和曠場試驗(圖3a-f)。當暴露于開放或暴露空間時，小鼠表現(xiàn)出焦慮相關行為，因此在高架十字迷宮的暴露臂或曠場試驗箱的中心所花的時間增加表明焦慮減輕^49,50。為了測試相關行為的誘導和逆轉(zhuǎn)，我們首先將小鼠暴露于高架十字迷宮三個為期5分鐘的時期，其中只在第二個時期中遞送光線。

為了確定我們觀察到的抗焦慮作用是否是CeA中的BLA終末而不是一般性BLA細胞的活化特異性的，我們將接受投射特異性控制(在ChR2:BLA-CeA組中；圖3a)的小鼠與接受對照病毒轉(zhuǎn)導并給予相同照明模式的陰性對照組(EYFP:BLA-CeA)以及在BLA中用AAV-CaMKIIα-ChR2-EYFP病毒轉(zhuǎn)導并直接在BLA上方植入光纖的陽性對照組(ChR2:BLA胞體)進行了比較。對于該組(ChR2:BLA胞體)，光刺激未引起在ChR2:BLA-CeA組中觀察到的抗焦慮作用(圖3b和c)；實際上，與對照(EYFP:BLA-CeA和ChR2:BLA胞體組)相比，ChR2:BLA-CeA組在CeA中BLA終末的光誘導活化期間在開臂中所花的時間顯著更多(t(42)＝8.312；p<0.00001；圖3b、c)。ChR2:BLA-CeA小鼠還表現(xiàn)出從迷宮中心的選擇點進入開臂而非閉臂的可能性增加(圖3c插圖)，從而表明選擇正常致焦慮環(huán)境的可能性增加。

我們還探索了小鼠在曠場區(qū)域中六個為期3分鐘的時期，通過在無光(滅)和光刺激(開)條件之間交替再次測試了可逆性。實驗(ChR2:BLA-CeA)小鼠表現(xiàn)出即時、強大和可逆的光誘導抗焦慮反應，如通過在曠場試驗箱中心的時間所度量(圖3d和e)，而EYFP:BLA-CeA和ChR2:BLA胞體組中的小鼠則未表現(xiàn)出這種反應(圖3e)。光刺激未明顯改變活動度(圖3f)。雖然在光滅條件下在各組之中無可檢測的差異，但是在光開條件下在ChR2:BLA-CeA組中與EYFP:BLA-CeA或ChR2:BLA胞體組相比，小鼠在曠場中心所化的時間顯著增加(t(105)＝4.96178；對于各對比p<0.0001)。我們得出結(jié)論，選擇性刺激BLA向CeA而非BLA胞體的投射產(chǎn)生了急性、快速可逆的抗焦慮作用，從而支持BLA-CeL-CeM通路可能代表了焦慮控制的天然微回路這一假設。

我們接著研究了此光誘導的抗焦慮作用的生理基礎。BLA中的谷氨酸能神經(jīng)元向CeL神經(jīng)元以及向CeM神經(jīng)元發(fā)送強大的興奮性投射³⁸；但是，預計不僅是遠離光源的CeM突觸(圖8)而且這些CeM神經(jīng)元的任何剩余直接興奮都會導致致焦慮作用而非抗焦慮作用¹²。然而，CeL神經(jīng)元可向這些腦干投射性CeM輸出神經(jīng)元發(fā)揮強效抑制作用^32,35,40，因此，我們假設了對CeA中BLA終末的照明可使BLA-CeL神經(jīng)元活化，從而引起CeM神經(jīng)元上的前饋抑制并產(chǎn)生觀察到的抗焦慮現(xiàn)象。

