本發明屬于植物轉化領域，具體涉及一種提高小麥幼胚出芽率的方法及其培養基配方。

背景技術：

小麥是最后一個轉化成功的重要禾谷類糧食作物，一方面由于小麥屬于六倍體作物，遺傳背景復雜，基因組相對較大(約17Gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麥遺傳轉化過程中DNA導入頻率低且轉化后再生能力不高，有較強的基因型依賴性。自1992年成功獲得第一例轉基因小麥以來，人們嘗試利用多種轉化方法和多種外植體轉化小麥，轉化方法包括農桿菌、基因槍、花粉管通道、超聲波法、離子束注入法、激光微束穿刺法和PEG法等，外植體包括幼胚、成熟胚、花藥愈傷組織和幼穗等，在降低轉化的基因型依賴性、提高轉化效率等方面取得了一定的進展，但普遍存在的問題是轉化效率仍然很低，難以實現規模化。

本發明對提高小麥幼胚出芽率的方法進行了探索，并建立了高效的小麥幼胚培育體系，為后續小麥功能基因組學的研究和小麥分子育種，具有重要的意義。

技術實現要素：

本發明提供了一種提高小麥幼胚胚性愈傷產生率的培養基配方和組織培養方法。本發明所提供的提高小麥幼胚胚性愈傷產生率的方法，在預培養階段，可以有效的提高幼胚產生胚性愈傷的效率，本發明提供了一種小麥幼胚胚性愈傷誘導培養基MSV4，可以提高小麥幼胚胚性愈傷的誘導率，其特征在于所述誘導培養基含有終濃度為0.027mM的甘氨酸，0.1～2.57mM的谷氨酰胺，50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba。

在上述誘導培養基中，還包含MS大量元素、微量元素、鐵鹽和B5的維生素。

更具體的，本發明提供了一種小麥幼胚胚性愈傷誘導培養基，所述誘導培養基的組成組分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26～30μM，H₃BO₃ 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，FeSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3～30μM，鹽酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。

本發明還提供了一種上述誘導培養基的制備方法，包括以下步驟：按上述配方將各組分添加到MS基礎培養基中，在高溫滅菌完冷卻后，再加入Dicamba 2mg/L。更具體的，其中所述的高溫滅菌的一般條件是121℃，20min。

本發明還提供了一種提高小麥幼胚胚性愈傷率的組織培養方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

a)采集小麥授粉后的小麥幼胚；

b)將小麥幼胚在含有終濃度為0.027mM的甘氨酸、0.1～2.57mM的谷氨酰胺、50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba的誘導培養基上進行預培養。

其中所述的小麥幼胚為小麥授粉后12-16天、直徑為0.8-1.5mm的幼胚。在小麥授粉12-16天后，將小麥穗子上的未成熟種子放入滅菌三角瓶中加入75％乙醇搖洗1min，滅菌水洗三次；加入1％硝酸銀，放入搖床中170rpm震蕩15min，最后用滅菌水沖洗3-4次。再采集未成熟種子中的幼胚。

更具體地，在預培養階段，是將幼胚盾片向上的接種于培養基上，預培養的時間是6-8天。發明人在研究過程中發現，在小麥幼胚轉化的預培養階段，將幼胚接種于培養基上時可以有不同的放置方向，盾片向上或盾片向下，發明人通過對幼胚不同放置方向產生胚性愈傷的效率進行比較，結果發現，盾片向上產生胚性愈傷的比例為22％，而盾片向下產生胚性愈傷的比例為0，尤其說明在小麥幼胚轉化的預培養階段，將盾片向上放置在培養基上，可以有效的提高胚性愈傷的產生效率，從而提高小麥轉化的效率。

本發明所提供的組織培養方法，適用于所有小麥品種，所述小麥品種包括但不限于揚麥158、中國春、濟麥22、京冬18、川農16、寧春4號、科農199和CB037。

更具體地，在上述組織培養方法中，其中所述的MSV4誘導培養基的組成成分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26～30μM，H₃BO₃ 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，FeSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3～30μM，鹽酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。將三個小麥品種(科農199、CB037、揚麥158)用MSV4培養基預培養6-8天的幼胚的出芽率分別是57.4％、81.7％和44.1％。

