本發明屬于四倍體誘導
技術領域：
，具體涉及一種四倍體蘿卜的誘導方法。
背景技術：
：蘿卜是十字花科（Brassicaceae）蘿卜屬（Raphanus）蘿卜種（RaphanussativusL.）下的一個栽培品種，主產重慶市涪陵區及周邊地區，是繼榨菜之后的第二個涪陵特產。蘿卜含有大量天然色素-蘿卜紅，是提取天然色素的理想原料。隨著人們生活水平的提高，對天然色素的需求越來越大。但目前所種植的蘿卜色素含量不高、產量低，種質資源混雜、退化現象嚴重，急需拓展蘿卜種質資源。近年來利用化學試劑誘導四倍體，是創制新的蘿卜種質資源的有效途徑之一，目前，蘿卜四倍體誘導的方法是利用秋水仙素和氟樂靈處理兩葉一心的蘿卜，再從形態和細胞學水平鑒定處理后的幼苗加倍是否成功，采用這種蘿卜四倍體誘導技術主要存在以下問題：（1）藥品耗量大，過程繁瑣、耗時。兩葉一心處理法，是在蘿卜幼苗長至兩葉一心時，在心葉上涂抹誘變劑，每顆幼苗需要連續處理3-7天，早、晚各處理一次，滴加的秋水仙素吸收不充分，容易蒸發、見光分解，處理的持續時間較長，且容易受到天氣條件的影響，如果遇到連續陰雨天，將無法對葉片進行處理；（2）容易出現嵌合體。只處理心葉，由于分生組織細胞分裂的不同步性，用藥劑處理后，有的細胞加倍為四倍體，有一部分細胞未加倍，從而形成嵌合體。由于二倍體細胞一般生長較快，而二倍體細胞較多時就會包埋了四倍體細胞而使倍性恢復。使植株成活率低，進而降低誘變率，已有方法誘導率在4.5%-16%，誘導率相對較低；（3）鑒定繁瑣，需要從形態、細胞或分子水平進行鑒定，鑒定過程繁瑣?；诖?，現有的誘導方法存在一定不足之處，因此需要尋找一種簡單、誘導率高且適合于蘿卜的四倍體誘導方法。技術實現要素：針對現有技術存在的上述不足，本發明要解決的技術問題是：針對現有四倍體誘導存在藥品耗量大、過程繁瑣耗時、容易出現嵌合體、鑒定繁瑣等不足之處，而提供一種處理時間短、操作便捷、變異更徹底、增加誘導成功率的四倍體蘿卜的誘導方法。為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：一種四倍體蘿卜的誘導方法，采用秋水仙素水溶液對二倍體蘿卜種子進行浸泡，對浸泡后的種子進行催芽處理得到幼苗，將幼苗移栽到田間或盆栽進行種植，得到四倍體蘿卜。本發明通過創造性研究提出對還沒有進行發芽的植物種子進行秋水仙素浸泡誘導，用秋水仙素抑制植物染色體的有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期，染色體雖然縱裂，但是細胞不分裂，不能形成兩個子細胞，因而使染色體加倍，達到制備四倍體蘿卜的目的。進一步，具體包括如下步驟：1）取若干二倍體蘿卜種子進行清洗，將清洗后的種子置于質量濃度為0.2~1%的秋水仙素水溶液中，于4~8℃下浸泡12~24h；2）取出步驟1）清洗后的種子，用水清洗至少3次；3）將步驟2）清洗后的種子放于浸濕的紗布、濾紙或河沙上，于25~30℃下恒溫培養進行催芽處理；4）步驟3）催芽處理使幼苗生長至3~5cm長度后，將幼苗移栽到田間或盆栽中進行種植，得到四倍體蘿卜。本發明方法相較于現有技術兩葉一心誘導方法而言處理時間短、操作簡單，不需要連續進行誘導處理，且更為關鍵的是本發明誘導方法避免了現有兩葉一心方法由于分生組織細胞分裂不同步，而造成的部分細胞加倍，部分細胞未加倍，從而形成嵌合體的技術問題，采用本發明秋水仙素對種子浸泡的方式對植物的變異更加徹底，出現誘導嵌合體的概率遠遠小于現有兩葉一心誘導方法，增加了誘導的成功率，使植株的成活率更高，經檢測采用本發明方法誘導得到的四倍體蘿卜單株重量和內部紅色素含量均比普通二倍體蘿卜高，具有極高的應用價值。