為了確認這種光遺傳學限定的投射的工作原理，我們通過與行為實驗中相匹配的光遞送方案進行了體內(nèi)實驗，并將活性依賴性即刻早期基因(c-fos)表達分析作為讀出結(jié)果以確認神經(jīng)元活化模式(圖3g-k)。在設盲條件下，我們對ChR2:BLA-CeA、EYFP:BLA-CeA和ChR2:BLA胞體組的BLA、CeL和CeM中表達EYFP或表現(xiàn)出c-fos免疫反應性的神經(jīng)元比例定量(圖3i-k)。在BLA中受CaMKIIα啟動子控制的病毒表達靶向谷氨酸能神經(jīng)元⁴⁷，并且我們未在局域中間神經(jīng)元和閏細胞中觀察到EYFP表達(圖10)。在各區(qū)域內(nèi)在各組之中未檢測到EYFP陽性細胞比例的顯著差異(圖3g-k)，但是我們發(fā)現(xiàn)了與ChR2:BLA-CeA或EYFP:BLA-CeA組相比ChR2:BLA胞體組中c-fos陽性BLA細胞的比例顯著更高(圖3i；分別為p<0.01和p<0.05)。在ChR2:BLA-CeA與EYFP:BLA-CeA組之間c-fos無可檢測的差異，從而表明斜口插管屏蔽有效地防止了向BLA細胞體的直接照明。在ChR2:BLA-CeA組中，相對于EYFP:BLA-CeA組(p<0.05)但非ChR2:BLA胞體組，顯著更高比例的CeL神經(jīng)元表達了c-fos(圖3j)。因此，對CeA中表達ChR2的BLA終末的選擇性照明導致了CeL神經(jīng)元的優(yōu)先活化，而不活化BLA胞體。在CeM中，我們發(fā)現(xiàn)了ChR2:BLA胞體組中的c-fos陽性神經(jīng)元(相對于總神經(jīng)元)多達ChR2:BLA-CeA中的兩倍(圖3k)，這與解剖學投射一致，因為LA神經(jīng)元選擇性支配CeL神經(jīng)元，而杏仁核的BL和BM核中的神經(jīng)元具有向CeL和CeM兩者的單突觸投射^38,43,51?？傊?，這些數(shù)據(jù)揭露出：觸發(fā)急性抗焦慮行為表型的體內(nèi)照明執(zhí)行對BLA-CeL突觸的選擇性照明而不活化BLA細胞體。

為了檢驗CeL中BLA終末的選擇性照明誘導CeM輸出神經(jīng)元的前饋抑制這一假設，我們將全細胞膜片鉗記錄與實時雙光子成像相結(jié)合以觀察微回路，同時在投射特異性光遺傳學控制期間探索這些細胞之間的功能關系(圖4a-f)。當將體內(nèi)所用的光刺激參數(shù)通過光纖遞送時以及將用于我們的離體實驗的參數(shù)遞送到急性切片上時，我們使靶標位置的光功率密度匹配為約6mW/mm²。圖4a顯示了BLA-CeL-CeM回路的雙光子圖像，所有三種細胞均通過同一切片成像(圖4a)。對于20Hz、5毫秒的473nm光脈沖的直接照明，表達ChR2-EYFP的BLA神經(jīng)元顯示出穩(wěn)健、高保真度的尖峰(圖4b)。在表達ChR2-EYFP的BLA神經(jīng)元的終末區(qū)域照明期間記錄的CeL神經(jīng)元的代表性圖線證實了在CeL中所見的典型興奮性反應(圖4c)，其中神經(jīng)元群匯總揭露了尖峰保真度在40個脈沖光序列中保持穩(wěn)定，以及揭露了反應性細胞包括弱和強興奮的CeL細胞(n＝16；圖4c)。為了測試對BLA-CeL突觸的照明是否會因為來自CeL神經(jīng)元的穩(wěn)健前饋抑制而在阻斷CeM細胞中尖峰的水平上具有功能上的顯著性，我們在選擇性照明BLA-CeL突觸的同時從CeM神經(jīng)元進行了記錄(圖4d)。實際上，我們觀察到了因CeL中BLA終末的光刺激所致的CeM中的強效尖峰抑制(F_2,11＝15.35,p＝0.0044)(圖4d；在照明之前(49±9.0)、期間(1.5±0.87)和之后(33±8.4)每秒的尖峰數(shù)；平均值±s.e.m)。接下來，圖4e顯示了在表達ChR2-EYFP的CeM中BLA神經(jīng)元終末區(qū)域的照明期間記錄的CeM反應，以及合并的興奮性和抑制性輸入。電壓鉗記錄中的細胞群匯總示出了EPSC的延遲短于雙突觸PEPSC的延遲，并且示出了平均IPSC振幅大于平均EPSC振幅(分別在0和-70mV下記錄；圖4e)。重要的是，在部位之間交替時，完全相同的CeM神經(jīng)元(n＝7)在對CeM的BLA輸入進行廣泛照明的情況下以可重復的方式產(chǎn)生了凈興奮(圖4e)，但是在對CeL的BLA輸入進行選擇性照明的情況下則顯示出凈抑制(圖4f)。這證實了從BLA向CeM的直接和間接輸入的平衡可調(diào)節(jié)CeM輸出?？傊@些數(shù)據(jù)揭露出在結(jié)構(gòu)和功能上鑒定的生理微回路，而CeA中BLA終末的選擇性照明借此使BLA-CeL突觸活化，從而增加從CeL神經(jīng)元向腦干投射性CeM神經(jīng)元的前饋抑制。

