本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

梅花，是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，在我國(guó)有7000年以上的應(yīng)用史和3000年以上的栽培史，品種繁多，在引種栽培過程中，培育出了眾多優(yōu)良的園藝新品種，極大地豐富了我國(guó)的園林景觀。梅花從受粉到果實(shí)成熟僅要兩三個(gè)月左右的時(shí)間，果實(shí)發(fā)育時(shí)間短，其果實(shí)達(dá)到成熟時(shí)，胚尚未成熟。種子經(jīng)過砂藏處理，在正常條件下播種萌發(fā)率也很低。愈傷組織培養(yǎng)不僅是一種植物快繁的新手段，同時(shí)也是植物改良，種質(zhì)保存和有用化合物生產(chǎn)的理想途徑，梅花為木本植物，其愈傷組織的誘導(dǎo)比較困難，組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)褐變、菌絲感染及誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)等的問題。

公開號(hào)為CN 102550404 A，申請(qǐng)?zhí)枮?01110422216.3的中國(guó)專利提供了一種梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)方法，該發(fā)明中詳細(xì)介紹了梅花葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，但外植體培養(yǎng)過程往往會(huì)出現(xiàn)褐變、菌絲感染等的問題，從而影響愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率，該發(fā)明出沒有提供詳細(xì)的解決方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中沒有提供詳細(xì)方法以解決外植體培養(yǎng)過程出現(xiàn)褐變、菌絲感染等的問題，提供一種能解決褐變及菌絲感染等問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基100-130份、母液I20-30份和純凈水10-20份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣1-5mg/L、異戊烯氨基嘌呤2-6mg/L、4-碘苯氧乙酸2-6mg/L、水溶性氮酮1-4mg/L和丙環(huán)唑1-4mg/L。

在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基110-120份、母液I22-28份和純凈水12-18份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣2-4mg/L、異戊烯氨基嘌呤3-5mg/L、4-碘苯氧乙酸3-5mg/L、水溶性氮酮2-3mg/L和丙環(huán)唑2-3mg/L。

在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基115份、母液I25份和純凈水15份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣3mg/L、異戊烯氨基嘌呤4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L、水溶性氮酮2.5mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L。

在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述母液I的配制方法如下：先按重量份比稱取亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮和丙環(huán)唑；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入部分純凈水中，充分?jǐn)嚢柚辽鲜鑫镔|(zhì)充分溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

一種制備所述梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值，此為體系3；

(3)取體系3，用高壓蒸汽滅菌20-30min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述培養(yǎng)基的pH值為5.5-6.5。

在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述高壓蒸汽滅菌，滅菌壓力為180-200KPa。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有的有益效果：

本發(fā)明具有促使梅花愈傷組織快速形成，有減少褐變產(chǎn)生及菌絲感染的問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)梅花葉片愈傷組織，誘導(dǎo)時(shí)間縮短至6天，誘導(dǎo)率高達(dá)99％,褐變率僅為1.2％，愈傷組織緊密，顏色淺綠而透明，呈現(xiàn)出很好的狀態(tài)。

1.在誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程中往往會(huì)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，褐變的產(chǎn)生會(huì)對(duì)許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)與分化，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡，還常出現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)形成慢，誘導(dǎo)率低、質(zhì)量不高等的問題，研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明通在對(duì)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加母液I配方，有效的改善了以上問題，其中，異戊烯氨基嘌呤為一類細(xì)胞分裂素，可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大作用，并調(diào)控其分化，4-碘苯氧乙酸有吲哚乙酸的生理活性，與異戊烯氨基嘌呤混合使用可快速高效誘導(dǎo)愈傷組織的形成及分化；水溶性氮酮為滲透劑，可帶動(dòng)異戊烯氨基嘌呤和4-碘苯氧乙酸快速滲透到細(xì)胞內(nèi)；組織在培養(yǎng)過程中，多酚氧化酶為引起酶促褐變主要的酶，通過抑制引起褐變的酶的活性從而減少酶促褐變途徑，減少褐變的產(chǎn)生，亞硫酸氫鈣可通過抑制多酚氧化酶的活性，對(duì)組培過程中出現(xiàn)的褐變問題起到很好的緩解效果，丙環(huán)唑有效解決了菌絲感染導(dǎo)致外植體愈傷組織誘導(dǎo)不成功的問題。

2.MS培養(yǎng)基提供了外植體在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中維持生長(zhǎng)所需基本的生長(zhǎng)因子，而母液I的添加對(duì)愈傷組織的形成有高效促進(jìn)作用和提高愈傷組織的作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基100份、母液I20份和純凈水10份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣1mg/L、異戊烯氨基嘌呤2mg/L、4-碘苯氧乙酸2mg/L、水溶性氮酮1mg/L和丙環(huán)唑1mg/L。

母液I的配制方法如下：

稱取亞硫酸氫鈣1mg、異戊烯氨基嘌呤2mg、4-碘苯氧乙酸2mg、水溶性氮酮1mg和丙環(huán)唑1mg；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢柚羴喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

培養(yǎng)基的配制方法如下：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.5，此為體系3；

(3)取體系3，將體系3以180KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌20min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例2

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基115份、母液I25份和純凈水15份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣3mg/L、異戊烯氨基嘌呤4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L、水溶性氮酮2.5mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L。

母液I的配制方法如下：

稱取亞硫酸氫鈣3mg、異戊烯氨基嘌呤4mg、4-碘苯氧乙酸4mg、水溶性氮酮2.5mg和丙環(huán)唑2.5mg；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢柚羴喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

