專利名稱：一種提高低再生力小麥基因型幼胚組織培養再生率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高低再生力小麥基因型幼胚組織培養再生率的方法。
背景技術：
小麥組織離體培養高頻率植株再生是開展小麥細胞工程育種和轉基因育種的重要環節之一。目前為止，培養小麥幼胚、幼穗、花藥、成熟胚、小孢子等外植體材料先后獲得了再生植株，其中，小麥幼胚被認為是再生率最高的外植體類型。但是，小麥幼胚培養在不同基因型之間存在顯著差異，能夠高頻率獲得再生植株的基因型非常有限，尤其是一些大面積推廣的優良小麥品種，其幼胚的再生能力往往都很低。大面積推廣優良小麥品種的適應性、豐產性和抗病性等已滿足生態條件和生產發展的需要，改良它們的個別缺點后即可在生產上較長時間種植，因而是細胞工程育種和轉基因育種的首選起始材料。研究表明，改良培養基(如SD2培養基)和培養程序(如生長素間歇處理)等技術策略可以提高具有中等以上培養力小麥品種幼胚的再生率，但對弱再生力小麥品種幼胚培養的效果不顯著。因此，研究用于提高弱再生力小麥品種幼胚組織培養再生率的培養方法具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種提高低再生力小麥幼胚組織培養再生率的方法。本發明所提供的提高低再生力小麥幼胚組織培養再生率的方法，通過對高、低再生力小麥品種幼胚間隔接種進行愈傷組織誘導培養和對小麥愈傷組織間隔接種進行分化培養這兩個步驟來提高低再生力小麥幼胚組織培養的再生率，所述方法包括如下步驟I)將高再生力小麥品種的幼胚和低再生力小麥品種的幼胚按行間隔接種于裝有愈傷組織誘導培養基的同一個容器中，在黑暗條件下進行誘導培養，得到高再生力小麥品種愈傷組織和低再生力小麥品種愈傷組織；2)將步驟I)得到的低再生力小麥品種愈傷組織和高再生力小麥品種愈傷組織按行間隔轉移到裝有分化培養基的同一個培養容器中，即仍然保持步驟I)的間隔接種方式， 在光照條件下進行分化培養，得到低再生力小麥品種再生植株和高再生力小麥品種再生植株。該方法對低再生力小麥幼胚組織培養的再生率高于對所述低再生力小麥幼胚進行單獨組織培養的再生率。對所述低再生力小麥幼胚進行單獨組織培養的方法除了接種方式是單獨接種(裝有愈傷組織誘導培養基的培養容器內只接種所述低再生力小麥幼胚，并且裝有分化培養基的培養容器內只接種所述低再生力小麥品種胚性愈傷組織)外，其它培養條件均與本發明的方法相同。所述高再生力小麥品種具體可為新春9號或科農199，所述低再生力小麥品種具體可為中國春。本發明的上述方法中，所述步驟I)和2)的同一個培養容器中，接種所述高再生力小麥品種的幼胚或愈傷組織的行數和接種所述低再生力小麥品種的幼胚或愈傷組織的行數最好相同，如同一個培養容器中，所述高再生力小麥品種和所述低再生力小麥品種的行數均為3行，其按行間隔接種方式可為第1、3和5行接種所述低再生力小麥品種，第2、4和 6行接種所述高再生力小麥品種(圖I)。本發明的上述方法中，所述步驟I)的同一個培養容器中，接種的所述高再生力小麥品種的幼胚的個數具體可為所述低再生力小麥品種的幼胚的個數的1-1. 14倍。在本發明的一個實施例中，所述高再生力小麥品種為新春9號，所述低再生力小麥品種為中國春，接種的新春9號的幼胚個數是中國春幼胚個數的1-1. 01倍；在本發明的另一個實施例中，所述聞再生力小麥品種為科農199,所述低再生力小麥品種為中國春，接種的科農 199的幼胚個數是中國春幼胚個數的I. 13-1. 14倍；所述步驟2)的同一個培養容器中， 接種的所述高再生力小麥品種的愈傷組織的個數是所述低再生力小麥品種的愈傷組織的個數的O. 85-1. 21倍。在本發明的一個實施例中，所述高再生力小麥品種為新春9號，所述低再生力小麥品種為中國春，接種的新春9號的愈傷組織個數是中國春愈傷組織個數的O. 85-1. 10倍；在本發明的另一個實施例中，所述高再生力小麥品種為科農199，所述低再生力小麥品種為中國春，接種的科農199的愈傷組織個數是中國春愈傷組織個數的
