本發明屬于植物倍性育種領域，為紅葉衛矛三倍體細胞工程育種方法。涉及野生紅葉衛矛種子胚乳細胞誘導形成愈傷組織；游離原生質體，染色及倍性分選三倍體原生質體；原生質體誘導再生小植株；小植株頂芽休眠解除等進程和方法。

背景技術：

紅葉衛矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）是衛矛科衛矛屬落葉灌木，樹枝幼時綠色、無毛，老枝上有木栓質的翅。花淺紅或淺黃色。春夏季葉片深綠色，秋季變為紫紅色或火紅色故稱‘火焰衛矛’，作為園林花木孤植、列植、群植于景區、校園、庭院、湖旁、草坪中，具有極高觀賞價值（劉艷霞，2015），喬灌搭配群體綠化具有萬山紅遍層林盡染之感。紅葉衛矛抗旱，耐瘠薄，抗寒－34.4℃，在美國廣為栽培。由于該樹種適應性強，繁殖能力、生存能力強，在21個州已列為入侵種。康涅狄克大學新英格蘭地區入侵物種研究中心改良E.alatus ‘Compactus’，獲得三倍體植株，擬取代野生二倍體或通過種子繁育的群體，已申報美國國家專利保護。

目前，人工培育三倍體的主要方法是通過四倍體與二倍體雜交、胚乳細胞離體培養后篩選、2n配子誘導后雜交等方式（蘇靜，等，2012）。其中胚乳作為多倍體細胞混合組織，其內含有天然的三倍體細胞，對其進行培養誘導再生植株，可從中篩選出三倍體植株。此方法已用于多種植物的三倍體育種，如柑桔（王大元，張進仁，1978）、獼猴桃（黃貞光，等,1982）、枸杞（米佳麗，等,2011）、巴戟天（姚焱，等,2015）等。康涅狄克大學新英格蘭地區入侵物種研究中心即是采用胚乳離體培養的方式，經過愈傷組織及其不定芽的誘導，獲得再生植株，最后對其進行倍性篩選，獲得三倍體植株（Thammina, et al.,2011）。在該實驗中，成熟胚乳誘導產生愈傷組織的誘導率為14.0%；愈傷組織誘導再生不定芽（植株）的誘導率為13.4%；其中，三倍體植株占28.6%，成熟胚乳細胞形成三倍體植株的幾率為0.34%；若采用未成熟胚乳進行離體培養，形成三倍體植株的幾率為0.42%.該實驗流程簡單易行，便于操作，但工作量大，愈傷組織及不定芽誘導率低，且胚乳組織中多數為二倍體細胞，再生植株中三倍體植株比率較小。

由于流式細胞儀可高效檢測顆粒樣品所帶熒光強度，因而在植物DNA含量檢測與倍性分析中得到廣泛應用。雖然未見流式細胞儀用于植物細胞倍性分選的相關報道，但已有人利用流式細胞儀分選有活力的原生質體（郭艷萍，等，2014）。Hoechst 33342為一種活體DNA熒光染料，可與活體DNA特異結合，在紫外光下發射藍色熒光。鑒于植物細胞壁在紫外光下亦產生藍色的自發熒光，因而進行倍性分選的植物材料宜選用原生質體。而Hoechst 33342染色并不影響原生質體活力，可培養形成愈傷組織（van der Valk, et al,1988）。因此，可利用流式細胞儀分選三倍體細胞進行培養誘導再生植株，提高三倍體植株所占比率。

我國2012年立項引進美國三倍體紅葉衛矛培育技術。通過引進、消化、吸收過程，對原技術進行改良、優化和創新形成在育種工藝、配方和效率等方便獲得改進和提升的新的育種技術體系。基于多倍體胚乳愈傷組織直接誘導小植株從中篩選三倍體植株的育種程序，本研究用多倍體胚乳愈傷組織游離原生質體，利用流式細胞儀分選三倍體原生質體進行培養，精準誘導三倍體植株再生，三倍體植株獲得效率在0.42%基礎上大大提升。小植株頂芽休眠解除在以低溫處理基礎上研發了植物生長調節劑整合低溫處理和容器苗技術，休眠解除效率提高到90%以上，且為容器苗，移栽成活率得到保證。