為了進一步闡明此抗焦慮作用潛在的杏仁核微回路，我們仔細分析了控制這一現(xiàn)象的解剖和功能特性。雖然已在大鼠中作出了一些努力以對CeA中的BLA側(cè)支的投射作圖，但是我們根據(jù)經(jīng)驗測試了是重疊的還是不同的BLA神經(jīng)元群投射到CeL和CeM(圖5a、圖5b)。一個值得注意的事情是我們在約350um厚的冠狀斷面中觀察這些神經(jīng)元，并且雖然已經(jīng)盡了一切努力排除軸突被切斷的神經(jīng)元，但是我們無法排除發(fā)生這種情況的可能性，我們也不能否認這引起了靠近CeA的BLA神經(jīng)元的一些采樣偏差。圖5a匯總了采樣的BLA神經(jīng)元(n＝18)的解剖學投射，并表明44％的神經(jīng)元僅投射到CeL以及17％的僅投射到CeM。然而，少量的BLA細胞(n＝1；6％)投射到CeL和CeM兩者，其中一個向CeL和CeM發(fā)送單獨的側(cè)支，其中一個發(fā)送一個側(cè)支，該側(cè)支再向CeL和CeM發(fā)送分支。圖5b顯示了采樣的每個細胞的雙光子圖像，它們均表現(xiàn)出電流階躍時BLA錐體神經(jīng)元典型的尖峰模式。

接下來，由于我們的c-fos測定表明CeL中的BLA終末的照明足以使CeL神經(jīng)元興奮，但非BLA神經(jīng)元本身，我們試圖通過全細胞記錄證實這一假設。通過電刺激，軸突終末的去極化導致了細胞體處的逆行尖峰。然而，有證據(jù)表明光遺傳學誘導的去極化通過不同的機制發(fā)揮功能。為了評價光遺傳學誘導的終末刺激在此杏仁核微回路中的特性，我們從表達ChR2的BLA錐體神經(jīng)元進行了記錄，并以視覺確定的軸突側(cè)支上方的方向以及不存在軸突的方向?qū)⒐獍?直徑約120μm)以100μm的步長從細胞體移動(圖5c)。給予20Hz光序列時在與胞體各距離處的BLA神經(jīng)元尖峰保真度匯總在圖5d中，而去極化電流則匯總在圖5e中。在所有標本中，我們確認了所用的光刺激參數(shù)足以引起B(yǎng)LA細胞體處的高保真度尖峰(圖5f)和BLA終末處的可靠囊泡釋放，如通過從突觸后CeL神經(jīng)元進行的記錄所示(圖5g；圖15)。相比之下，當使光斑距離細胞體300um從相同的BLA神經(jīng)元進行記錄時，我們未觀察到可靠的動作電位，無論是否在軸突上方(分別見圖5h、圖5i)。甚至在浴液灌流GABA和AMPA受體拮抗劑時也觀察到了這種逆行尖峰的存在(n＝7)，從而排除了局部抑制性限制的可能貢獻。雖然我們證實了光遺傳學誘導的囊泡釋放可在BLA錐體神經(jīng)元中在不存在逆行刺激的情況下發(fā)生，但是可能的是，在逆行刺激下可通過比我們在此處所用的(約6mW/mm²)更大的光功率密度實現(xiàn)這種釋放。迄今，我們已證實了投射到CeL和CeM的BLA神經(jīng)元群有很大的區(qū)別，并且BLA-CeL突觸的照明誘導囊泡釋放和CeL興奮而不使BLA胞體本身強烈活化。