I.12-1. 21 倍。本發明的上述方法中，所述步驟I)中的按行間隔接種的行距(相鄰兩行中心線的垂直距離)可為O. 9-1. lcm，幼胚距(樣距)(每行中相鄰兩個幼胚中心之間的距離) 可為O. 5-0. 7cm;所述步驟2)中的按行間隔接種的行距(相鄰兩行中心線的垂直距離) 可為O. 9-1. Icm,愈傷組織距(樣距)(每行中相鄰兩個愈傷組織中心之間的距離)可為 O. 5-0. 7cm。本發明的上述方法中，所述步驟I)中的愈傷組織誘導培養基具體可為SD2培養基，所述步驟2)中的分化培養基具體可為FHCK培養基。其中，SD2培養基的組成為 NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2 · 2H20 440mg/L、MgSO4 · 7H20370mg/L、KH2P041700mg/ L、KIO. 83mg/L、H3B036 . 2mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H208. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、CoCl2 · 6H200. 025mg/L, FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、 Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L、蔗糖 30g/L、維生素 BJOmg/L、谷氨酰胺 150mg/L、2，4-D2. Omg/ L、植物凝膠 2. 4g/L，pH 值為 6. 0。FHCK 培養基的組成為NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、 CaCl2 · 2H20440mg/L、MgSO4 · 7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KIO. 83mg/L、H3B036. 2mg/L、 MnSO4 · 4H2022. 3mg/L、ZnSO4 · 7H208. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/ UCoCl2 · 6H200. 025mg/L, FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L、維生素 BJmg/L、 維生素B6O. 5mg/L、煙酸0. 5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、鹿糖20g/L、植物凝膠2. 4g/ L，pH 值為 6.0。本發明的上述方法中，所述高再生力小麥品種的幼胚和低再生力小麥品種的幼胚均可為開花授粉后12-14天、大小I. 0-1. 2mm的幼胚。本發明的上述方法中，所述步驟I)中的誘導培養溫度為24°C -26°C、時間為20_25 天；所述步驟2)中的光照條件為每天以3500LX的光強光照10小時，所述分化培養的溫度為 24°C -26°C、時間為 20-25 天。現有的小麥組織培養程序中，將來源同一小麥品種的相同外植體材料接種在一個培養器皿中培養，先后誘導愈傷組織和分化植株，本發明的小麥組織培養方法，將來源高、
4低再生力的2個小麥品種的幼胚按行間隔接種在同一個培養器皿中培養，依次誘導愈傷組織和分化植株，顯著提高了低再生小麥品種的再生率、胚性愈傷組織誘導率和愈傷組織分化率。實驗證明，將小麥中國春(低再生力小麥品種)幼胚和小麥新春9號(高再生力小麥品種)幼胚按照本發明的的方法進行培養，小麥中國春再生率為18. 59%，小麥新春9號的再生率為49. 82%，單獨培養的小麥中國春再生率為O. 37%，小麥新春9號的再生率為 41. 61 % (表I);將小麥中國春(低再生力小麥品種)幼胚和小麥科農199 (高再生力小麥品種)幼胚按照本發明的的方法進行培養，小麥中國春再生率為67. 98%，小麥科農199 的再生率為251. 94%，單獨培養的小麥中國春再生率為3. 03%，小麥科農199的再生率為 176. 82% (表 2)。本發明通過改進小麥幼胚接種培養方法，顯著提高了弱再生力小麥基因型的再生頻率、胚性愈傷組織誘導率和愈傷組織分化率，對于利用細胞工程技術和基因工程技術改良大面積推廣小麥品種的個別缺點具有重要意義。