技術實現要素：

本發明要點一，提供了一種紅葉衛矛胚乳愈傷組織誘導方式。其愈傷組織誘導培養基成分包含基本培養基：MS無機鹽，維生素B1 0.1-1.0 mg/L、維生素B6 0.1-0.5 mg/L、煙酸0.1-0.5 mg/L、甘氨酸1.0-2.0 mg/L、水解酪蛋白0.3-0.6 g/L、嗎啉乙磺酸0.5-1.0 g/L；植物生長調節劑：6-BA 1.0-3.0 mg/L、NAA0.5-2.0 mg/L；蔗糖20-30 g/L；瓊脂6-8 g/L。胚與胚乳黑暗條件下室內共同培養4周后，將胚剝離，胚乳轉接至愈傷組織誘導培養基上繼續黑暗培養。胚伴隨的胚乳愈傷組織誘導率遠高于無胚伴隨的胚乳愈傷組織誘導率，可達80%。

本發明要點二，提供了紅葉衛矛愈傷組織游離原生質體的酶解方法。其酶解液成分包含原生質體洗滌液：KH₂P0₄ 20-27.2 mg/L、KNO₃ 90-101 mg/L、MgSO₄ ?7H₂O 180-246 mg/L、KI 0.10-0.16 mg/L、CuSO₄ 0.010-0.025 mg/L、CaCl₂?2H₂O 1000-1480 mg/L、甘露醇 0.5-0.7 M/L、嗎啉乙磺酸5-25 mM/L；細胞壁水解酶：纖維素酶 1.0-2.0%、離析酶 0.5-1.0%、果膠酶 0.5-1.0%；HCl 1 M/L和NaOH 1 M/L水溶液用于調節pH值為5.2-5.8。其酶解條件為黑暗條件下25-29℃酶解4-8小時，期間每小時輕柔顛倒混勻一次。

本發明要點三，提供了一種紅葉衛矛原生質體DNA染色及倍性分選的方法。胚乳愈傷組織與葉片愈傷組織分別游離原生質體后進行DNA染色，染色液為濃度5-10 μg/ml 的Hoechst 33342，染色時間為3-5 min。原生質倍性分選，原生質體用原生質體洗滌液清洗后，以葉片愈傷組織的原生質體為二倍體對照，在無菌條件下利用流式細胞儀分選胚乳愈傷組織原生質體內的三倍體細胞，使其得到富集，從而提高其后不定芽誘導過程中三倍體植株的再生機率。注：Hoechst 33342為活體DNA染色劑，可特異性結合在DNA雙鏈上，染色后不影響原生質體活力。

本發明要點四，提供了一種紅葉衛矛原生質體再生植株的方法，包括三個連續階段。

階段1，原生質體培養形成愈傷組織。在無菌條件下將分選的原生質體與含低熔點瓊脂糖（凝固點為26~30℃）的原生質體培養基混勻后，傾倒于5cm培養皿內，四等分后，轉入含原生質體培養基的9cm培養瓶內。原生質體培養基成分包括上述發明要點一所述的基本培養基、甘露醇 0.5 M、6-BA 0.5-2.0 mg/L、NAA 0.5-1.0 mg/L。黑暗條件下24℃震蕩培養；形成愈傷組織塊后，將其轉接至愈傷組織誘導培養基上。

階段2，愈傷組織誘導再生不定芽。將愈傷組織接種在不定芽誘導培養基上，在24℃，光照強度36 μmol·m^-2·s^-1，光照時間16 h/d條件下培養8周，誘導形成不定芽。不定芽誘導培養基成分包括上述發明要點一所述的基本培養基；植物生長調節劑6-BA 2.0-6.0 mg/L、IBA 0.1-0.2 mg/L；瓊脂0.6-0.8 g/L。

階段3，不定芽誘導生根形成小植株。不定芽以兩步法誘導生根。第一步，不定芽在生根培養基Ⅰ上培養2周。生根培養基Ⅰ為?WPM+硝酸銨0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+IBA 1.0-3.0 mg/L ，pH為5.8。第二步，經過第一步培養的不定芽轉接至生根培養基Ⅱ上培養4周形成根系。生根培養基Ⅱ成分為?WPM+硝酸銨0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+活性炭 2.0-4.0 g/L ，pH為5.8）。

本發明要點五，提供了一種紅葉衛矛多倍體細胞獲得的小植株頂芽休眠的解除方法。上述紅葉衛矛多倍體細胞誘導培養的小植株種植接種在含GA₃ 2.0-4.0 mg/L及6-BA 1.0-2.0 mg/L的上述生根培養基Ⅱ上，置于3-8℃下暗處理30-45d；移至25℃，光照36 μmol·m^-2·s^-1，16 h/d條件下培養15-30 d，頂芽休眠解除率90%以上。

