本發(fā)明屬于作物種質(zhì)資源學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于大豆遺傳完整性分析的繁殖更新方法。

背景技術(shù)：

大豆(Glycine max(L.)Merr.)屬于豆科(Leguminosae)，蝶形花亞科(Papilionatae)，大豆屬(Glycine)，Soja亞屬，在我國人民日常生活和國民經(jīng)濟體系中具有舉足輕重的地位，是人類重要的營養(yǎng)和保健食品。大豆籽粒的蛋白質(zhì)含量為40％左右，約為其他植物的1～6倍，除蛋氨酸和胱氨酸含量較低外，其他人體必需的氨基酸含量都較高。因此，大豆蛋白對谷物蛋白有較好的增補效果，是僅次于動物蛋白的理想食品。大豆種質(zhì)資源是大豆新品種選育和生物技術(shù)研究的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是大豆生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的基本保證。我國是世界保存大豆種質(zhì)資源數(shù)量最多的國家，約35000余份，這些材料是我國大豆遺傳研究和作物育種的寶貴財富。

遺傳完整性(genetic integrity)是指群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率分布和等位基因頻率分布和其原始群體一樣，保持不變。維持種質(zhì)遺傳完整性就是種質(zhì)在貯藏及繁殖更新過程中保持子代與親代具有最大程度的遺傳相似性，這是種質(zhì)保存工作的核心。影響種質(zhì)遺傳完整性的因素甚多，其中與繁殖更新相關(guān)的因素較多，例如，繁殖地點、繁殖群體量、授粉和收獲方式等。因此，必須對作物的繁殖更新技術(shù)方法加以規(guī)范，以確保最大程度地維持其遺傳完整性。

目前，國內(nèi)外對于大豆種質(zhì)遺傳完整性研究報道較少，且其繁殖更新的程序方法也不規(guī)范。大豆種質(zhì)在繁殖更新時因其生活力下降、繁殖地點、繁殖群體量、授粉和收獲方式等不同，而使其遺傳完整性喪失。因此，針對大豆在繁殖更新時容易發(fā)生遺傳完整性變化的實際情況，制定出一套科學(xué)合理的用于大豆種質(zhì)遺傳完整性分析時的繁殖更新方法已迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于大豆遺傳完整性分析的繁殖更新方法，該方法完整可行且系統(tǒng)規(guī)范，可應(yīng)用此方法對庫存的高生活力大豆進行繁殖更新以維持其遺傳完整性。

為此，本發(fā)明提供一種用于大豆遺傳完整性分析的繁殖更新方法，包括親代繁殖更新和子代繁殖更新。

所述親代繁殖更新：將親代種子經(jīng)過人工老化處理后進行生活力檢測，按照發(fā)芽率分組，選取不同發(fā)芽率梯度的親代處理；各處理種子先進行育苗，然后移栽至大田中；單株收獲。

所述子代繁殖更新：將各個子代處理，按照與親代處理同樣的步驟進行育苗、移栽、形態(tài)性狀調(diào)查、單株收獲。

所述子代單株與其親代是一一對應(yīng)關(guān)系，即子代的各個處理每個單株的編號與其親代單株是一一對應(yīng)的。

親代和子代繁殖更新期間，進行形態(tài)標記分析及SSR分子標記分析以檢測其遺傳完整性。形態(tài)標記分析時，從親代和子代的每個處理中按照編號選出30個單株，對其進行11個形態(tài)性狀調(diào)查。進行性狀調(diào)查的30個單株，親代與子代的編號一一對應(yīng)。同樣，進行SSR標記分析時親代及子代均取96個單株(包括形態(tài)性狀調(diào)查的30個單株)，子代采集葉片的單株與其親代編號也是一一對應(yīng)關(guān)系。

具體地，本發(fā)明用于大豆遺傳完整性分析的繁殖更新方法，步驟如下：

(一)親代繁殖更新

1、繁殖地點選擇：

選擇種質(zhì)原產(chǎn)地或與原產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境條件相似地區(qū)的地勢平坦、地力均勻、形狀規(guī)則、排灌方便且最少兩年未種植大豆的田塊；

2、種子老化及生活力檢測

(1)種子人工老化：將播種、收獲整齊度一致的同一份材料的大豆種子，放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件為45％RH，25℃，15天，使處理種子的含水量處于7.4％±0.1％；然后用鋁箔袋真空密封分裝，平均分成若干份，放置于人工老化箱內(nèi)40℃恒溫老化；放置順序采用倒序法，即人工老化時間最長的處理先放入進行老化，人工老化時間最短的最后放入進行老化，試驗結(jié)束時一起取出；人工老化結(jié)束后在25℃下，將所有處理密封平衡2天。以未經(jīng)過人工老化的處理為對照。

(2)生活力檢測：參考農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.4中的標準條件，將對照與經(jīng)過不同老化時間的處理進行發(fā)芽試驗，并統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