進一步，步驟4）幼苗移栽到田間或盆栽中種植后，在幼苗生長到6~8葉狀態時，分別取二倍體蘿卜植株和各誘導植株的無病蟲害葉片放入冰中處理10~15min，將經過冰處理后的葉片放入混合固定液中固定15~20min，固定處理后取葉片的下表皮置于載玻片上，分別制得二倍體蘿卜和各誘導植株的葉片觀察片，用顯微鏡觀察二倍體蘿卜和各誘導植株的葉片中氣孔并進行對比，將葉片中氣孔少、氣孔的橫徑和縱徑大于二倍體蘿卜葉片中氣孔的橫徑和縱徑的植株鑒定為四倍體誘導植株，繼續栽培四倍體誘導植株，得到四倍體蘿卜；其中，所述混合固定液為將體積濃度為38%~45%的甲醛水溶液、冰醋酸和體積濃度為70%~75%的乙醇水溶液按照1~1.5mL:0.5~1mL:16~18mL的體積比混合制得。采用本發明方法誘導得到的誘導植株，僅需要對葉片中的氣孔數和氣孔的橫徑、縱徑進行觀察即可以鑒定出四倍體蘿卜，相較于現有技術中通過采用染色體數目鑒定的方式進行鑒定節省了時間，且在植物長葉未開花時期即可以辨別出四倍體蘿卜的植株，該種鑒定方法的鑒定正確率高，在植株生長的早期即可進行鑒定，能及時反饋誘導結果。進一步，步驟4）幼苗移栽到田間或盆栽中進行種植至蘿卜抽薹前，觀察各誘導植株的根莖和葉片，以二倍體蘿卜植株為對比，鑒定根莖粗、葉片卷曲皺縮、葉片厚度厚、葉片大和株高高的誘導植株為四倍體誘導植株，繼續栽培四倍體誘導植株，得到四倍體蘿卜。這樣，可以僅通過觀察誘導植株的生長形態即可以進行四倍體植株的鑒定，相較于從染色體層面觀察才能鑒定四倍體植株而言，更加簡單方便，費時少，當誘導植株多時，更方便進行鑒定和管理，鑒定過程沒有對植株本身造成傷害，保證植株的完整性。再進一步，步驟4）對四倍體誘導植株繼續栽培至開花后，以二倍體蘿卜植株的花蕾為對比，對各四倍體誘導植株進行二次鑒定，鑒定花瓣大、花藥大和花托大的四倍體誘導植株為確定誘導植株，繼續栽培確定誘導植株，得到四倍體蘿卜。進一步通過花瓣鑒定的方式對誘導植株進行進一步的鑒定，可以使誘導鑒定的結果更加準確，使獲得四倍體蘿卜的概率進一步提高，避免對非誘導成功植株進行栽培而浪費時間。作為又一優化，步驟4）幼苗移栽到田間或盆栽中種植至開花后，對花進行人工輔助授粉。采用人工輔助授粉的方式，能夠顯著提高種子結實率，保證種植得到的果實更多且質量更好。作為再一優化，所述蘿卜為胭脂蘿卜。本發明方法對胭脂蘿卜取得了尤其好的誘導效果，取得了30.2%的高誘導率，明顯高于現有采用兩葉一心法進行誘導得到的誘導率4.5%-16%。本發明方案中，步驟4）幼苗移栽到田間或盆栽中種植至開花時，還可以分別取二倍體蘿卜植株和各誘導植株的花蕾，制備二倍體蘿卜植株和各誘導植株的花蕾染色體標本，采用顯微鏡觀察二倍體蘿卜植株和各誘導植株的花蕾染色體標本，將花蕾染色體數目為二倍體蘿卜花蕾染色體數目兩倍的誘導植株鑒定為四倍體誘導植株，繼續栽培四倍體誘導植株，得到四倍體蘿卜；采用這樣觀察染色體數目的方式進行鑒定，更加直觀反映了染色體是否加倍成功。相比現有技術，本發明具有如下有益效果：1、本發明對四倍體蘿卜進行誘導的方法操作簡單，處理時間短，只需要采用秋水仙素水溶液浸泡種子即可，解決了現有兩葉一心處理方法中連續誘導處理藥品耗量大、過程繁瑣耗時，容易出現嵌合體的問題。2、采用本發明方法對蘿卜進行誘導變異更徹底，出現的誘導嵌合體比兩葉一心方法更少，植株成活率更好，增加了誘導的成功率，本發明方法誘導率為30.2%，明顯高于現有采用兩葉一心法進行誘導得到的誘導率4.5%-16%，取得了意想不到的誘導效果。