圖I為高再生力小麥品種幼胚、低再生力小麥品種幼胚間隔培養方式圖示圖2為小麥中國春幼胚與新春9號幼胚單獨培養及間隔培養再生植株效果A為小麥中國春幼胚單獨培養-對照培養方法B為小麥新春9號幼胚單獨培養-對照培養方法C為小麥中國春幼胚與新春9號幼胚間隔培養——本發明培養方法圖3為小麥中國春幼胚與科農199幼胚單獨培養及間隔培養再生植株效果A為小麥中國春幼胚單獨培養-對照培養方法B為科農199幼胚單獨培養——對照培養方法C為小麥中國春幼胚與科農199幼胚間隔培養--本發明培養方法
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例I和2中所用的小麥如下小麥品種中國春(石珍源等，中國農業科學，2011,44(2) :225_232)(中國農業科學院作物科學研究所)；小麥品種科農199(石珍源等，中國農業科學，2011,44(2) :225-232)(中國農業科學院作物科學研究所)；小麥品種新春9號(丁文靜等，作物學報，2007，33 (6) =955-960)(中國農業科學院作物科學研究所)。下述實施例I和2中所用的SD2培養基和FHCK培養基如下SD2 培養基組成為:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2 · 2H20 440mg/L、 MgSO4 · 7H20370mg/L、KH2P041700mg/L、KIO. 83mg/L、H3B036. 2mg/L、MnSO4 · 4H2022. 3mg/L、ZnSO4 · 7H208. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H200. 025mg/ L，FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L、蔗糖 30g/L、維生素 BJOmg/L、谷氨酰胺 150mg/L、2，4-D2. Omg/L、Phytagel (植物凝膠)2. 4g/L，pH 值為 6. 0。以上成分采用 121。。 高壓濕熱滅菌20分鐘。FHCK 培養基組成為:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2 · 2H20440mg/L、 MgSO4 · 7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KIO. 83mg/L、H3B036 . 2mg/L、MnSO4 · 4H2022. 3mg/L、 ZnSO4 · 7H208. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H200. 025mg/ L, FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L、維生素 BJmg/L、維生素 B6O. 5mg/L、煙酸 0. 5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、Phytagel (植物凝膠)2. 4g/L, pH 值為