3、育苗及移栽：

按照遺傳完整性分析的試驗要求，選取包括對照在內(nèi)的4～5個適合的發(fā)芽率梯度的大豆及野生大豆親代處理進行育苗。

(1)制備育苗培養(yǎng)基質(zhì)：將砂壤土、草炭土、蛭石和珍珠巖按照體積比為4：3：2：1比例混合，向混合基質(zhì)中加入多菌靈，比例為每kg基質(zhì)加入1g多菌靈；加入復(fù)合肥(N：P₂O₅：K₂O＝15：15：15)，比例為每kg基質(zhì)加入5g復(fù)合肥，加水攪拌混勻后，制得育苗培養(yǎng)基質(zhì)。

(2)播種定盤：即將種子播種于育苗盤的過程。

(3)溫室育苗：將步驟(2)中的育苗盤放入溫室中，其上覆蓋地膜保濕，溫度控制在24.5～25.5℃，相對濕度為74.5～75.5％，種子出苗后將地膜掀掉。待幼苗長至三葉期后即可進行移栽。

(4)移栽大田：畝施農(nóng)家肥1000～2000kg，磷酸二銨15kg。大豆每個處理田間定植200株，行距為50cm，株距為30cm，挖移栽穴，深10cm，將育苗盤中的幼苗移栽到大田中，及時填土澆水。

4、田間管理

(1)掛牌編號：待幼苗長至50cm高時，將定植于大田中每個處理的植株進行單株掛牌編號。

(2)栽培措施：常規(guī)管理即可。

5、形態(tài)性狀調(diào)查及去雜

繁殖更新期間，從每個處理中按照編號選出30個單株，對其進行11個形態(tài)性狀調(diào)查，這些性狀包括：花色、粒色、粒形、臍色、茸毛色、莢色、結(jié)莢習(xí)性、株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)。并除去雜株。

6、收獲、脫粒、干燥和保存

每個處理按照編號進行單株收獲，脫粒，干燥至種子含水量8.0％以下，清選后保存。

(二)子代繁殖更新

1、繁殖地點選擇：將大豆不同生活力的親代各個處理繁殖更新所收獲的種子次年原地進行繁殖更新。子代處理的繁殖的試驗地及配套條件與其親代一致。

2、生活力檢測：子代處理繁殖更新時不需要經(jīng)過種子老化。參考農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.4中的標準條件，將各個子代處理進行發(fā)芽試驗，并統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

3、育苗及移栽：為保證與親代各個處理的生長環(huán)境條件及種植密度一致，對子代處理進行育苗及移栽。培養(yǎng)基質(zhì)、播種定盤、溫室育苗和移栽大田過程與親代一致。子代各個處理在育苗時，每格播種的種子是其親代處理每個單株收獲的種子，即育苗時每格長出的幼苗編號與其親代單株是一一對應(yīng)關(guān)系。每格播種2粒種子以保證成苗率。移栽時每格優(yōu)選健壯的幼苗進行移栽。

4、田間管理：子代各個處理田間管理過程與其親代一致。

5、形態(tài)性狀調(diào)查及去雜：子代各個處理調(diào)查的形態(tài)性狀與親代完全一致。子代各個處理調(diào)查的每個單株與其親代的每個單株也是一一對應(yīng)關(guān)系，同樣也是調(diào)查30個單株。去雜過程與親代一致。

6、收獲、脫粒、干燥和保存：子代處理的收獲、脫粒、干燥和保存等程序與其親代一致。

本發(fā)明提出了一整套完整可行且系統(tǒng)規(guī)范的用于大豆遺傳完整性分析時的繁殖更新方法，特別是提出將不同生活力的親代處理進行育苗移栽，對親代處理的單株進行編號，并進行單株形態(tài)性狀調(diào)查與收獲，子代繁殖更新及形態(tài)性狀調(diào)查時與其親代處理是一一對應(yīng)關(guān)系等技術(shù)創(chuàng)新。綜合采用形態(tài)標記與SSR分子標記相結(jié)合的分析方法對提出的繁殖更新方法與常規(guī)的繁殖更新方法進行了遺傳完整性對比分析，從而進一步驗證了本發(fā)明提出的繁殖更新方法的可靠性和準確性。

本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)點及有益效果如下：

1、本發(fā)明提出的繁殖更新方法重點之一在于繁殖更新時子代單株與其親代單株的一一對應(yīng)關(guān)系，即子代育苗時的各個處理每個單株的編號與其親代單株是一一對應(yīng)的；進行形態(tài)性狀調(diào)查時，子代各個處理調(diào)查的單株與其親代單株也是一一對應(yīng)關(guān)系，其目的是為了在進行大豆及野生大豆遺傳完整性分析時明確子代與其親代的遺傳對應(yīng)關(guān)系，使得出的試驗數(shù)據(jù)具有更高的可靠性和準確性，得出的試驗結(jié)論具有更強的說服力。