附圖說明圖1為誘導植株與二倍體植株的葉片和株高對比圖；圖2為誘導植株葉片氣孔觀察圖；圖3為二倍體植株葉片氣孔觀察圖；圖4為二倍體植株和四倍體植株氣孔數目、氣孔橫徑、縱徑的比較圖；圖5為四倍體與二倍體植株花器官形態對比圖；圖6為四倍體與二倍體植株花粉粒形態對比圖；圖7為四倍體與二倍體植株花粉粒形態和活性分析圖；圖8為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ的細線期圖；圖9為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ的偶線期圖；圖10為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ的粗線期圖；圖11為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ的雙線期圖；圖12為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ的終變期圖；圖13為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅰ圖；圖14為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ圖；圖15為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂后期Ⅰ圖；圖16為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂末期Ⅰ圖；圖17為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂前期Ⅱ圖；圖18為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂中期Ⅱ圖；圖19為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂后期Ⅱ圖；圖20為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂二分體圖；圖21為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂三分體圖；圖22為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂四分體圖；圖23為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂異常落后染色體圖；圖24為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂異常染色體橋圖；圖25為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂異常染色體數目異常圖；圖26為四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂異常三分體圖；圖27為四倍體胭脂蘿卜和二倍體植株的種子性狀分析圖。具體實施方式下面結合具體實施例和說明書附圖對本發明作進一步詳細說明。本實施案例在以本發明技術為前提下進行實施，現給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發明具有創造性，但本發明的保護范圍不限于以下的實施例。