最后，我們在投射特異性光遺傳學控制的設置中通過體內(nèi)藥理學分析進一步探索了該機制。為了確定我們觀察到的抗焦慮作用是否可能是由于BLA-CeL突觸單獨的選擇性活化所致，而不是穿過CeA的BLA纖維，也不是動作電位向BLA細胞體的反向傳播(隨后會支配所有BLA投射靶區(qū)域)，我們測試了局部谷氨酸受體拮抗是否會減弱光誘導的抗焦慮作用。這個問題非常引人關注，因為改變焦慮的CeA中的病變因BLA向穿過CeA的BNST的投射的消融可能性而使人困惑⁶。我們用AAV-CaMKIIα-ChR2-EYFP對BLA神經(jīng)元進行了單側(cè)轉(zhuǎn)導，并植入了斜口插管以如之前對CeA中的BLA終末進行選擇性照明(n＝8；圖8)，并在高架十字迷宮和曠場試驗中對小鼠進行了測試。然而，在這種情況下，我們在相同的動物中通過不同的試驗輸注谷氨酸拮抗劑NBQX和AP5(使用光纖引導插管)或鹽水對照，其中試驗的順序反平衡。確認局部突觸機制而非對纖維通道的控制，對于相同的小鼠和光刺激參數(shù)，CeA中的局部谷氨酸受體拮抗作用在高架十字迷宮(圖5k)和曠場試驗(圖5j)中均取消了光誘導的焦慮減輕。重要的是，在對照實驗中，藥物處理未損害活動度(圖11)，并且浴液灌流NBQX和AP5時在急性切片中的鎖時光誘發(fā)興奮性反應被取消(圖12)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，我們觀察到的光誘導的抗焦慮作用通過BLA-CeL突觸的活化所致，而不是歸因于BLA向穿過CeA的遠側(cè)靶標的投射。

在最后一系列實驗中，為了確定內(nèi)源性焦慮減輕過程是否會被此通路的選擇性抑制而阻斷，我們測試了這些光遺傳學限定的突觸的選擇性抑制是否會可逆地增加焦慮。我們在BLA中均在CaMKIIα啟動子的控制下執(zhí)行了單獨的eNpHR3.0(一種在通過琥珀色光照明時使神經(jīng)元膜超極化的光活化氯離子泵²⁵)或EYFP的雙側(cè)病毒轉(zhuǎn)導，并植入了雙側(cè)斜口插管以允許對CeA中的BLA終末進行選擇性照明(圖6a；圖13)。eNpHR3.0表達被限制到BLA中的谷氨酸能CaMKIIα陽性神經(jīng)元(圖6b)。在CeM中，eNpHR3.0:BLA-CeA組相對于EYFP:BLA-CeA雙側(cè)和eNpHR 3.0:胞體組僅表現(xiàn)出c-fos表達水平的顯著升高(p<0.05；圖6c-e)，這與以下假設一致：選擇性抑制CeA中的BLA終末將抑制從CeL神經(jīng)元向CeM神經(jīng)元的前饋抑制，從而增強CeM興奮性和導致焦慮表型增加的下游過程。重要的是，BLA胞體的抑制未誘導致焦慮反應，這可能是由于直接BLA-CeM興奮性輸入的同時降低。我們還發(fā)現(xiàn)，eNpHR3.0:BLA-CeA組相對于EYFP和胞體組(圖6f、圖6g)在光開期間但非光滅期間表現(xiàn)出高架十字迷宮上開臂時間和開臂進入概率的顯著降低，但不改變活動度(圖16)。eNpHR3.0:BLA-CeA組還顯示出相對于EYFP和胞體組在用594nm光照明時中心時間的顯著縮短(統(tǒng)計，p＝0.002；圖6h、圖6i)。最后，我們還證實了表達eNpHR3.0的軸突終末的選擇性照明可降低自發(fā)(圖6j-l)和誘發(fā)(圖6m-p)囊泡釋放的概率，而不阻止細胞體處的尖峰(圖14)。這些數(shù)據(jù)證實了CeA中BLA終末的選擇性抑制可誘導焦慮樣行為的急性增強。

結(jié)論：在這些實驗中，我們鑒定了作為內(nèi)源性神經(jīng)基質(zhì)用于雙向調(diào)節(jié)焦慮的非條件表達的BLA-CeL通路。雖然我們將BLA-CeL通路確定為關鍵基質(zhì)而非穿過CeL的BLA纖維，但是可能的是，諸如向BNST的CeA投射的其他下游回路也在焦慮或焦慮相關行為的表達中發(fā)揮著重要作用^4,6,13。實際上，我們的發(fā)現(xiàn)可支持這樣一種見解，即BNST中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)網(wǎng)絡可在調(diào)節(jié)焦慮相關行為中發(fā)揮關鍵作用^6,52，因為CeL是BNST的主要CRH來源⁵³。