2、將不同生活力的親代處理進行育苗移栽：由于大豆種子經(jīng)過人工老化后，其種子活力較差，若是直播種子，田間出苗率很低，不能保證每個處理的種植密度一致，因此本發(fā)明采用先育苗，然后移栽的方法，每個處理定植200株，以保證種植密度一致，使得形態(tài)性狀調(diào)查數(shù)據(jù)可靠準確，避免了因種植密度不一致而造成形態(tài)性狀調(diào)查數(shù)據(jù)失真。

附圖說明

圖1為本發(fā)明大豆親代繁殖更新與子代繁殖更新時單株的一一對應(yīng)關(guān)系示意圖。

其中A表示進行人工老化；B表示田間繁殖過程(子代單株與親代單株是一一對應(yīng)關(guān)系)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體試驗方法和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進行進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例一應(yīng)用本發(fā)明方法和常規(guī)方法對大豆進行繁殖更新并進行遺傳完整性分析

(一)試驗材料：以大豆地方品種大黃豆種子為試驗材料。

(二)試驗方法：

1、方法一：利用本發(fā)明提供的方法對大豆地方品種大黃豆進行繁殖更新。步驟如下：

(1)大黃豆親代處理繁殖更新

①繁殖地點選擇：

a、繁殖地區(qū)：選擇種質(zhì)原產(chǎn)地。由于地方品種大黃豆原產(chǎn)地是山東省濟寧市梁山縣，因此在當?shù)卣业揭晦r(nóng)戶，租賃其土地進行繁殖更新，能夠滿足繁殖更新材料的生長發(fā)育及其性狀的表達。

b、試驗地：地勢平坦、地力均勻、形狀規(guī)則、排灌方便且兩年內(nèi)未種植大豆；遠離污染源、無人畜侵擾、附近無高大建筑；避開了病蟲害多發(fā)區(qū)、重發(fā)區(qū)和檢疫對象發(fā)生區(qū)。試驗地塊為每個小區(qū)寬1.5m，長30m，一個小區(qū)內(nèi)進行一個處理的繁殖更新。

c、配套條件：具備了育苗、收獲、晾曬、貯藏等試驗條件和設(shè)施。

②種子老化及生活力檢測

a、種子人工老化：將播種、收獲整齊度一致的大豆地方品種大黃豆親代種子10000粒，放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件為45％RH，25℃，15天，使處理種子的含水量處于7.4％±0.1％；然后用鋁箔袋真空密封分裝，平均分成若干份，每份1000粒，放置于人工老化箱內(nèi)40℃恒溫老化；放置順序采用倒序法，即人工老化時間最長的處理先放入進行老化，人工老化時間最短的最后放入進行老化，試驗結(jié)束時一起取出；人工老化結(jié)束后在25℃下，將所有處理密封平衡2天。以未經(jīng)過人工老化的處理為對照。

b、生活力檢測：參考農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.4中的標準條件，將對照與經(jīng)過不同老化時間的處理進行發(fā)芽試驗，并統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(表1)。

③育苗及移栽：

按照遺傳完整性分析的試驗要求，選取包括對照在內(nèi)的4個適合的發(fā)芽率梯度的親代處理，即處理G_P-CK₁、G_P-I₁、G_P-II₁和G_P-III₁進行育苗。由于大豆種子經(jīng)過人工老化后，其種子活力較差，若是直播種子，田間出苗率很低，不能保證每個處理的種植密度一致，因此需要預(yù)先進行育苗，然后移栽到大田中，每個處理定植200株，以保證種植密度一致，使得形態(tài)性狀調(diào)查數(shù)據(jù)可靠準確，否則會因種植密度不一致而造成形態(tài)性狀調(diào)查數(shù)據(jù)失真。育苗步驟如下：

a、制備育苗培養(yǎng)基質(zhì)：將砂壤土、草炭土、蛭石和珍珠巖按照體積比為4：3：2：1比例混合，向混合基質(zhì)中加入多菌靈，比例為每kg基質(zhì)加入1g多菌靈；加入史丹利復(fù)合肥(N：P₂O₅：K₂O＝15：15：15)，比例為每kg基質(zhì)加入5g史丹利復(fù)合肥，加水混合后攪拌混勻后，制得育苗培養(yǎng)基質(zhì)。

b、播種定盤：即將種子播種于育苗盤的過程。利用5×10格育苗盤育苗，將步驟a制備的培養(yǎng)基質(zhì)填充于育苗盤中，填實抹平后，用噴壺均勻灑水，1～2小時后，用圓頭小木棍或鑷子等器具在每個育苗盤格子上打孔，直徑1cm，深度2cm。將不同生活力處理的大豆親代種子播種于小孔中。發(fā)芽率在80％以上的處理，每格播種1粒；發(fā)芽率在50～80％的處理，每格播種2粒；發(fā)芽率在30～50％的處理，每格播種3粒；發(fā)芽率在30％以下的處理，每格播種4粒。播種后用培養(yǎng)基質(zhì)覆蓋壓實，再次灑水澆透即可。共育苗4盤。

c、溫室育苗：將步驟b中的育苗盤放入溫室中，其上覆蓋地膜保濕，溫度控制在24.5～25.5℃，相對濕度為74.5～75.5％，待種子出苗后將地膜掀掉。帶幼苗長至三葉期后即可進行移栽。

d、移栽大田：幼苗移栽前，需造墑，精細整地，重施底肥，一般畝施農(nóng)家肥1000～2000kg，磷酸二銨15kg。大豆每個處理田間定植200株。行距為50cm，株距為30cm，挖移栽穴，深10cm，將育苗盤中的幼苗移栽到大田中，及時填土澆水。移栽最好在下午進行，提高幼苗成活率。