下述實施例中使用到的儀器以及原料有：胭脂蘿卜紅心1號種子，電子天平，棕色試劑瓶，培養皿，光照培養箱，脫脂棉，載玻片，蓋玻片，培養皿，鑷子，顯微鏡，制冰機等。胭脂蘿卜的誘導：利用質量濃度為0.2%的秋水仙素浸泡紅心一號種子1000粒（液面浸過種子即可），于4℃下浸泡處理24小時，用蒸餾水浸泡200粒紅心一號蘿卜作為對照，每天早上7：00-8:00、晚上18：00-19:00各觀察一次，并進行管理。取出種子，用蒸餾水清洗3-5次。將清洗后的種子放于墊有浸濕紗布的培養皿中，25℃恒溫培養。幼苗生長至3-5cm后，移栽到田間或種植盆。幼芽鑒定：分別以清水和秋水仙素處理幼芽，以清水處理的幼芽為對照，觀察幼芽形態，結果顯示清水浸泡處理后的幼芽生長較快、細長，0.2%的秋水仙素浸泡處理后的幼芽，幼芽生長緩慢、較粗大。苗期形態鑒定：在胭脂蘿卜抽薹前，以蒸餾水處理的二倍體胭脂蘿卜為對照，對誘導胭脂蘿卜葉片的皺縮程度、葉片厚度、葉長、株高、葉寬、開展度、氣孔密度、氣孔大小等性狀進行觀察鑒定。首先觀察胭脂蘿卜葉片的皺縮程度，然后測量植株的葉片厚度、葉長、株高、葉寬和開展度。將誘導植株與二倍體植株進行比較，結果如圖1所示，發現誘變植株的葉片較卷曲，葉片的皺縮程度較大，根莖增粗，在葉長、葉寬、株高、植株開展度等性狀上與二倍體植株也有較大差異，相對于二倍體胭脂蘿卜植株，四倍體植株的葉厚度、葉長、株高、葉寬、開展度均高于二倍體。t檢驗結果（表1）表明，四倍體植株的葉厚、葉長、株高、葉寬和開展度均顯著高于二倍體。四倍體植株的平均葉片厚度、葉長、株高、葉寬、開展度較二倍體植株分別增加32.4%、39.6%、39.8%、24%和31.7%。表1二倍體植株和四倍體植株性狀差異顯著性分析性狀葉厚（cm）葉長（cm）株高（cm）葉寬（cm）植物開展度二倍體0.2521.2225.36.2435.5四倍體0.3735.15428.2252df1818181818t0.051.7341.7341.7341.7341.734︱t︱7.5*105.37*55.67*29.55*19.41*注：*表示在0.05水平上顯著。以上結果說明葉片厚度、葉長、株高、葉寬和開展度等性狀可以作為四倍體鑒定的重要特征，可以在幼苗移栽到田間或盆栽中進行種植至蘿卜抽薹前，觀察各誘導植株的根莖和葉片，以二倍體蘿卜植株為對比，鑒定根莖粗、葉片卷曲皺縮、葉片厚度厚、葉片大和株高高的誘導植株為四倍體誘導植株，繼續栽培四倍體誘導植株，得到四倍體蘿卜。氣孔鑒定：在幼苗生長到6~8葉狀態時，分別取下二倍體蘿卜植株和誘導植株中無病蟲害的葉片，迅速放入冰中10-15min，然后將部分葉片撕下放入FAA固定液（福爾馬林(體積濃度38%甲醛)5mL：冰醋酸5mL：體積濃度70%酒精90mL）固定15min，之后撕取下表皮，制作成臨時裝片，用尼康80i研究級正置顯微鏡觀察、拍照、測量氣孔的橫徑和縱徑，記錄每張裝片5個視野內的氣孔數，取10株獲取數據資料，最后取其平均值作為該植株的氣孔數。從圖2~圖4可以看出，二倍體胭脂蘿卜葉片單位視野內的氣孔數明顯多于誘導四倍體植株，但是誘導四倍體植株氣孔的橫徑和縱徑都大于二倍體植株。四倍體植株單位視野內的氣孔數目少于二倍體植株72.2%，但氣孔的橫徑和縱徑分別大于二倍體植株40.8%和30.7%。t檢驗結果（表2）表明，四倍體胭脂蘿卜單位視野內的氣孔數顯著少于二倍體植株，但是四倍體植株氣孔的橫徑和縱徑都顯著大于二倍體植株。表2二倍體植株和四倍體植株氣孔數目、氣孔橫徑、縱徑差異顯著性分析氣孔數目(個x視野-1)氣孔橫徑(cmx10-3)氣孔縱徑(cmx10-3)二倍體181.522.25四倍體52.573.25df181818t0.051.7341.7341.734︱t︱12.26*26.25*57.8*注：*表示在0.05水平上顯著。