其他神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)可調(diào)節(jié)或門控對分布式神經(jīng)回路的作用，包括血清素^54,55、多巴胺⁵⁶、乙酰膽堿⁵⁷、甘氨酸⁵⁸、GABA¹³和CRH⁵⁹。會聚到此通路以及從此通路分開的神經(jīng)回路將提供許多調(diào)節(jié)控制機會，因為BLA-CeL突觸的平行或下游回路可能有助于調(diào)節(jié)焦慮表型的表達^6,56。此外，在杏仁核的上游，該微回路良好定位，以被來自對處理恐懼和焦慮具有重要意義的區(qū)域的自上而下的皮質(zhì)控制所利用，包括提供對BLA和CeL的強大神經(jīng)支配的前邊緣、下邊緣和島葉皮質(zhì)^4,13,23,60。

我們對BLA解剖學的研究表明，投射到CeL和CeM神經(jīng)元的BLA神經(jīng)元群大部分不重疊。在自然狀態(tài)下，投射CeL的BLA神經(jīng)元可以微回路體內(nèi)平衡機制使投射CeM的BLA神經(jīng)元興奮。當存在偏離回路平衡的突觸變化以允許未受抑制的CeM活化時，這還可能代表了焦慮障礙潛在的一種可能機制。

總之，此處提供的數(shù)據(jù)支持將BLA-CeL突觸確定為關鍵性回路元件對于哺乳動物大腦中內(nèi)源性抗焦慮作用的表達既是必要的也是足夠的，從而提供一種深入研究焦慮的新渠道以及一種新的治療靶標，并且這些數(shù)據(jù)還證實了分解特異性投射在研究與精神疾病相關的神經(jīng)回路功能中的重要性。

本發(fā)明涉及以下實施方式：

1.一種包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白的動物，其中所述視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白，并且其中所述視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導所述動物的焦慮。

2.根據(jù)實施方式1所述的動物，其中所述視蛋白選自NpHR、BR、AR和GtR3。

3.根據(jù)實施方式1所述的動物，還包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的第二光反應性視蛋白，其中所述第二視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中所述第二視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明減輕所述動物的焦慮。

4.根據(jù)實施方式3所述的動物，其中所述第二視蛋白選自ChR2、VChR1和DChR。

5.一種包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白的動物，其中所述視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中所述視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明減輕所述動物的焦慮。

6.根據(jù)實施方式5所述的動物，其中所述第二視蛋白選自ChR2、VChR1和DChR。

7.一種用于將核酸遞送到個體中的BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元的載體，其中所述載體包含編碼光反應性視蛋白的所述核酸并且所述核酸可操作地連接到控制所述視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子。

8.根據(jù)實施方式7所述的載體，其中編碼所述視蛋白的所述核酸可操作地連接到CaMKIIα啟動子。

9.根據(jù)實施方式7所述的載體，其中所述載體為AAV載體。

10.根據(jù)實施方式7所述的載體，其中所述視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白，并且其中所述視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明緩解焦慮。

11.根據(jù)實施方式10所述的載體，其中所述視蛋白選自ChR2、VChR1和DChR。

12.根據(jù)實施方式7所述的載體，其中所述視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白，并且其中所述視蛋白在BLA-CeL中的選擇性照明誘導焦慮。

13.根據(jù)實施方式12所述的載體，其中所述視蛋白選自NpHR、BR、AR和GtR3。

14.根據(jù)實施方式7所述的載體，其中所述個體為小鼠或大鼠。

15.一種用于將核酸遞送到個體中的BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元的方法，包括向所述個體施用有效量的載體，所述載體包含編碼光反應性視蛋白的核酸并且所述核酸可操作地連接到控制所述視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子。

16.一種包含BLA、CeL和CeM的冠狀腦組織切片，其中光反應性蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達。

17.一種用于篩選可緩解焦慮的化合物的方法，包括

(a)將化合物施用給患有通過選擇性照明在BLA谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的視蛋白而誘導的焦慮的動物，其中所述動物包含在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達的光反應性視蛋白，其中所述視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白；以及

(b)確定所述動物的焦慮水平，其中所述焦慮水平的降低表示所述化合物可有效治療焦慮。

18.根據(jù)實施方式17所述的方法，其中所述視蛋白選自NpHR、BR、AR和GtR3。

19.一種用于緩解個體焦慮的方法，包括：

(a)向所述個體施用有效量的載體，所述載體包含編碼光反應性視蛋白的核酸并且所述核酸可操作地連接到控制所述視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子，其中所述視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達，其中所述視蛋白為通過光誘導去極化的視蛋白；以及