④田間管理

a、掛牌編號：待幼苗長至50cm高時，將定植于大田中每個處理的植株進行單株掛牌編號。

b、栽培措施：封壟前及時進行中耕除草、培土；加強花莢期管理，爭取多花多莢，防花莢脫落，花莢期施肥可根據(jù)長勢酌情處理，如長勢弱，花期可適當追肥，壯苗不追肥防止徒長，花莢期和鼓粒期可要適當澆水，防止受旱，以免影響百粒重及產(chǎn)量。需要注意地是每個處理的澆水施肥量必須相同，以免產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。適時除草，適期防病，科學(xué)治蟲。播后芽前進行土壤封閉除草；盛花至結(jié)莢鼓粒期造橋蟲、大豆卷葉螟等害蟲容易發(fā)生，如田間有低齡幼蟲啃食的網(wǎng)狀和鋸齒狀葉片出現(xiàn)，要及時用藥物防治。

⑤形態(tài)性狀調(diào)查及去雜

a、性狀調(diào)查：在地方品種大黃豆親代處理繁殖更新期間，從每個處理中按照編號選出30個單株，對其進行11個形態(tài)性狀調(diào)查，這些性狀包括：花色、粒色、粒形、臍色、茸毛色、莢色、結(jié)莢習(xí)性、株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)。

b、去雜：在形態(tài)性狀調(diào)查期間，核對每個單株的生育期、花色、茸毛色、葉形、生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性和株高等主要性狀與主體類型明顯不一致的個體，當作雜株拔除。

⑥收獲、脫粒、干燥和保存

a、收獲：適時收獲。對每個處理按照編號進行單株收獲，每個單株的種子收獲后進行編號，以便繁殖其子代。

b、脫粒：每個處理每個單株收獲的種子在脫粒前，必須打掃干凈脫粒場地、機械、用具等，嚴防混雜；將每個單株的種子單粒脫，單袋裝；種子袋標簽編號須與每個處理的每個單株編號一致，袋內(nèi)外各附標簽，避免寫(掛)錯標簽。

c、干燥：脫粒裝袋后及時晾曬，防止發(fā)熱霉變。干燥至種子含水量8.0％以下，可停止干燥。

d、清選：去除破損粒、病蟲粒和泥沙等雜質(zhì)。

e、保存：將清選過的種子用鋁箔袋密封包裝后保存于-4℃中期庫內(nèi)。

(2)大黃豆子代處理繁殖更新

①繁殖地點選擇：將大豆地方品種大黃豆的親代各個處理繁殖更新所收獲的種子次年原地進行繁殖更新。子代處理的繁殖的試驗地及配套條件與其親代一致。

②生活力檢測：子代處理繁殖更新時不需要經(jīng)過種子老化。子代處理的繁殖更新程序與其親代大體一致，但不需要經(jīng)過種子老化。參考農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.4中的標準條件，將各個子代處理，即處理G_F1-CK₁、G_F1-I₁、G_F1-II₁和G_F1-III₁進行發(fā)芽試驗，并統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(表1)。

表1大豆地方品種大黃豆發(fā)芽數(shù)據(jù)統(tǒng)計(方法一)

③育苗及移栽：為保證與親代各個處理的生長環(huán)境條件及種植密度一致，對子代處理進行育苗及移栽。培養(yǎng)基質(zhì)、播種定盤、溫室育苗和移栽大田過程與親代一致。子代各個處理在育苗時，每格播種的種子是其親代處理每個單株收獲的種子，即育苗時每格長出的幼苗編號與其親代單株是一一對應(yīng)關(guān)系。每格播種2粒種子以保證成苗率。移栽時每格優(yōu)選健壯的幼苗進行移栽。

④田間管理：子代各個處理田間管理過程與其親代一致。

⑤形態(tài)性狀調(diào)查及去雜：子代各個處理調(diào)查的形態(tài)性狀與親代完全一致。子代各個處理調(diào)查的每個單株與其親代的每個單株也是一一對應(yīng)關(guān)系，同樣也是調(diào)查30個單株。去雜過程與親代一致。

⑥收獲、脫粒、干燥和保存：子代處理的收獲、脫粒、干燥和保存等程序與其親代一致。

本發(fā)明中，子代繁殖更新時單株與其親代是一一對應(yīng)關(guān)系，即子代育苗時的各個處理每個單株的編號與其親代單株是一一對應(yīng)的，進行形態(tài)性狀調(diào)查時，子代各個處理調(diào)查的單株與其親代單株也是一一對應(yīng)關(guān)系，其目的是為了在進行大豆地方品種大黃豆遺傳完整性分析時明確子代與其親代的遺傳對應(yīng)關(guān)系，使得出的試驗數(shù)據(jù)具有更高的可靠性和準確性，得出的試驗結(jié)論具有更強的說服力。親代與子代各個處理關(guān)系如圖1所示。