以上結果說明幼苗移栽到田間或盆栽中種植后，在幼苗生長到6~8葉狀態時，可以分別取二倍體蘿卜植株和各誘導植株的無病蟲害葉片進行氣孔數目、氣孔橫徑、縱徑的觀察，將葉片中氣孔少、氣孔的橫徑和縱徑大于二倍體蘿卜葉片中氣孔的橫徑和縱徑的植株鑒定為四倍體誘導植株，繼續栽培四倍體誘導植株，得到四倍體蘿卜。花器官特征分析：將誘導胭脂蘿卜與二倍體胭脂蘿卜相比，結果發現四倍體的花瓣、花藥、花托都比二倍體大（圖5）。由表3可以知，四倍體植株的花瓣橫徑相比二倍體增寬40.85%，花瓣縱徑更是增長49.90%；四倍體植株的花藥橫徑和縱徑與二倍體相比分別增長38.85%和29.46%。t檢驗結果（表3）表明，四倍體的花器官各部分都顯著大于二倍體。表3二倍體植株和四倍體植株花瓣、花藥差異顯著性分析花瓣橫徑花瓣縱徑花藥橫徑花藥縱徑四倍體10.1125.831.573.36二倍體5.9812.940.962.37df9999t0.052.2622.2622.2622.262︱t︱9.40*20.44*5.10*5.19*注：*表示在0.05水平上顯著。以上結果說明對四倍體誘導植株繼續栽培至開花后，可以以二倍體蘿卜植株的花蕾為對比，對各四倍體誘導植株進行鑒定，鑒定花瓣大、花藥大和花托大的為四倍體誘導植株?；ǚ哿Ｌ卣鞣治觯簩λ谋扼w誘導植株花粉和二倍體植株花粉進行分析，由圖6（圖6中上面一排為四倍體誘導植株花粉，下面一排為二倍體植株花粉）可以看出四倍體的花粉粒體型大于二倍體，但是四倍體花粉?；钚詤s小于二倍體（圖7）。從表4得出四倍體的花粉粒橫徑比二倍體花粉粒橫徑增加38.25%，縱徑增長33.78%。t檢驗結果（表4）表明，四倍體胭脂蘿卜的花粉粒橫徑的和縱徑都顯著高于二倍體植株。但是對于花粉?；钚远裕扼w胭脂蘿卜的花粉粒活性顯著高于四倍體，四倍體植株花粉?；钚员榷扼w植株低27.11%。表4二倍體植株和四倍體植株花粉粒特征差異顯著性分析花粉粒橫徑花粉?？v徑花粉?；钚运谋扼w11.1112.7660.88二倍體6.868.4583.52df999t0.052.2622.2622.262︱t︱16.71*12.01*5.40*注：*表示在0.05水平上顯著。四倍體胭脂蘿卜花粉母細胞減數分裂分析：1、第一次減數分裂前期Ⅰ的細線期（圖8），在細胞核內染色質開始凝聚成細長、絲狀的染色體。前期Ⅰ的偶線期（圖9），細胞內的同源染色體兩側面緊密相接，同時進行配對，同源染色體結合形成聯會復合體，染色單體無法被清晰辨認，染色體數量由4n條單價體向2n條二價體轉變。前期Ⅰ的粗線期（圖10），染色體向四周發散，線性化明顯，染色體局部開始相互纏繞，但是核仁染色較淺，觀察困難。前期Ⅰ的雙線期（圖11），染色體開始螺旋并進一步加粗，彼此分開，交叉結點會在有些非姐妹染色單體間形成，同時出現端化現象。前期Ⅰ的終變期（圖12），染色體高度螺旋化，通常由于形成二價體和多價體而顯著收縮，均勻分布在細胞中（圖13）。染色體出現多價體、四價體、三價體、二價體和單價體因此該時期染色體計數比較困難。中期Ⅰ時期的染色體排列比較松散（圖14），側面觀排列在赤道板上。后期Ⅰ（圖15）同源染色體分離并向兩極移動。末期Ⅰ（圖16）可清晰的觀察到染色體條數，大部分細胞沒有觀察到明顯的二分體，在觀察過程中到僅統計到少數細胞中央出現細胞板，成為類似二分體的現象（圖20）。2、第二次減數分裂間期Ⅱ和前期Ⅱ（圖17）時期較短，很快便進入第二次減數分裂。