(b)選擇性照明BLA-CeL的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中的所述視蛋白以緩解焦慮。

20.根據(jù)實施方式19所述的方法，其中所述視蛋白選自ChR2、VChR1和DChR。

21.一種用于誘導個體焦慮的方法，包括：

(a)向所述個體施用有效量的載體，所述載體包含編碼視蛋白的核酸并且所述核酸可操作地連接到控制所述視蛋白在BLA的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中特異性表達的啟動子，其中所述視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中表達，其中所述視蛋白為通過光誘導超極化的視蛋白；以及

(b)選擇性照明BLA-CeL的谷氨酸能錐體神經(jīng)元中的所述視蛋白以誘導焦慮。

22.一種涉及改變BLA-CeM的活性以治療或研究焦慮的裝置或方法。

23.根據(jù)實施方式22所述的裝置或方法，其中改變活性包括選擇性刺激BLA-CeL。

24.根據(jù)實施方式22所述的裝置或方法，其中改變活性包括通過光反應性視蛋白在谷氨酸能錐體神經(jīng)元中的靶向表達而選擇性刺激BLA-CeL。

25.根據(jù)實施方式24所述的裝置或方法，其中改變活性還包括相對于BLA胞體的照明而選擇性照明CeA。

26.根據(jù)實施方式24所述的裝置或方法，還包括在CeL上方植入斜口引導插管以防止光線遞送到BLA并允許選擇性照明20CeA。

27.根據(jù)實施方式22所述的裝置或方法，還包括篩選治療措施，所述治療措施包括但不限于藥劑、電刺激、磁刺激、手術或光遺傳學刺激中的一種或多種。

28.根據(jù)前述實施方式任一項所述的裝置或方法，還涉及提供靶向BLA-CeM回路的治療措施，所述治療措施包括但不限于藥劑、電刺激、磁刺激、手術或光遺傳學刺激中的一種或多種。

29.一種使用本公開所述的回路模型研究和探索焦慮和/或相關障礙的裝置或方法。

30.根據(jù)前述實施方式任一項所述的裝置或方法，還包括確定表型、內(nèi)表型和治療靶標中的一種或多種。

31.一種根據(jù)本公開的任何實施方案的裝置或方法，所述實施方案包括實施例中所述的實施方案。

雖然已出于清楚理解的目的通過例證和實例的方式比較詳細地說明了上述發(fā)明，但是這些說明和實例不應視為限制本發(fā)明的范圍。

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參考文獻

1.Lieb,R.Anxiety disorders:clinical presentation and epidemiology.Handb Exp Pharmacol,405-432(2005).

2.Kessler,R.C.,et al.Lifetime prevalence and age-of-onset distributions of DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication.Arch Gen Psychiatry 62,593-602(2005).

3.Koob,G.F.Brain stress systems in the amygdala and addiction.Brain Res 1293,61-75(2009).

4.Ressler,K.J.&Mayberg,H.S.Targeting abnormal neural circuits in mood and anxiety disorders:from the laboratory to the clinic.Nat Neurosci 10,1116-1124(2007).

5.Vanderschuren,L.J.&Everitt,B.J.Behavioral and neural mechanisms of compulsive drug seeking.Eur J Pharmacol 526,77-88(2005).

6.Davis,M.,Walker,D.L.,Miles,L.&Grillon,C.Phasic vs sustained fear in rats and humans:role of the extended amygdala in fear vs anxiety.Neuropsychopharmacology 35,105-135.

7.Ehrlich,I.,et al.Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.Neuron 62,757-771(2009).

8.Han,J.H.,et al.Selective erasure of a fear memory.Science 323,1492-1496(2009).

9.Herry,C.,et al.Switching on and off fear by distinct neuronal circuits.Nature 454,600-606(2008).

10.LeDoux,J.The emotional brain,fear,and the amygdala.Cell Mol Neurobiol 23,727-738(2003).

11.Maren,S.&Quirk,G.J.Neuronal signaling of fear memory.Nat Rev Neurosci 5,844-852(2004).

12.Pare,D.,Quirk,G.J.&Ledoux,J.E.New vistas on amygdala networks in conditioned fear.J Neurophysiol 92,1-9(2004).

13.Shin,L.M.&Liberzon,I.The neurocircuitry of fear,stress,and anxiety disorders.Neuropsychopharmacology 35,169-191.