2、方法二：利用常規(guī)方法對大豆地方品種大黃豆進行繁殖更新。步驟如下：

(1)大黃豆親代處理繁殖更新

①繁殖地點選擇：為保證對比試驗的準確性和可靠性，繁殖地區(qū)、試驗地和配套條件與方法一相同。

②種子老化及生活力檢測：種子人工老化的材料、程序、方法與方法一相同，即同一批親代處理種子。生活力檢測的數(shù)據(jù)，包括發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與方法一相同(表2)。

③播種：常規(guī)繁殖更新方法中沒有育苗及移栽的步驟，而是將親代處理種子直播。根據(jù)遺傳完整性分析的試驗要求，選取包括對照在內(nèi)的4個適合的發(fā)芽率梯度的大豆，即處理G_P-CK₂、G_P-I₂、G_P-II₂和G_P-III₂進行直播。試驗地塊大小與方法一相同。每個小區(qū)根據(jù)發(fā)芽率播種，保證定苗200株。

④田間管理：播種前造墑，精細整地，重施底肥，一般畝施農(nóng)家肥1000～2000kg，磷酸二銨15kg。出苗前后進行查苗，補苗，及時補種，但由于經(jīng)過人工老化后，其活力較低，補苗后仍然出苗較差，因此不能保證種植密度一致。其余栽培措施與方法一相同。需要注意地是每個處理的澆水施肥量必須相同，以免產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。與方法一最大不同就是對單株不進行編號。

⑤形態(tài)性狀調(diào)查及去雜：在地方品種大黃豆親代處理繁殖更新期間，從每個處理中隨機選出30個單株，對其進行11個形態(tài)性狀調(diào)查，這些性狀包括：花色、粒色、粒形、臍色、茸毛色、莢色、結(jié)莢習(xí)性、株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)。

⑥收獲、脫粒、干燥和保存：收獲方式為按照處理進行混合收獲，即以處理為單位進行收獲，以便繁殖其子代。脫粒方式為以處理為單位進行混合脫粒，紗網(wǎng)袋裝，標簽編號與處理編號一致，袋內(nèi)外各附標簽。干燥和清選方式與方法一相同。用紗網(wǎng)袋盛裝后保存于-4℃中期庫內(nèi)。

(2)大黃豆子代處理繁殖更新

將親代各個處理繁殖更新所收獲的子代種子次年原地進行繁殖更新。子代處理的繁殖更新程序與其親代大體一致，但不需要經(jīng)過種子老化。參考農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.4中的標準條件，將各個子代處理，即處理G_F1-CK₂、G_F1-I₂、G_F1-II₂和G_F1-III₂進行發(fā)芽試驗，并統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(表2)。

表2大豆地方品種大黃豆發(fā)芽數(shù)據(jù)統(tǒng)計(方法二)

需要指出地是利用方法一與方法二進行繁殖更新的不同生活力親代處理是同一批材料，因此生活力檢測數(shù)據(jù)是一致的。

(3)利用形態(tài)標記對經(jīng)過兩種方法繁殖更新的地方品種大黃豆進行遺傳完整性分析

本發(fā)明所統(tǒng)計形態(tài)標記性狀如前所述共11個，包括：花色、粒色、粒形、臍色、茸毛色、莢色、結(jié)莢習(xí)性、株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)。按照方法一和方法二給出的程序進行形態(tài)性狀調(diào)查，方法一和方法二每個處理的樣本量均為30個單株；樣本量為30在統(tǒng)計學(xué)中算作大樣本，兩組采用同樣的樣本量，可以有效地消除系統(tǒng)誤差，使數(shù)據(jù)更加準確可靠。方法一是按照編號調(diào)查且親代處理與其子代處理調(diào)查的單株是一一對應(yīng)關(guān)系，方法二則是隨機調(diào)查，親代處理與其子代處理沒有一一對應(yīng)關(guān)系。

形態(tài)性狀多樣性的計算采用Shannon-Weaver信息指數(shù)，即H’＝-∑PilnPi，Pi為某性狀第i個代碼值出現(xiàn)的概率。質(zhì)量性狀如花色、粒色和粒形等予以賦值(表3)。將數(shù)量性狀如株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)進行10級分類，1級<X-2δ，10級≥X+2δ，中間每級間差0.5δ，X為平均值，δ為標準差。11個形態(tài)性狀數(shù)據(jù)按不同的變異類型分別轉(zhuǎn)換成AA、BB和CC等字母格式，利用生物統(tǒng)計軟件Popgene等計算不同形態(tài)性狀變異的Shannon-Weaver指數(shù)。然后利用SAS V9.1將兩種方法繁殖更新的各個親代處理的Shannon-Weaver指數(shù)與各自對照進行顯著性t檢驗(表4)。