中期Ⅱ（圖18），可清楚地觀察到2組染色體，每組分別18條，每條染色體含2條姐妹染色單體，中期Ⅱ是染色體記數的最佳時期。后期Ⅱ（圖19）每條染色體的著絲點開始分離，姊妹染色單體也隨著絲點的分離而分開，形成兩條單獨的染色體。在紡錘絲牽引力的作用下，這兩條染色體分別移向細胞的兩極。四倍體減數分裂中，染色體分別被牽引到四極，由胼胝質分開，形成四分體。出現的不均均分離現象，最終形成三分體（圖21），到此四倍體胭脂蘿卜第二次減數分裂結束。同源四倍體減數分裂中四分體類型為正四面體型和左右對稱型（圖22），其余為單分體、三分體和多分體類型。3、異常減數分裂由圖23可知，在減數分裂第二次分裂中期出現了滯后染色體，這有可能導致染色體分裂不均勻。在圖24中染色單體著絲點分離的兩極之間被拉緊成細絲，這疑似核分裂后期中出現的染色體橋。在圖25中可以清楚地數到共11條染色體，而這是四倍體和二倍體減數分裂過程中都不會出現的情況。由圖26可以看出，在單位視野的第二次減數分裂后期過程中出現了高比例的三分體。四倍體胭脂蘿卜種子形態對誘導四倍體胭脂蘿卜和二倍體胭脂蘿卜種子形態進行觀察比較，結果發現四倍體胭脂蘿卜單支結實數量比二倍體低，四倍體果實的體型比二倍體更大。從表5和圖27得知，四倍體胭脂蘿卜的結實數目只有二倍體胭脂蘿卜的51.08%，而四倍體植株所結的果實橫徑與二倍體所結果實橫徑相比增寬39.97%，四倍體的果實縱徑比二倍體的果實縱徑增長8.46%。四倍體胭脂蘿卜的結實率只有二倍體的72.81%。t（表5）檢驗結果表明，四倍體的果實橫徑和果實縱徑顯著大于二倍體，四倍體胭脂蘿卜的結實率顯著小于二倍體。采用本發明方法誘導得到的四倍體胭脂蘿卜單株重量高，具有高利用價值。表5二倍體植株和四倍體植株的種子性狀顯著性差異分析果實橫徑果實縱徑結實率四倍體14.4154.6160.71二倍體8.6549.9983.38df999t0.052.2622.2622.262︱t︱11.41*2.59*11.62*注：*表示在0.05水平上顯著。色素含量測定：肉質根的色素含量依照呂發生等提出的方法提取測定，其操作步驟如下：（1）稱取檸檬酸16.9580g、磷酸二氫鈉13.5000g配制成pH3.0的緩沖液1000ml，稱取蘿卜紅色素0.2052g，加入95%乙醇1mL為標準品溶液。然后分別吸取標準品溶液1-13mL并用緩沖液定容至100mL，在520nm下測吸收值，繪制標準曲線。（2）將新鮮肉質根清洗、擦干、切成小顆粒充分混勻，立即稱取鮮樣測定肉質根含水量，余下部分用漿渣自動分離機獲取汁液，攪勻之后取8-10mL汁液在離心機中離心沉淀（4000r·min-1、5min），離心完成后汲取1mL上清液，用磷酸二氫鈉緩沖液定容到100mL，然后在分光光度計中檢測520nm波長下的吸收值。（3）1000g新鮮肉質根的蘿卜紅含量C鮮（‰）=v×y。其中，汁液容積v（mL）=1000×肉質根含水量（%），汁液濃度y（g/mL）由標準曲線的回歸方程計算。對本實施例誘導四倍體胭脂蘿卜和二倍體胭脂蘿卜中色素含量進行測定，結果表明，四倍體胭脂蘿卜平均色素含量為32.25‰，二倍體胭脂蘿卜平均色素含量為22.25‰，四倍體胭脂蘿卜色素含量和重量明顯高于二倍體胭脂蘿卜，具有高利用價值。誘導率:本實施例共浸泡種子1000粒，發芽的胭脂蘿卜有700株，死亡170株，共鑒定出160株變異株，誘導率為30.2%，明顯高于現有采用兩葉一心法進行誘導得到的誘導率4.5%-16%，取得了意想不到的誘導效果。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。當前第1頁1 2 3