14.Davis,M.The role of the amygdala in conditioned and unconditioned fear and anxiety.in The Amygdala(ed.A.JP)p.213-288(Oxford University Press,Oxford,UK,2000).

15.Killcross,S.,Robbins,T.W.&Everitt,B.J.Different types of fear-conditioned behaviour mediated by separate nuclei within amygdala.Nature 388,377-380(1997).

16.Tye,K.M.&Janak,P.H.Amygdala neurons differentially encode motivation and reinforcement.J Neurosci 27,3937-3945(2007).

17.Tye,K.M.,Stuber,G.D.,de Ridder,B.,Bonci,A.&Janak,P.H.Rapid strengthening of thalamo-amygdala synapses mediates cue-reward learning.Nature 453,1253-1257(2008).

18.Bahi,A.,Mineur,Y.S.&Picciotto,M.R.Blockade of protein phosphatase 2B activity in the amygdala increases anxiety-and depression-like behaviors in mice.Biol Psychiatry 66,1139-1146(2009).

19.Davis,M.Are different parts of the extended amygdala involved in fear versus anxiety？Biol Psychiatry 44,1239-1247(1998).

20.Etkin,A.,et al.Individual differences in trait anxiety predict the response of the basolateral amygdala to unconsciously processed fearful faces.Neuron 44,1043-1055(2004).

21.Kalin,N.H.,Shelton,S.E.&Davidson,R.J.The role of the central nucleus of the amygdala in mediating fear and anxiety in the primate.J Neurosci 24,5506-5515(2004).

22.Roozendaal,B.,McEwen,B.S.&Chattarji,S.Stress,memory and the amygdala.Nat Rev Neurosci(2009).

23.Stein,M.B.,Simmons,A.N.,Feinstein,J.S.&Paulus,M.P.Increased amygdala and insula activation during emotion processing in anxiety-prone subjects.Am J Psychiatry 164,318-327(2007).

24.Boyden,E.S.,Zhang,F.,Bamberg,E,Nagel,G.&Deisseroth,K.Millisecond-timescale,genetically targeted optical control of neural activity.Nat Neurosci 8,1263-1268(2005).

25.Gradinaru,V.,at aL Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.Ce//141,154-165.

26.Nagel,G.,at al.Channelrhodopsin-2,a directly light-gated cation-selective membrane channel.Proc Nat/Acad Sci U S A 100,13940-13945(2003).

27.Fraser,A.D.Use and abuse of the benzodiazepines.Ther Drug Monit 20,481-489(1998).

28.Woods,J.H.,Katz,J.L.&Winger,G.Benzodiazepines:use,abuse,and consequences.

Pharmacol Rev 44,151-347(1992).

29.Hovatta,I.&Barlow,C.Molecular genetics of anxiety in mice and men.Anti Med 40,92-109(2008).

30.Hovatta,I.,et al.Glyoxalase 1 and glutathione reductase 1 regulate anxiety in mice.Nature 438,662-666(2005).

31.Blanchard,R.J.,Yudko,E.B.,Rodgers,R.J.&Blanchard,D.C.Defense system psychopharmacology:an ethological approach to the pharmacology of fear and anxiety.Behav Brain Res 58,155-165(1993).

32.LeDoux,J.E.,Iwata,J.,Cicchetti,P.&Reis,D.J.Different projections of the central amygdaloid nucleus mediate autonomic and behavioral correlates of conditioned fear.J Neurosci 8,2517-2529(1988).

33.Carlson,J.lrnmunocytochemical localization of glutamate decarboxylase in the rat basolateral amygdaloid nucleus,with special reference to GABAergic innervation of amygdalostriatal projection neurons.J Comp Neurol 273,513-526(1988).

34.Smith,Y.&Pare,D.Intra-amygdaloid projections of the lateral nucleus in the cat:PHA-L anterograde labeling combined with postembedding GABA and glutamate immunocytochemistry.J Comp Neurol 342,232-248(1994).

35.McDonald,A.J.Cytoarchitecture of the central amygdaloid nucleus of the rat.J Comp Neurol 208,401-418(1982).

36.Bissiere,S.,Humeau,Y.&Luthi,A.Dopamine gates LTP induction in lateral amygdala by suppressing feedforward inhibition.Nat Neurosci 6,587-592(2003).

37.Marowsky,A.,Yanagawa,Y.,Obata,K.&Vogt,K.E.A specialized subclass of interneurons mediates dopaminergic facilitation of amygdala function.Neuron 48,1025-1037(2005).