表3大豆地方品種大黃豆形態(tài)性狀鑒定項目及標準

表4經(jīng)過兩種方法繁殖更新的地方品種大黃豆Shannon-Weaver指數(shù)t檢驗

注：^*表示5％水平上顯著差異；^**表示1％水平上顯著差異

結(jié)果顯示，方法一繁殖更新的親代處理中，發(fā)芽率為83.0％的處理G_P-I₁，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₁相比差異不顯著，發(fā)芽率61.0％和30.0％的處理G_P-II₁和G_P-III₁，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₁相比差異顯著或極顯著。這表明，較高生活力的處理(發(fā)芽率≥83.0％)與對照相比，其遺傳完整性得到了較好的保持，而較低生活力的處理(發(fā)芽率≤61.0％)與對照相比，其遺傳完整性發(fā)生了顯著變化。子代中各個處理(包括G_F1-CK₁、G_F1-I₁、G_F1-II₁和G_F1-III₁)的發(fā)芽率均為90.0％以上，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照相比差異均不顯著，特別是處理G_F1-CK₁與對照G_P-CK₁相比幾乎沒有任何差異，表明高生活力的子代群體，與對照相比其遺傳完整性得到了較好的保持。這說明形態(tài)多樣性與生活力密切相關(guān)，原因是形態(tài)多樣性主要是數(shù)量性狀造成的，而質(zhì)量形狀的差異很小，高生活力子代群體的數(shù)量性狀與對照群體的差異較小，而低生活力子代群體的數(shù)量性狀與對照群體的差異較大。

方法二繁殖更新的親代處理中，發(fā)芽率同為83.0％的處理G_P-I₂，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異顯著，發(fā)芽率61.0％和30.0％的處理G_P-II₂和G_P-III₂，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異極顯著。這表明由于繁殖方法不當較高生活力的親代處理(發(fā)芽率≥83.0％)與對照G_P-CK₂相比，其遺傳完整性就發(fā)生了顯著變化，而較低生活力的處理(發(fā)芽率≤61.0％)與對照G_P-CK₂相比，其遺傳完整性發(fā)生了極顯著變化。子代中處理G_F2-CK₂的發(fā)芽率為89.0％，與對照G_P-CK₂相比差異不顯著，但t值和概率值顯示，與方法一相比，經(jīng)過方法二繁殖更新的子代處理，雖然其親代生活力很高，為93.0％，但是其子代仍然發(fā)生了形態(tài)多樣性變化；處理G_F1-I₂和G_F1-II₂的發(fā)芽率為88.0％和86.0％，與方法一相比，其發(fā)芽率有所下降，而Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異雖不顯著，但其概率值已接近0.05，其差異水平快要達到顯著水平；處理G_F1-III₂的發(fā)芽率為85.0％，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異顯著，表明其遺傳完整性就發(fā)生了顯著變化。

以上數(shù)據(jù)表明，由于繁殖方法不當，較高生活力的子代處理(發(fā)芽率≥85.0％)，其遺傳完整性也發(fā)生了顯著變化。推其原因：首先，親代處理中由于種子活力下降而導(dǎo)致田間成苗率下降，造成種植密度不一致，一些單株長得過于高大，其形態(tài)性狀，特別是數(shù)量性狀發(fā)生較大變化；其次，由于活力較差，田間成苗率大幅下降，親代傳遞給子代的遺傳多樣性降低，出現(xiàn)所謂的“奠基者效應(yīng)”，導(dǎo)致子代的遺傳完整性發(fā)生顯著變化。

(4)利用SSR分子標記對經(jīng)過兩種方法繁殖更新的地方品種大黃豆進行遺傳完整性分析

①分析樣本：

a、方法一：不同生活力親代處理及其子代處理在田間繁殖更新期間，選取96個單株(包括形態(tài)性狀調(diào)查的30個單株)，采集幼嫩葉片，-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｗ哟杉~片的單株與其親代也是一一對應(yīng)關(guān)系。

b、方法二：不同生活力親代處理及其子代處理在田間繁殖更新期間，隨機選取96個單株(不一定包括形態(tài)性狀調(diào)查的30個單株)，采集幼嫩葉片，-80℃下保存?zhèn)溆?。子代采集葉片的單株與其親代不存在一一對應(yīng)關(guān)系。

②基因組DNA提取：采用SDS法單株提取上述兩種方法繁殖更新的親代及子代各個處理的基因組DNA。

③SSR引物擴增及聚丙烯酰氨凝膠檢測：采用40對SSR核心引物(選取自王棟等，SSR標記分析種子老化及繁殖世代對大豆種質(zhì)遺傳完整性的影響，植物遺傳資源學(xué)報2010，11(2)：192-199。每個連鎖群上分布兩個位點，如表2所示)，對上述兩種方法繁殖更新的上述兩種方法繁殖更新的親代及其子代各個處理基因組DNA進行PCR擴增，采用6％聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，功率75W，時間為50min，電泳結(jié)束后采用常規(guī)銀染法檢測。