培養(yǎng)基的配制方法如下：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為為6.0，此為體系3；

(3)取體系3，將體系3以190KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌25min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例3

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基130份、母液I30份和純凈水20份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣5mg/L、異戊烯氨基嘌呤6mg/L、4-碘苯氧乙酸6mg/L、水溶性氮酮4mg/L和丙環(huán)唑4mg/L。

母液I的配制方法如下：

稱取亞硫酸氫鈣5mg、異戊烯氨基嘌呤6mg、4-碘苯氧乙酸6mg、水溶性氮酮4mg和丙環(huán)唑4mg；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢柚羴喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

培養(yǎng)基的配制方法如下：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為6.5，此為體系3；

(3)取體系3，將體系3以200KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌30min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例4

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基110份、母液I22份和純凈水12份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣2mg/L、異戊烯氨基嘌呤3mg/L、4-碘苯氧乙酸3mg/L、水溶性氮酮2mg/L和丙環(huán)唑2mg/L。

母液I的配制方法如下：

稱取亞硫酸氫鈣2mg、異戊烯氨基嘌呤3mg、4-碘苯氧乙酸3mg、水溶性氮酮2mg和丙環(huán)唑2mg；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢柚羴喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

培養(yǎng)基的配制方法如下：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.7，此為體系3；

(3)取體系3，將體系3以185KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌22min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例5

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

一種梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基120份、母液I28份和純凈水18份；所述母液I中包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸氫鈣4mg/L、異戊烯氨基嘌呤5mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L、水溶性氮酮3mg/L和丙環(huán)唑3mg/L。

母液I的配制方法如下：

稱取亞硫酸氫鈣4mg、異戊烯氨基嘌呤5mg、4-碘苯氧乙酸5mg、水溶性氮酮3mg和丙環(huán)唑3mg；接著，將亞硫酸氫鈣、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢柚羴喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。

培養(yǎng)基的配制方法如下：

(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢琛⒒旌暇鶆?，此為體系1；

(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為6.3，此為體系3；

(3)取體系3，將體系3以195KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌28min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)施例6

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：異戊烯氨基嘌呤4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L、水溶性氮酮2.5mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L，其余與實(shí)施例2相同。

實(shí)施例7

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸氫鈣3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L、水溶性氮酮2.5mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L，其余與實(shí)施例2相同。

實(shí)施例8

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸氫鈣3mg/L、異戊烯氨基嘌呤4mg/L、水溶性氮酮2.5mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L，其余與實(shí)施例2相同。

實(shí)例例9

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸氫鈣3mg/L、異戊烯氨基嘌呤4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和丙環(huán)唑2.5mg/L，其余與實(shí)施例2相同。

實(shí)施例10

本發(fā)明提供的梅花愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其配制方法如下：

其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸氫鈣3mg/L、異戊烯氨基嘌呤4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和水溶性氮酮2.5mg/L，其余與實(shí)施例2相同。

試驗(yàn)例:

取幼嫩的梅花葉片，去掉葉柄，用手術(shù)刀切割成小片，用刀片沿主脈劃3刀，保證葉緣處相連，目的在于使葉片產(chǎn)生更多的傷口，再用鑷子將其接種到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個(gè)瓶接種3片，每組接種30瓶，共接種10組，以上操作在超凈臺(tái)上完成，封好口后置于相同的環(huán)境中經(jīng)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)條件為：(25±1)℃，暗培養(yǎng)。記錄愈傷組織形成時(shí)間、愈傷組織的顏色、顆粒散碎度，統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率和褐變率，結(jié)果如下表：

由上表可知，由于實(shí)施例1-5使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其誘導(dǎo)時(shí)間明顯比其他試驗(yàn)組短，誘導(dǎo)率比其他試驗(yàn)組高，褐變率低，顆粒散碎度及顏色都明顯優(yōu)于其他試驗(yàn)組。

實(shí)施例6-11為對(duì)比例，其中：

實(shí)施例6中母液I的成分中不添加亞硫酸氫鈣；

實(shí)施例7中母液I的成分中不添加異戊烯氨基嘌呤；

實(shí)施例8中母液I的成分中不添加4-碘苯氧乙酸；

實(shí)施例9中母液I的成分中不添水溶性氮酮；

實(shí)施例10中母液I的成分成分中不添加丙環(huán)唑。

通過對(duì)比實(shí)施例6與實(shí)施例2的數(shù)據(jù)，可證實(shí)亞硫酸氫鈣的添加可大大減少褐變的產(chǎn)生；通過對(duì)比實(shí)施例7、實(shí)施例8和實(shí)施例2的數(shù)據(jù)，可證實(shí)異戊烯氨基嘌呤和4-碘苯氧乙酸混合使用有加快愈傷組織形成的功效；通過對(duì)比實(shí)施例9和實(shí)施例2的數(shù)據(jù)，可證實(shí)水溶性氮酮可加速異戊烯氨基嘌呤和4-碘苯氧乙酸功效的發(fā)揮；通過對(duì)比實(shí)施例10和實(shí)施例2的數(shù)據(jù)，可證實(shí)丙環(huán)唑有效解決了菌絲感染從而提高外植體愈傷組織誘導(dǎo)率。

上述說明是針對(duì)本發(fā)明較佳可行實(shí)施例的詳細(xì)說明，但實(shí)施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請(qǐng)范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。