6.0。以上成分采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘。下述實施例I和2中所用的培養皿均相同，直徑為9. Ocm0下述實施例I和2中的胚性愈傷組織誘導率、愈傷組織分化率、綠苗獲得率(再生率)的計算公式如下胚性愈傷組織誘導率(％ )=(胚性愈傷組織數+接種幼胚數)X 100 ;愈傷組織分化率(％ )=(分化愈傷組織數+接種幼胚數)X 100 ;綠苗獲得率(％ )=(分化綠苗數+接種幼胚數)X 100。實施例I、利用小麥新春9號提高小麥中國春的幼胚組織培養再生率本實施例以小麥中國春(低再生力小麥品種)、小麥新春9號(高再生力小麥品種)為實驗對象闡明本發明所保護的提高低再生力小麥幼胚組織培養再生率的方法，具體如下I、小麥幼胚的獲得將小麥中國春和小麥新春9號種植在中國農業科學院作物科學研究所實驗農場 (4-5月份小麥生長期間溫度15-30°C )，開花授粉后12-14天，收集小麥中國春和小麥新春 9號的幼胚(心形期,大小為I. 0-1. 2mm)。2、組織培養I)誘導培養產生愈傷組織將上述二種小麥幼胚按行間隔接種在SD2培養基上培養(稱為間隔培養)，以二種小麥幼胚分別單獨接種在SD2培養基上培養作為對照。上述培養條件均為25°C、黑暗條件下培養20天得到愈傷組織。其中，上述二種小麥幼胚按行間隔接種在SD2培養基上的方法如下將小麥中國春幼胚和小麥新春9號幼胚按行間隔接種于同一個培養皿中，每個培養皿中小麥中國春幼胚和小麥新春9號幼胚各接種三行，第1、3和5行接種小麥中國春幼胚，第2、4和6行接種小麥新春9號幼胚。行距(相鄰兩行中心線的垂直距離)為0.9-1. lcm，樣距(或胚距) (每行中相鄰兩個幼胚中心之間的距離)為0. 5-0. 7cm。小麥中國春幼胚和小麥新春9號幼胚按行間隔接種10個培養皿中，總共接種了 271個小麥新春9號幼胚和269個小麥中國春幼胚。其中，第I-第8個培養皿中,每個培養皿中小麥新春9號幼胚共27個,小麥中國春幼胚共27個,小麥新春9號幼胚的個數是小麥中國春幼胚的I倍；第9個培養皿中，小麥新春9號幼胚共28個，小麥中國春幼胚27個，小麥新春9號幼胚的個數是小麥中國春幼胚的I. 01倍；第10個培養皿中，小麥新春9號幼胚共27個，小麥中國春幼胚26個，小麥新春9號幼胚的個數是小麥中國春幼胚的I. 01倍。該間隔培養共得到262個小麥新春9號愈傷組織和248個中國春愈傷組織。小麥中國春幼胚單獨接種在SD2培養基上的方法如下在一個培養皿中只按行接種小麥中國春幼胚，樣距(或胚距)與行距與上述間隔培養相同。小麥中國春幼胚共接種5 個培養皿，總共接種了 267個小麥中國春幼胚。該小麥中國春幼胚單獨培養共得到260個愈傷組織。小麥新春9號幼胚單獨接種在SD2培養基上的方法如下在一個培養皿中只按行接種小麥新春9號幼胚，樣距(或胚距)與行距與上述間隔培養相同。小麥新春9號幼胚共接種5個培養皿，總共接種了 274個小麥新春9號幼胚。該小麥新春9號幼胚單獨培養共得到259個愈傷組織。2)分化培養得到小麥再生植株將步驟I)間隔培養產生的262個小麥新春9號愈傷組織和248個小麥中國春愈傷組織按行間隔轉移到裝有FHCK培養基的10個培養皿中，每個培養皿中小麥中國春愈傷組織和小麥新春9號愈傷組織各接種三行，第1、3和5行接種小麥中國春愈傷組織，第2、4 和6行接種小麥新春9號愈傷組織(圖2中C)。行距(相鄰兩行中心線的垂直距離)為 O. 9-1. 1cm，樣距(每行中相鄰兩個愈傷組織中心之間的距離)為O. 5-0. 7cm。其中，第I-第 8個培養皿中，每個培養皿中小麥新春9號愈傷組織共27個，小麥中國春愈傷組織共25個， 小麥新春9號愈傷組織的個數是小麥中國春愈傷組織的I. 08倍；第9個培養皿中，小麥新春9號愈傷組織共23個，小麥中國春愈傷組織27個，小麥新春9號愈傷組織的個數是小麥中國春愈傷組織的O. 85倍；第10個培養皿中，小麥新春9號愈傷組織共23個，小麥中國春愈傷組織21個,小麥新春9號愈傷組織的個數是小麥中國春愈傷組織的I. 10倍。同時，將步驟I)小麥中國春幼胚單獨接種培養產生的260個愈傷組織轉移到裝有 FHCK培養基的5個培養皿中，樣距與行距與上述間隔培養相同(圖2中A);將步驟I)小麥新春9號幼胚單獨接種培養產生的259個愈傷組織轉移到裝有FHCK培養基的5個培養皿中，樣距與行距與上述間隔培養相同(圖2中B)。將這些愈傷組織均在如下條件下培養20天，分化得到小麥再生植株每天以 3500Lx的光強光照10小時，分化培養的溫度為25°C。