表5大豆地方品種大黃豆遺傳完整性分析40對SSR核心引物

a、PCR擴增反應(yīng)體系為：Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version2.0)10.0μL，5.0μmol/L Primer pairs(1.0+1.0)μL，20.0ng/μL DNA 5.0μL，ddH₂O 3.0μL，總體系為20.0μL。

b、PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min；95℃變性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。溫度降至4℃時取出，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

⑦結(jié)果統(tǒng)計及分析：根據(jù)檢測結(jié)果，利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等軟件對大豆地方品種大黃豆經(jīng)過上述兩種方法繁殖更新的親代及其子代各個處理進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，計算出各個處理的各位點等位基因頻率、每位點等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，并利用SAS 9.1對各處理群體與對照群體之間的各位點等位基因頻率進行χ²檢驗，對每位點等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)進行顯著性t檢驗。

a、等位基因頻率差異分析

表6大豆地方品種大黃豆處理間等位基因頻率差異分析(方法一)

從表6可以看出，方法一繁殖更新的親代處理G_P-I₁、G_P-II₁和G_P-III₁與對照G_P-CK₁的等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點個數(shù)以及占總位點個數(shù)百分比，隨著生活力的下降而增加，其中發(fā)芽率為30.0％的處理G_P-III₁的顯著和極顯著差異位點個數(shù)最多，分別為8個和4個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為20.00％和10.00％，發(fā)芽率為61.0％的處理G_P-II₁次之，分別為5和2個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為12.50％和5.00％，發(fā)芽率為83.0％的處理G_P-I₁最少，分別為1個和0個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為2.50％和0，這表明生活力下降顯著地影響了大豆種質(zhì)材料處理內(nèi)的等位基因頻率分布。由對照G_P-CK₁繁殖的處理G_F1-CK₁與對照G_P-CK₁相比，無顯著差異位點，由處理G_P-1I繁殖的處理G_F1-I₁與對照G_P-CK₁相比，顯著或極顯著差異的位點個數(shù)與處理G_P-I₁持平，同為為1個和0個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為2.50％和0，這表明發(fā)芽率為93.0％和83.0％的大豆經(jīng)過方法一繁殖更新后，各位點的等位基因頻率與對照相比幾乎沒有差異。由處理G_P-II₁和G_P-III₁繁殖的處理G_F1-II₁和G_F1-III₁，這2個處理與對照G_P-CK₁顯著或極顯著差異的位點個數(shù)較多，分別為6個和3個，9個和5個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為15.00％和7.50％，22.50％和12.50％，且子代處理比相應(yīng)親代處理的顯著或極顯著差異位點數(shù)要高，表明發(fā)芽率為61.0％和30.0％的大豆種質(zhì)材料子代處理各位點的等位基因頻率與對照相比差異顯著，且生活力水平愈低差異愈大。方法一結(jié)果表明，生活力下降對地方品種大黃豆的等位基因頻率分布影響甚大。

表7大豆地方品種大黃豆處理間等位基因頻率差異分析(方法二)

從表7可以看出，與方法一相比，方法二繁殖更新的各個處理與對照G_P-CK₂的等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點個數(shù)以及占總位點個數(shù)百分比普遍增加。親代處理G_P-I₂、G_P-II₂和G_P-III₂與對照G_P-CK₂的顯著和極顯著差異位點個數(shù)，同樣也隨著生活力的下降而增加，與方法一不同的是，發(fā)芽率為83.0％的處理G_P-I₂的顯著和極顯著差異位點個數(shù)分別為4個和2個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為10.00％和5.00％，而方法一相應(yīng)的顯著和極顯著差異位點個數(shù)為1個和0個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為2.50％和0，表明經(jīng)過方法二繁殖更新的較高生活力群體內(nèi)的等位基因頻率分布發(fā)生了顯著變化。發(fā)芽率為61.0％和30.0％的處理G_P-II₂和G_P-III₂與對照G_P-CK₂相比，其顯著和極顯著差異位點個數(shù)分別為7個和5個，12個和8個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為17.50％和12.50％，30.00％和20.00％，都明顯高于方法一相對應(yīng)的數(shù)據(jù)。方法二繁殖更新的處理G_F1-CK₂與對照相比，其顯著和極顯著差異位點個數(shù)分別為4個和3個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為10.00％和7.50％，而方法一相應(yīng)的顯著和極顯著差異位點個數(shù)分別為0個，占總位點的個數(shù)的百分比也是0，這表明發(fā)芽率為93.0％的處理經(jīng)過方法二繁殖更新后，其等位基因頻率分布與對照相比也產(chǎn)生了顯著差異。由處理G_P-I₂、G_P-II₂和G_P-III₂繁殖的處理G_F1-I₂、G_F1-II₂和G_F1-III₂，這3個處理與對照G_P-CK₁顯著或極顯著差異的位點個數(shù)較多，分別為6個和4個，9個和7個以及14個和10個，占總位點的個數(shù)的百分比分別為15.00％和10.00％，22.50％和17.50％以及35.00％和25.00％，與方法一的相應(yīng)數(shù)據(jù)相比，都明顯高出甚多。以上數(shù)據(jù)說明方法二繁殖更新的各個處理(包括高生活力處理)的等位基因頻率分布與對照之間的差異明顯高于方法一。

b、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

表8大豆地方品種大黃豆群體遺傳結(jié)構(gòu)(方法一)