附圖說明

圖 1為胚乳誘導的愈傷組織；

圖 2為愈傷組織游離出的原生質體；

圖 3為愈傷組織再生形成的不定芽；

圖4為流式細胞術倍性檢測峰圖，其中200處為二倍體熒光強度，300處為三倍體熒光強度。

圖5為芽休眠解除后的生根組培苗。

具體實施方式

實施例一

紅葉衛矛胚乳誘導愈傷組織

紅葉衛矛（Euonymus alatus ‘Compactus’），在11月下旬采集成熟種子，去除假種皮，清水沖洗30 min，并用70%乙醇浸泡60s，置于含1% 吐溫-80及二氯異氰尿酸鈉的消毒液（有效氯濃度為1.0%）中震蕩處理20 min。無菌水沖洗種子5次，每次3 min。將已消毒的種子接種在含瓊脂的半凝固培養基的試管內。7天后篩選無菌種子，在無菌條件下以滅菌（121℃，0.11 MPa，20 min，下同）的解剖刀和鑷子去除種皮，將胚及胚乳一同接種在愈傷組織誘導培養基上，24℃下黑暗培養，每兩周繼代一次。第4周去除胚，胚乳繼續黑暗培養，第8周統計愈傷組織誘導率，愈傷組織誘導率可達80%。

實施例二

愈傷組織游離原生質體

紅葉衛矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）胚乳愈傷組織，選取淡黃色的胚乳愈傷組織，在4℃下暗處理24h，在無菌條件下用滅菌鑷子及解剖刀將愈傷組織切片，在電子天平上稱取愈傷組織0.5g。將愈傷組織置于含10 ml酶解液的50 ml離心管內，以封口膜封口，27 ℃下黑暗處理4 h，每小時輕柔地顛倒混勻一次。酶處理后，以300目細胞篩過濾，濾液置入新的離心管內并以封口膜封口，用低溫離心機離心，離心力為100 g，離心時間為3min。吸棄上清，加入原生質體洗滌液重懸，吸棄-重懸重復三次。將懸浮液定容至500μl，取少許懸浮液，用臺盼藍染色。染色液濃度為0.04%，染色時間為5 min。染色后的懸浮液滴加至細胞計數板上，在顯微鏡下觀察和統計原生質體游離個數及存活率。1 g愈傷組織可游離出2×10⁶ 個原生質體，存活率為91%。

實施例三

原生質體倍性分選與植株再生

紅葉衛矛（Euonymus alatus‘Compactus’）原生質體以Hoechst 33342染色液進行染色。染色液濃度為5 μg/ml，染色時間為5 min。100 g離心3 min，吸棄染色液，并用原生質體培養基重懸，重復三次。收集原生質體，在無菌條件下進行流式細胞分選，根據儀器使用說明書分選三倍體原生質體。

將分選所得三倍體原生質體與含低熔點瓊脂糖（凝固點為26~30℃），溫度為30-40℃的原生質體培養基混勻，倒入直徑5 cm的培養皿內。待凝固后，用已滅菌的解剖刀切成四等分，轉入含原生質體培養液的直徑9 cm的培養瓶內，輕柔震蕩培養。待形成愈傷組織塊后，將其接種至愈傷組織誘導培養基上，在光照強度36 μmol·m^-2·s^-1，光周期16 h/ 8 h（光/暗）下培養4周，將綠色致密的愈傷組織接種在不定芽誘導培養基上培養，誘導不定芽發生和生長。

取二倍體組培苗葉片與再生不定芽葉片各50mg，置于預冷的5ml塑料培養皿內，并分別加入解離染色液 500 μl。解離染色液包含PI 50 μg/ml、檸檬酸鈉 0.1%及Triton-X 100 0.3 μl/ml。于1min內以雙面刀片快速切割葉片成碎塊，并用200目濾網過濾，濾液置于流式細胞儀上樣管內。冰上孵化5min后，上機檢測，以二倍體細胞核為對照，檢測再生不定芽倍性。對7個再生不定芽進行倍性檢測，其中6個樣品倍性為三倍體，三倍體所占比率為85.7%。

實施例四

紅葉衛矛不定芽生根及芽休眠解除

選取粗壯的株高2-3cm的紅葉衛矛三倍體原生質體再生的不定芽，接種于生根培養基Ⅰ上，誘導根原基。2周后轉接至生根培養基Ⅱ上，進行根系生長。紅葉衛矛的生根組培苗普遍出現芽休眠現象，移栽煉苗成活率低。將生根苗接種于含3.0 mg/L GA3及1.0 mg/L 6-BA的生根培養基Ⅱ上，置于5℃下暗處理30d后，移至25℃下光照培養。芽休眠破除率可達90%以上。