結果表明步驟I)間隔培養產生的 262個小麥新春9號愈傷組織中有121個是胚性愈傷組織，其中有92個胚性愈傷組織發生分化，共得到135個小麥再生苗；步驟I)間隔培養產生的248個小麥中國春愈傷組織中有 52個是胚性愈傷組織，其中有29個胚性愈傷組織發生分化，共得到50個小麥再生苗；步驟 I)小麥中國春幼胚單獨接種培養產生的260個愈傷組織中有I是個胚性愈傷組織，分化出 I個再生苗；步驟I)小麥新春9號幼胚單獨接種培養產生的259個愈傷組織中有90個是胚性愈傷組織，其中有72個胚性愈傷組織發生分化，共得到114個小麥再生苗。整個實驗結果如表I。小麥中國春幼胚和小麥新春9號幼胚間隔培養情況下，小麥中國春再生率為18. 59%，小麥新春9號的再生率為49. 82% ;小麥中國春幼胚和小麥新春 9號幼胚單獨培養情況下，小麥中國春再生率為O. 37%，小麥新春9號的再生率為41.61%。表I.小麥新春9號和中國春幼胚單獨接種及間隔接種組織培養情況
權利要求
1.一種提高低再生力小麥幼胚組織培養再生率的方法，其特征在于所述方法通過對高、低再生力小麥品種幼胚間隔接種進行愈傷組織誘導培養和對小麥愈傷組織間隔接種進行分化培養這兩個步驟來提高低再生力小麥幼胚組織培養的再生率，所述方法包括如下步驟.1)將高再生力小麥品種的幼胚和低再生力小麥品種的幼胚按行間隔接種于裝有愈傷組織誘導培養基的同一個容器中，在黑暗條件下進行誘導培養，得到高再生力小麥品種愈傷組織和低再生力小麥品種愈傷組織；.2)將步驟I)得到的低再生力小麥品種愈傷組織和高再生力小麥品種愈傷組織按行間隔轉移到裝有分化培養基的同一個培養容器中，在光照條件下進行分化培養，得到低再生力小麥品種再生植株和高再生力小麥品種再生植株。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述高再生力小麥品種為新春9號或科農199,所述低再生力小麥品種為中國春。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)的同一個培養容器中，接種所述高再生力小麥品種的幼胚的行數和接種所述低再生力小麥品種的幼胚的行數相同；所述步驟2)的同一個培養容器中，接種所述高再生力小麥品種愈傷組織的行數和接種所述低再生力小麥品種愈傷組織的行數相同。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟I)的同一個培養容器中，接種的所述高再生力小麥品種的幼胚的個數是所述低再生力小麥品種的幼胚的個數的1-1. 14 倍；所述步驟2)的同一個培養容器中，接種的所述高再生力小麥品種的愈傷組織的個數是所述低再生力小麥品種的愈傷組織的個數的O. 85-1. 21倍。
5.根據權利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟I)和2)中的按行間隔接種的行距均是O. 9-1. 1cm，每行中相鄰兩個幼胚或愈傷組織中心之間的距離均是.O.5-0. 7cm。
全文摘要
本發明公開了一種提高低再生力小麥基因型幼胚組織培養再生率的方法。該方法包括如下步驟1)將高再生力小麥品種的幼胚和低再生力小麥品種的幼胚按行間隔接種于裝有愈傷組織誘導培養基的同一個容器中，在黑暗條件下進行誘導培養，得到高再生力小麥品種愈傷組織和低再生力小麥品種愈傷組織；2)將步驟1)得到的低再生力小麥品種愈傷組織和高再生力小麥品種愈傷組織按行間隔轉移到裝有分化培養基的同一個培養容器中，在光照條件下進行分化培養，得到低再生力小麥品種再生植株和高再生力小麥品種再生植株。該方法顯著提高了低再生小麥品種幼胚培養的植株再生率、胚性愈傷組織誘導率和愈傷組織分化率。
文檔編號A01H4/00GK102599059SQ201210085450
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者葉興國, 周曉鴻, 張偉, 徐惠君, 李欣, 杜麗璞, 林志珊, 殷桂香, 王新敏, 王軻, 肖樂樂 申請人:中國農業科學院作物科學研究所