注：^*表示5％水平上顯著差異；^**表示1％水平上顯著差異

從表8中可以看出，親代處理G_P-I₁、G_P-II₁、G_P-III₁及其子代處理G_F1-I₁、G_F1-II₁和G_F1-III₁，其各項遺傳多樣性參數(shù)均低于對照G_P-CK₁，而且隨老化時間的延長，生活力水平愈低，其各項遺傳多樣性參數(shù)也愈低。t檢驗結(jié)果顯示，由對照G_P-CK₁繁殖的處理G_F1-CK₁，其各項遺傳多樣性參數(shù)與對照G_P-CK₁相比幾乎沒有差異，表明發(fā)芽率為93.0％的處理經(jīng)過方法一繁殖更新后，其群體遺傳結(jié)構(gòu)得到了較好的保持。處理G_P-I₁的A、H和I等3項遺傳多樣性參數(shù)與對照相比無顯著差異，而其子代處理G_F1-I₁的各項遺傳多樣性參數(shù)與對照相比雖有所下降但沒有達到顯著差異水平。處理G_P-II₁和G_P-III₁的A、H和I等3項遺傳多樣性參數(shù)與對照G_P-CK₁相比差異顯著或極顯著，其子代處理G_F1-II和G_F1-III的A、H和I等3個遺傳多樣性參數(shù)與對照相比差異極顯著，表明更新發(fā)芽率分別為61.0％和30.0％的處理因生活力水平下降，其自身及子代群體內(nèi)的遺傳多樣性低于對照處理遺傳多樣性。方法一結(jié)果表明，生活力下降對大豆地方品種大黃豆的群體遺傳結(jié)構(gòu)影響顯著。

表9大豆地方品種大黃豆群體遺傳結(jié)構(gòu)(方法二)

注：^*表示5％水平上顯著差異；^**表示1％水平上顯著差異

從表9中可以看出，與方法一相比，方法二繁殖更新的各個處理包括對照的各項遺傳多樣性參數(shù)均有所下降。親代處理G_P-I₂、G_P-II₂、G_P-III₂及子代處理G_F1-CK₂、G_F1-I₂、G_F1-II₂和G_F1-III₂，其各項遺傳多樣性參數(shù)均低于對照G_P-CK₂，而且生活力水平愈低，其各項遺傳多樣性參數(shù)也愈低。t檢驗結(jié)果顯示，與方法一相比，由對照G_P-CK₂繁殖的處理G_F1-CK₂，其各項遺傳多樣性參數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異雖未達到顯著水平，但下降的較多，表明發(fā)芽率為93.0％的處理經(jīng)過方法二繁殖更新后，其群體遺傳結(jié)構(gòu)有所改變，但未達到顯著水平。處理G_P-I₂及其子代處理G_F1-I₂的A、H和I等3項遺傳多樣性參數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異顯著，這點與方法一不同，表明發(fā)芽率為83.0％的處理經(jīng)過方法二繁殖更新后，其群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。處理G_P-II₂和G_P-III₂及其子代處理G_F1-II₂和G_F1-III₂的A、H和I等3項遺傳多樣性參數(shù)與對照G_P-CK₂相比差異極顯著，表明更新發(fā)芽率分別為61.0％和30.0％的處理因生活力水平下降，其自身及子代群體內(nèi)的遺傳多樣性低于對照的遺傳多樣性，這方面兩種方法是一致的。以上結(jié)果表明，方法二繁殖更新的各個處理(包括高生活力處理)的群體遺傳結(jié)構(gòu)與對照之間的差異明顯高于方法一，其群體內(nèi)的遺傳多樣性降低較多。

綜合大豆地方品種大黃豆形態(tài)標記分析和SSR標記分析的實驗結(jié)果可得出以下結(jié)論：方法一繁殖更新的大豆種質(zhì)材料，當更新發(fā)芽率高于83.0％時，親代及其子代在形態(tài)性狀水平及DNA分子水平上，其遺傳完整性都得到了較好的保持；更新發(fā)芽率低于61.0％時，親代及其子代在DNA分子水平上的遺傳完整性明顯改變。以此推薦其更新發(fā)芽率最低不得低于61.0％。方法二繁殖更新的大豆種質(zhì)材料，即使更新發(fā)芽率為83.0％時，親代及其子代在形態(tài)性狀水平及DNA分子水平上，其遺傳完整性都發(fā)生了顯著變化，且得出的群體內(nèi)遺傳多樣性低于方法一。因此，方法一較方法二更有利于大豆遺傳完整性的保持，建議采用本發(fā)明提供方法對大豆種質(zhì)遺傳完整性分析時進行繁殖更新。