38.Pitkanen,A.Connectivity of the rat amygdaloid complex.in The Amygdala(ed.A.JP)p.31-99(Oxford University Press,Oxford,UK,2000).

39.Krettek,J.E.&Price,J.L.Amygdaloid projections to subcortical structures within the basal forebrain and brainstem in the rat and cat.J Comp Neurol 178,225-254(1978).

40.Petrovich,G.D.&Swanson,L.W.Projections from the lateral part of the central amygdalar nucleus to the postulated fear conditioning circuit.Brain Res 763,247-254(1997).

41.LeDoux,J.E.,Cicchetti,P.,Xagoraris,A.&Romanski,L.M.The lateral amygdaloid nucleus:sensory interface of the amygdala in fear conditioning.J Neurosci 10,1062-1069(1990).

42.Krettek,J.E.&Price,J.L.A description of the amygdaloid complex in the rat and cat with observations on intra-amygdaloid axonal connections.J Comp Neurol 178,255-280(1978).

43.Petrovich,G.D.,Risold,P.Y.&Swanson,L.W.Organization of projections from the basomedial nucleus of the amygdala:a PHAL study in the rat.J Comp Neural 374,387-420(1996).

44.Pare,D.&Smith,Y.The intercalated cell masses project to the central and medial nuclei of the amygdala in cats.Neuroscience 57,1077-1090(1993).

45.Likhtik,E.,Popa,D.,Apergis-Schoute,J.,Fidacaro,G.A.&Pare,D.Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.Nature 454,642-645(2008).

46.Jolkkonen,E.&Pitkanen,A.Intrinsic connections of the rat amygdaloid complex:projections originating in the central nucleus.J Comp Neurol 395,53-72(1998).

47.Amano,T.,Unal,C.T.&Pare,D.Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.Nat Neurosci 13,489-494.

48.McDonald,A.J.,Muller,J.F.&Mascagni,F.GABAergic innervation of alpha type II calcium/calmodulin-dependent protein kinase immunoreactive pyramidal neurons in the rat basolateral amygdala.J Comp Neurol 446,199-218(2002).

49.Choleris,E.,Thomas,A.W.,Kavaliers,M.&Prato,F.S.A detailed ethological analysis of the mouse open field test:effects of diazepam,chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field.Neurosci Biobehav Rev 25,235-260(2001).

50.Pellow,S.,Chopin,P.,File,S.E.&Briley,M.Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.J Neurosci Methods 14,149-167(1985).

51.Sah,P.&Lopez De Armentia,M.Excitatory synaptic transmission in the lateral and central amygdala.Ann N YAcad Sci 985,67-77(2003).

52.Davis,M.&Shi,C.The extended amygdala:are the central nucleus of the amygdala and the bed nucleus of the stria terminalis differentially involved in fear versus anxiety？Ann N YAcad Sci 877,281-291(1999).

53.Sakanaka,M.,Shibasaki,T.&Lederis,K.Distribution and efferent projections of corticotropin-releasing factor-like immunoreactivity in the rat amygdaloid complex.Brain Res 382,213-238(1986).

54.Holmes,A.,Yang,R.J.,Lesch,K.P.,Crawley,J.N.&Murphy,D.L.Mice lacking the serotonin transporter exhibit 5-HT(1A)receptor-mediated abnormalities in tests for anxiety-like behavior.Neuropsychopharmacology 28,2077-2088(2003).

55.Lesch,K.P.,et al.Association of anxiety-related traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region.Science 274,1527-1531(1996).

56.Graybiel,A.M.&Rauch,S.L.Toward a neurobiology of obsessive-compulsive disorder.Neuron 28,343-347(2000).

57.Picciotto,M.R.,Brunzell,D.H.&Caldarone,B.J.Effect of nicotine and nicotinic receptors on anxiety and depression.Neuroreport 13,1097-1106(2002).

58.Snyder,S.H.&Enna,S.J.The role of central glycine receptors in the pharmacologic actions of benzodiazepines.Adv Biochem Psychopharmacol,81-91(1975).

59.Lesscher,H.M.,et al.Amygdala protein kinase C epsilon regulates corticotropin-releasing factor and anxiety-like behavior.Genes Brain Behav 7,323-333(2008).

60.Milad,M.R.,Rauch,S.L.,Pitman,R.K.&Quirk,G.J.Fear extinction in rats:implications for human brain imaging and anxiety disorders.Biol Psycho！73,61-71(2006).