本發明使用現有技術中公開的誘導培養基MSV5進行幼胚培育，溶劑為水，MSV5的組成成分是：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26μM，H₃BO₃ 81μM，KI 4.5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，FeSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3μM，鹽酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天門冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，滅菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。以上各濃度均為相應物質在所述MSV5培養基中的終濃度。本發明將三個小麥品種(科農199、CB037、揚麥158)用MSV5培養基預培養6-8天的幼胚的出芽率分別是19.6％、25.4％和19.6％。說明本發明所提供的MSV4培養基可以更好的提高小麥幼胚的胚性愈傷率，從而提高小麥幼胚培育的出芽率。

綜合而言，本發明通過提供一種MSV4培養基，使小麥幼胚的胚性愈傷產生率明顯提高，這對于利用基因工程途徑和細胞工程途徑改良優良小麥品種具有重要意義。

附圖說明

圖1是不同培養基和預培養時間的比較。A、B是小麥品種科農199，C、D是小麥品種CB037，E、F是小麥品種揚麥158。A、C、E是培養基MSV4上預培養6-8天，B、D、F是MSV5培養基上預培養2天。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用化學試劑均購自SIGMA公司，小麥材料CB037從中國農業科學院作物科學研究所獲得。

實施例1.培養基的準備

本發明中用到的培養基配方如下所示。

誘導培養基MSV4：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 30μM，H₃BO₃ 100μM，KI 5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，FeSO₄ 100μM，Na₂-EDTA100μM，煙酸8μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素30μM，鹽酸吡哆醇4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.2mM，水解酪蛋白250mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L，121℃，20min，滅菌后加入Dicamba3mg/L。

誘導培養基MSV5：CaCl₂ 2.99mM，KNO₃ 18.79mM，NH₄NO₃ 20.61mM，KH₂PO₄ 1.25mM，MgSO₄ 1.50mM，MnSO₄ 1mM，ZnSO₄ 26μM，H₃BO₃ 81μM，KI 4.5μM，NaMoO₄ 1μM，CuSO₄ 0.1μM，CoCl₆ 0.1μM，FeSO₄ 100μM，Na₂-EDTA 100μM，煙酸4.1μM，肌醇0.56mM，鹽酸硫胺素0.3μM，鹽酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天門冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，滅菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。

實施例2.幼胚的預培養

采集小麥授粉后12-16天、直徑為0.8-1.5mm的小麥幼胚進行預培養。預培養的目的是使幼胚在激素作用下脫分化產生愈傷，所產生的愈傷可以作為基因槍轟擊的真正受體。幼胚脫分化所產生的愈傷又分為胚性愈傷和非胚性愈傷，只有胚性愈傷才能夠在激素作用下再分化成完整植株，因此高的胚性愈傷產生率是高轉化效率的基礎。

具體地，在小麥授粉12-16天后，將小麥穗子上的未成熟種子放入滅菌三角瓶中加入75％乙醇搖洗1min，滅菌水洗三次；加入1％硝酸銀，放入搖床中170rpm震蕩15min，最后用滅菌水沖洗3-4次。再采集未成熟種子中的幼胚。幼胚接種于培養基上時可以有不同的放置方向(盾片向上和盾片向下)，發明人對幼胚不同放置方向產生胚性愈傷的效率進行了比較，結果如表1所示，盾片向上產生胚性愈傷的比例為22％，而盾片向下產生胚性愈傷的比例為0，因此，在后續實驗中發明人都采取幼胚盾片向上的方式進行預培養。預培養的培養條件具體可為：

表1.幼胚預培養時不同放置方向出愈率比較

幼胚預培養時采用不同培養基和不同培養時間所產生的胚性愈傷再分化比例即出芽率也有所不同。本發明中，出芽率高的愈傷證明胚性愈傷的比例也高。發明人在三個小麥品種(科農199、CB037、揚麥158)中，就兩種培養基和兩個培養時間進行了對比，結果如表2和圖1所示，用MSV4培養基預培養6-8天的幼胚的出芽率遠高于用MSV5培養基預培養2天的幼胚的出芽率。說明本發明所提供的誘導培養基可以有效的提高小麥幼胚產生胚性愈傷的比率。

表2.不同培養基和預培養時間的比較